In a typical Western blot, the samp

In a typical Western blot, the sample buffer contains Tris-HCl and the running buffer contains glycine. When you have loaded your samples and applied a current, your proteins, the chloride ions, and the glycine start to flow throw the gel. Glycine is a zwitterion in the stacking portion of the gel (~pH 7). The chloride ions take the lead and the glycine in the running buffer takes up the rear: your protein sample gets trapped in between them in a “moving boundary.” Once the pH 9 resolving gel is reached, glycine passes the protein sample because it ionizes and migrates faster. With the boundary gone, the protein can migrate by length/charge.

I’m no good at pchem so this explanation may be bunk, but I picture the negatively-charged (SDS-coated) protein being repulsed by the chloride ahead of it and the zwitterionic glycine behind it. Crummy explanations aside, the moving boundary is the reason why your proteins don’t separate by size in the stacking gel. In the resolving gel, glycine ions from the running buffer continue to pass the sample throughout the run, but no longer form a front that pushes the protein along.

I assume glycine does the same thing in the transfer buffer: push the protein forward onto the membrane through (assuming again) repulsive force. This explanation isn’t very satisfying though because the pH under transfer conditions is similar to that in the resolving gel itself – wouldn’t glycine ions just whiz by like in the stacking gel? Maybe it is just used along with Tris for buffering.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในทั่วไปเวสเทิร์นคืนในตา บัฟเฟอร์อย่างประกอบด้วยทริสเรทติ้ง HCl และ glycine ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ที่ใช้ เมื่อคุณโหลดตัวอย่างของคุณ และใช้กระแส โปรตีนของคุณ ประจุคลอไรด์ และ glycine เริ่มไหลโยนเจ Glycine เป็น zwitterion ในส่วนของเจซ้อน (~ pH 7) ประจุคลอไรด์นำ และ glycine ในบัฟเฟอร์ใช้หยิบด้านหลัง: ตัวอย่างของโปรตีนได้รับติดอยู่ระหว่างพวกเขาในการ "ย้ายขอบเขต" เมื่อถึงค่า pH 9 resolving เจ glycine ผ่านตัวอย่างโปรตีนเนื่องจาก ionizes และย้ายได้เร็วขึ้น มีขอบเขตที่หายไป โปรตีนสามารถย้าย โดยความยาว/ค่าธรรมเนียมฉันไม่ดี pchem คำอธิบายนี้อาจเฟ แต่ฉันภาพคิดในเชิงลบ (เคลือบ SDS) โปรตีนถูก repulsed โดยคลอไรด์ก่อนและ glycine zwitterionic ด้านหลัง Crummy คำอธิบายกัน ขอบเขตการเคลื่อนไหวเป็นเหตุผลที่ทำไมไม่แยกของโปรตีนตามขนาดในเจซ้อน ในเจ resolving, glycine ประจุจากบัฟเฟอร์ใช้ต่อผ่านตัวอย่างตลอดการรัน แต่ไม่เป็นหน้าที่ผลักดันโปรตีนตามผมถือว่า glycine ไม่เหมือนในบัฟเฟอร์โอน: โปรตีนไปข้างหน้าบนเยื่อผ่าน (สมมติอีก) ผลักดันแรง repulsive คำอธิบายนี้ไม่มากแต่ เนื่องจาก pH ภายใต้เงื่อนไขการโอนย้ายจะคล้ายคลึงกับในเจ resolving เอง – ไม่ glycine ประจุเพียง whiz โดยชอบในเจซ้อน บางทีเพียงแค่ใช้กับทริสเรทติ้งสำหรับบัฟเฟอร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในดวงตะวันทั่วไปบัฟเฟอร์ตัวอย่างมี Tris-HCl และบัฟเฟอร์ทำงานมีไกลซีน เมื่อคุณได้โหลดตัวอย่างของคุณและนำไปใช้ในปัจจุบันโปรตีนของคลอไรด์ไอออนและไกลซีนเริ่มต้นที่จะไหลโยนเจล Glycine เป็น zwitterion ในส่วนที่ซ้อนของเจล (~ ค่า pH 7) คลอไรด์ไอออนนำและไกลซีนในบัฟเฟอร์ทำงานจะขึ้นหลัง ". ย้ายเขตแดน" ตัวอย่างโปรตีนของคุณได้รับการติดอยู่ในระหว่างพวกเขาในเมื่อค่า pH 9 การแก้ไขเจลถึงไกลซีนผ่านตัวอย่างโปรตีนเพราะมันจะแตกตัว และย้ายได้เร็วขึ้น ด้วยขอบเขตไปโปรตีนสามารถโยกย้ายโดยความยาว / ค่าใช้จ่าย. ฉันไม่ดีที่ pchem เพื่อให้คำอธิบายนี้อาจจะเป็นสองชั้น แต่ฉันภาพประจุลบ (SDS เคลือบ) โปรตีนถูกผลักโดยคลอไรด์ข้างหน้าของมันและ ไกลซีน zwitterionic ที่อยู่เบื้องหลังมัน คำอธิบาย Crummy กันขอบเขตการเคลื่อนไหวคือเหตุผลว่าทำไมโปรตีนของคุณไม่ได้แยกตามขนาดในเจลซ้อน ในการแก้ไขเจลไอออนไกลซีนจากบัฟเฟอร์การทำงานอย่างต่อเนื่องที่จะผ่านตัวอย่างตลอดไป แต่อีกไม่นานในรูปแบบด้านหน้าที่ผลักดันโปรตีนพร้อม. ผมถือว่าไกลซีนจะเป็นสิ่งเดียวกันในบัฟเฟอร์โอน: ผลักดันโปรตีนไปข้างหน้าบน เมมเบรนผ่าน (สมมติว่าอีกครั้ง) แรงน่ารังเกียจ คำอธิบายนี้ไม่ได้เป็นที่น่าพอใจมาก แต่เพราะค่า pH ภายใต้เงื่อนไขการโอนจะคล้ายกับว่าในการแก้ปัญหาตัวเองเจล - ไอออนจะไม่ไกลซีนเพียงหวือโดยเหมือนในเจลซ้อน? บางทีมันอาจจะถูกนำมาใช้เพียงพร้อมกับทริสสำหรับบัฟเฟอร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในทั่วไป Western blot , ตัวอย่างบัฟเฟอร์มี HCl ทริสและวิ่งบัฟเฟอร์มีไกลโคเจน เมื่อคุณโหลดตัวอย่างของคุณ และใช้ ปัจจุบันของคุณ โปรตีน คลอไรด์ไอออน และยังเริ่มที่จะไหลโยนเจล ไกลซีนเป็นไอออนซึ่งมีประจุบวกและลบในราคาถูก ส่วนของเจล ( ~ pH 7 ) คลอไรด์ไอออน เป็นผู้นำ และไกลซีนในบัฟเฟอร์จะขึ้นหลังวิ่งตัวอย่างโปรตีนของคุณจะติดอยู่ระหว่างพวกเขาใน " ขอบเขตเคลื่อนที่ " เมื่อพีเอช 9 และเจลแล้วยังผ่านโปรตีนตัวอย่างเพราะมัน ionizes และย้ายได้เร็วขึ้น กับเขตแดนไปแล้ว โปรตีนสามารถโยกย้ายตามความยาว / ค่า

