retinal pigment epithelial marker g

retinal pigment epithelial marker genes (Mitf, Z0-1) is confirmed by a ceil staining method. 35 In this way, เรเร are produced from human iPS cells.


Example 8: Production Example of retinal pigment epithelial cell sheet using induced พีพี (iPS cells) s Human iPS cell line 201B7 (available from RIKEN BioResource center or iPS Academia Japan Inc.) is cultivated according to the methods described in "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" and "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686". As the อาหาร, a อาหาร obtained by adding 10 20% KSR (Knockout™ สิ่งทดแทนซีรัม; Invitrogen), 0.1 rnM 2- เมอร์แคปโตเอธานอล, 2 mM L-glutamine, lx non-essential amino acid, 5 ng/ml bFGF to DMEM/F12 อาหาร (Sigma) is used. The cultured iPS cells are dispersed into single cells using TrypLE Express (Invitrogen), suspended in 100 µl of a อาหารที่ปราศจากซีรัม at 15 1.2x104 cells per one well of a non-cell adhesive 96 well culture plate (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) to allow for rapid formation of กลุ่มก้อนs and subjected to การเพาะเลี้ยงแบบลอย at 37°C, 5% C02• As the อาหารที่ปราศจากซีรัม therefor, a อาหารที่ปราศจากซีรัม obtained by adding 10% KSR, 450 20 µM 1-monothioglycerol, lx Chemically defined ไลปิด concentrate, 20 µM Y27632 to a 1:1 mixture of F-12 อาหาร and IMDM อาหาร is used. At day 3 from the start of the floating culture, BMP4 is added at a final concentration of 1.5 nM and การเพาะเลี้ยงแบบลอย is continued. A half amount of the culture อาหาร in the well 2s is exchanged every 3 days with the above-mentioned อาหาร not supplemented with a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ. At day 18 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, the กลุ่มก้อนs are transferred to a อาหารที่ปราศจากซีรัม, which is DMEM/F-12 อาหาร containing 3 µM CHIR99021 and added 30 with lx N2 supplement, and cultured until day 21 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย. At day 21 from the start .of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, the กลุ่มก้อนs are dispersed in cell dispersion solution Accutase (ICT), and debris was removed using a 40 µm cell strainer. The resulting cells are suspended 35 in a อาหารที่ปราศจากซีรัม (200 µl), which is a 1:1 mixture of DMEM/F-12 อาหาร and Neurobasal อาหาร added with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 µM Y27632, and seeded in a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning Incorporated) after a coating treatment with Synthemax™ at 2x105 cells per well, a s อาหาร (1 ml) having the same composition is also added to a lower well, and การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ is performed at 37°C, 5% C02. At day 24 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, namely, at day 3 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ, any of 3 µM CHIR99021, 10 µM SU-5402, 1 nM recombinant hwnan BMP4 protein 10 and 50 ng/ml recombinant human แอคทิวิน, or these in combination may be added. The อาหาร is exchanged every 3 days, and the level of epithelial formation is observed under a microscope at day 40 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย. In this way, retinal pigment epithelial cell sheet is 15 produced from human iPS cells. [0080) This application is based on a patent application No. 2013-232795 filed in Japan (filing date: November 11, 2013), the contents of which are incorporated in full herein. 20 Industrial Applicability [0081] According to the production method of the การประดิษฐ์นี้, retinal pigment epithelial cell or retinal pigment epithelial cell sheet can be produced with high efficiency. 25 ข้อถือสิทธิ 1. A method for producing a retinal pigment epithelial cell, ซึ่งประกอบรวมด้วย s (1) a first step of subjecting พีพี to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม เพื่อก่อตัวเป็น an กลุ่มก้อน of พีพี, (2) a second step of subjecting the กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้น in step (1) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum- 10 containing อาหาร each being free of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the โซนิคเฮดจ์ฮอค วิถีการส่งสัญญาณ and containing a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ, thereby obtaining an กลุ่มก้อน containing โปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาทตา, and 1s (3) a third step of subjecting the กลุ่มก้อน obtained in step (2) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum• containing อาหาร each being free of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the โซนิคเฮดจ์ฮอค วิถีการส่งสัญญาณ and a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ and containing a 20 substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the วิถีสัญญาณ Wnt, thereby obtaining an กลุ่มก้อน containing retinal pigment epithelial cell. 2. A method for producing a retinal pigment epithelial cell sheet, ซึ่งประกอบรวมด้วย 2s (1) a first step of subjecting พีพีs to floating culture in a serum-free อาหาร เพื่อก่อตัวเป็น an กลุ่มก้อน of พีพี, (2) a second step of subjecting the กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้น in step (1) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum- thereby obtaining an aggregate containing retinal progenitor 35 cells,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยีนเครื่องหมายที่เยื่อบุผิวเม็ดสีที่จอประสาทตา (Mitf, Z0-1) ได้รับการยืนยัน โดย ceil เป็นวิธีการย้อมสี 35 ในวิธีนี้ เรเรที่ผลิตจากเซลล์มนุษย์ iPS Example 8: Production Example of retinal pigment epithelial cell sheet using induced พีพี (iPS cells) s Human iPS cell line 201B7 (available from RIKEN BioResource center or iPS Academia Japan Inc.) is cultivated according to the methods described in "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" and "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686". As the อาหาร, a อาหาร obtained by adding 10 20% KSR (Knockout™ สิ่งทดแทนซีรัม; Invitrogen), 0.1 rnM 2- เมอร์แคปโตเอธานอล, 2 mM L-glutamine, lx non-essential amino acid, 5 ng/ml bFGF to DMEM/F12 อาหาร (Sigma) is used. The cultured iPS cells are dispersed into single cells using TrypLE Express (Invitrogen), suspended in 100 µl of a อาหารที่ปราศจากซีรัม at 15 1.2x104 cells per one well of a non-cell adhesive 96 well culture plate (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) to allow for rapid formation of กลุ่มก้อนs and subjected to การเพาะเลี้ยงแบบลอย at 37°C, 5% C02• As the อาหารที่ปราศจากซีรัม therefor, a อาหารที่ปราศจากซีรัม obtained by adding 10% KSR, 450 20 µM 1-monothioglycerol, lx Chemically defined ไลปิด concentrate, 20 µM Y27632 to a 1:1 mixture of F-12 อาหาร and IMDM อาหาร is used. At day 3 from the start of the floating culture, BMP4 is added at a final concentration of 1.5 nM and การเพาะเลี้ยงแบบลอย is continued. A