หนูไม่เก่ง pchem ดังนั้นคำอธิบายนี้อาจจะสบายแต่ภาพซึ่งมีประจุลบ ( SDS เคลือบ ) โปรตีนถูก repulsed โดยคลอไรด์ก่อนและ zwitterionic ไกลซีนที่อยู่เบื้องหลังมัน คำอธิบายเล็กๆไว้ก่อน ย้ายเขตแดนเป็นเหตุผลว่าทำไมโปรตีนของคุณไม่แยกตามขนาด ในราคาถูก เจล ในการแก้ไขปัญหา เจลไอออนจากบัฟเฟอร์ที่มีวิ่งต่อไปผ่านตัวอย่างตลอดวิ่งแต่ไม่มีรูปด้านหน้าดันโปรตีนด้วย

ผมถือว่ายังไม่สิ่งเดียวกันในการบัฟเฟอร์ : ดันไปข้างหน้าบนโปรตีนเมมเบรนผ่าน ( ทะลึ่งอีกแล้ว ) แรงผลัก .นี้อธิบายไม่ค่อยพอใจเพราะ pH ภายใต้เงื่อนไขการโอน คล้ายกับว่าในการแก้ปัญหาเจลเอง–ไม่ไกลซีนไอออนแค่หวือโดยชอบในการวางซ้อนเจล ? บางทีมันอาจเป็นเพียงใช้สำหรับบัฟเฟอร์ร่วมกับบริษัท .