half amount of the culture อาหาร in the well 2s is exchanged every 3 days with the above-mentioned อาหาร not supplemented with a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ. At day 18 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, the กลุ่มก้อนs are transferred to a อาหารที่ปราศจากซีรัม, which is DMEM/F-12 อาหาร containing 3 µM CHIR99021 and added 30 with lx N2 supplement, and cultured until day 21 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย. At day 21 from the start .of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, the กลุ่มก้อนs are dispersed in cell dispersion solution Accutase (ICT), and debris was removed using a 40 µm cell strainer. The resulting cells are suspended 35 in a อาหารที่ปราศจากซีรัม (200 µl), which is a 1:1 mixture of DMEM/F-12 อาหาร and Neurobasal อาหาร added with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 µM Y27632, and seeded in a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning Incorporated) after a coating treatment with Synthemax™ at 2x105 cells per well, a s อาหาร (1 ml) having the same composition is also added to a lower well, and การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ is performed at 37°C, 5% C02. At day 24 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, namely, at day 3 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ, any of 3 µM CHIR99021, 10 µM SU-5402, 1 nM recombinant hwnan BMP4 protein 10 and 50 ng/ml recombinant human แอคทิวิน, or these in combination may be added. The อาหาร is exchanged every 3 days, and the level of epithelial formation is observed under a microscope at day 40 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย. In this way, retinal pigment epithelial cell sheet is 15 produced from human iPS cells. [0080) This application is based on a patent application No. 2013-232795 filed in Japan (filing date: November 11, 2013), the contents of which are incorporated in full herein. 20 Industrial Applicability [0081] According to the production method of the การประดิษฐ์นี้, retinal pigment epithelial cell or retinal pigment epithelial cell sheet can be produced with high efficiency. 25 ข้อถือสิทธิ 1. A method for producing a retinal pigment epithelial cell, ซึ่งประกอบรวมด้วย s (1) a first step of subjecting พีพี to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม เพื่อก่อตัวเป็น an กลุ่มก้อน of พีพี, (2) a second step of subjecting the กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้น in step (1) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum- 10 containing อาหาร each being free of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the โซนิคเฮดจ์ฮอค วิถีการส่งสัญญาณ and containing a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ, thereby obtaining an กลุ่มก้อน containing โปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาทตา, and 1s (3) a third step of subjecting the กลุ่มก้อน obtained in step (2) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum• containing อาหาร each being free of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the โซนิคเฮดจ์ฮอค วิถีการส่งสัญญาณ and a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ and containing a 20 substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the วิถีสัญญาณ Wnt, thereby obtaining an กลุ่มก้อน containing retinal pigment epithelial cell. 2. A method for producing a retinal pigment epithelial cell sheet, ซึ่งประกอบรวมด้วย 2s (1) a first step of subjecting พีพีs to floating culture in a serum-free อาหาร เพื่อก่อตัวเป็น an กลุ่มก้อน of พีพี, (2) a second step of subjecting the กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้น in step (1) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum- thereby obtaining an aggregate containing retinal progenitor 35 cells,

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ม่านตาสีเยื่อบุผิวยีนเครื่องหมาย (MITF, Z0-1) ได้รับการยืนยันโดยวิธีการย้อมสี ceil 35 วิธีนี้เรเรมีการผลิตจากเซลล์ iPS มนุษย์. ตัวอย่างที่ 8: การผลิตตัวอย่างของเม็ดสีแผ่นเซลล์เยื่อบุผิวจอประสาทตาโดยใช้การเหนี่ยวนำพีพี (เซลล์ IPS) s เซลล์เส้นมนุษย์ iPS 201B7 (ข้อมูลจากศูนย์ RIKEN Bioresource หรือ iPS Academia ญี่ปุ่น Inc .) มีการปลูกตามวิธีการที่อธิบายไว้ใน "อุเอโนะ, M. et al. PNAS 2006 103 (25), 9554-9559" และ "วาตานาเบะเค et al. ชัยนาทไบโอเทค 2007, 25, 681-686" ในฐานะที่เป็นอาหารที่เป็นอาหารได้โดยการเพิ่ม 10 20% KSR (Knockout ™สิ่งทดแทนซีรัม; Invitrogen) 0.1 rnM 2- เมอร์แคปโตเอธา นอล 2 mm L-glutamine, LX ที่ไม่จำเป็น กรดอะมิโน 5 ng / ml bFGF เพื่อ DMEM / F12 อาหาร (ซิกม่า) ถูกนำมาใช้ เซลล์ iPS เพาะเลี้ยงจะแยกย้ายกันไปเข้าสู่เซลล์เดียวโดยใช้ TrypLE เอ็กซ์เพรส (Invitrogen) ระงับใน 100 ไมโครลิตรของอาหารที่ปราศจากซีรัมที่ 15 1.2x104 เซลล์ต่อหนึ่งเดียวที่ไม่ใช่เซลล์กาวแผ่นวัฒนธรรม 96 ดี (แผ่น Sumilon ลูกกลม, SUMITOMO BAKELITE จำกัด ) เพื่อให้การก่อตัวอย่างรวดเร็วของกลุ่มก้อนและอยู่ภายใต้การเพาะเลี้ยงแบบลอยที่ 37 ° C, 5% C02 •ในฐานะที่เป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมดังนั้นเป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมที่ได้รับ โดยการเพิ่ม 10% KSR 450 20 ไมครอน 1 monothioglycerol, LX กำหนดเคมีไลปิดสมาธิ 20 ไมครอน Y27632 ไป 1: 1 ส่วนผสมของ F-12 อาหารและ IMDM อาหารถูกนำมาใช้ ในวันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของวัฒนธรรมลอย BMP4 จะเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 1.5 นาโนเมตรและการเพาะเลี้ยงแบบลอยเป็นอย่างต่อเนื่อง จำนวนครึ่งหนึ่งของวัฒนธรรมอาหารใน 2s ดีมีการแลกเปลี่ยนทุก 3 วันกับการดังกล่าวข้างต้นไม่ได้อาหารเสริมด้วยสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณ ในวันที่ 18 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอยที่กลุ่มก้อน s จะถูกโอนไปยังอาหารที่ปราศจากซีรัมซึ่งเป็น DMEM / F-12 อาหารที่มี 3 ไมครอน CHIR99021 และเพิ่ม 30 พร้อมด้วยอาหารเสริม N2 LX และเพาะเลี้ยง จนกว่าจะถึงวันที่ 21 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย ในวันที่ 21 จากจุดเริ่มต้นที่ .of การเพาะเลี้ยงแบบลอยที่กลุ่มก้อน s จะแยกย้ายกันไปในการแก้ปัญหาการกระจายตัวของเซลล์ Accutase (ICT) และเศษถูกลบออกโดยใช้เครื่องกรอง 40 ไมครอนเซลล์ ส่งผลให้เซลล์ถูกระงับ 35 ในอาหารที่ปราศจากซีรัม (200 ไมโครลิตร) ซึ่งเป็น 1: 1 ผสม DMEM / F-12 อาหารและ Neurobasal อาหารเพิ่ม 10% KSR 1/2 เสริม N2 1/2 อาหารเสริม B27, 20 ไมครอน Y27632 และเมล็ดใน 65 มม Boyden Chamber (Transwell, Corning Incorporated) หลังการรักษาเคลือบด้วย Synthemax ™ที่ 2x105 เซลล์ต่อดีเป็นอาหาร (1 ml) มีองค์ประกอบเดียวกันถูกเพิ่มไปยังที่ต่ำกว่า ดีและการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะจะดำเนินการที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% C02 ในวันที่ 24 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอยคือในวันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะใด ๆ ของ 3 ไมครอน CHIR99021 10 ไมครอน SU-5402 1 นาโนเมตร recombinant hwnan BMP4 โปรตีน 10 และ 50 ng / ml recombinant มนุษย์แอคทิวินหรือเหล่านี้ในการรวมกันอาจจะเพิ่ม อาหารมีการแลกเปลี่ยนทุก 3 วันและระดับของการสร้างเยื่อบุผิวเป็นที่สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ในวันที่ 40 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย ด้วยวิธีนี้เม็ดสีที่จอประสาทตาแผ่นเซลล์เยื่อบุผิวคือ 15 ที่ผลิตจากเซลล์ iPS มนุษย์ วัน [0080) โปรแกรมนี้จะขึ้นอยู่กับการประยุกต์ใช้สิทธิบัตรเลขที่ 2013-232795 ยื่นในประเทศญี่ปุ่น (ยื่น: 11 พฤศจิกายน 2013) เนื้อหาที่จะจัดตั้งในที่นี้เต็มรูปแบบ 20 อุตสาหกรรมการบังคับใช้ [0081] ตามวิธีการผลิตของการประดิษฐ์นี้เซลล์เยื่อบุผิวสีม่านตาหรือแผ่นเซลล์เยื่อบุผิวสีม่านตาสามารถผลิตที่มีประสิทธิภาพสูง 25 ข้อถือสิทธิ 1. วิธีการในการผลิตเซลล์เม็ดสีที่จอประสาทตาเยื่อบุผิว A, ซึ่งประกอบรวมด้วย s (1) ขั้นตอนแรกของหนอนบ่อนไส้พีพีเพื่อการเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมเพื่อก่อตัว เป็น กลุ่ม ก้อนของพีพี (2) ขั้นตอนที่สองของหนอนบ่อนไส้กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้นในขั้นตอนที่ (1) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือ serum- 10 มีอาหารแต่ละเป็นอิสระของสาร ที่ออกฤทธิ์ต่อโซนิคเฮดจ์ฮอควิถี การส่งสัญญาณ และมีสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณดังนั้นการได้รับกลุ่มก้อนที่มีโปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาท ตา และ 1s (3) ขั้นตอนที่สามของหนอนบ่อนไส้กลุ่มก้อนได้ในขั้นตอนที่ (2) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่ม•มีอาหารแต่ละเป็นอิสระของสารที่ออกฤทธิ์ต่อโซนิคเฮดจ์ฮอควิถี การส่งสัญญาณและสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณและมีสารที่ 20 ที่ออกฤทธิ์ต่อวิถีสัญญาณ Wnt ดังนั้นการได้รับกลุ่มก้อนที่มีเซลล์เยื่อบุผิวเม็ดสีที่จอประสาทตา 2. วิธีการในการผลิตแผ่นเซลล์เยื่อบุผิวสีม่านตาซึ่งประกอบรวมด้วย 2s (1) ขั้นตอนแรกของหนอนบ่อนไส้พีพีเพื่อวัฒนธรรมที่ลอยอยู่ในซีรั่มฟรีอาหารเพื่อก่อตัวเป็นกลุ่มก้อนของพีพี ( 2) ขั้นตอนที่สองของหนอนบ่อนไส้กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้นในขั้นตอนที่ (1) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือ serum- จึงได้รับการรวมที่มีรากเหง้าม่านตา 35 เซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ม่านตาสีบุยีนเครื่องหมาย ( mitf z0-1 , ) ได้รับการยืนยันโดยซีลี่วิธี 35 วิธีนี้เรเรผลิตจากเซลล์ IPS ของมนุษย์ตัวอย่างที่ 8 : ตัวอย่างการผลิตเม็ดสีม่านตาเซลล์เยื่อบุผิวแผ่นพีพี ( IPS ) เซลล์ ) เซลล์มนุษย์ 201b7 IPS ( ใช้ได้จากทรัพยากรชีวภาพ ศูนย์ไรเคน ( ญี่ปุ่น ) หรือ IPS ) คือการปลูกตามวิธีการที่อธิบายไว้ใน " อุเอโนะ , M . et al . พีเอ็นเอ 2006 , 103 ( 25 ) , 9554-9559 " และ " วาตานาเบะ . et al . แนทเทคโนโลยีชีวภาพ 2007 , 25 , 681-686 " เป็นอาหาร , อาหารได้โดยการเพิ่ม 10 20% KSR ( Knockout ™สิ่งทดแทนซีรัม ; Invitrogen ) , 0.1 ร.น. ม. 2 - เมอร์แคปโตเอธานอล 2 มม. , Glutamine , LX ที่ไม่ใช่กรดอะมิโน 5 ng / ml bfgf เพื่อ dmem / F12 อาหาร ( Sigma ) ใช้ เซลล์ IPS จะแพร่กระจายเข้าสู่เซลล์เพาะเลี้ยงเดี่ยวใช้ tryple ด่วน ( Invitrogen ) ที่แขวนลอยใน 100 µ L ของอาหารที่ปราศจากซีรัม 15 1.2x104 เซลล์ต่อเซลล์ดีไม่ใช่กาว 96 ดีวัฒนธรรมจาน ( สิ่งรูปกลมรีจาน , SUMITOMO Bakelite Co . , Ltd . ) เพื่ออนุญาตให้มีการพัฒนาอย่างรวดเร็วของกลุ่มก้อนและภายใต้การเพาะเลี้ยงแบบลอยที่ 37 ° C , 5% C02 - เป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมดังนั้น , อาหารที่ปราศจากซีรัมได้โดยการเพิ่ม 10% KSR , 450 20 µ M 1-monothioglycerol , LX เคมีนิยามไลปิดเข้มข้น 20 µ M y27632 ไปผสม 1 : 1 โอ F f-12 อาหาร imdm อาหารและใช้ ในวันที่ 3 จากเริ่มลอยของวัฒนธรรม bmp4 เพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 1.5 nm และการเพาะเลี้ยงแบบลอยเป็นอย่างต่อเนื่อง ครึ่งจำนวนของวัฒนธรรมอาหารในดี 2s กันทุก 3 วัน กับอาหารดังกล่าวข้างต้นไม่เสริมด้วยสารที่ออกฤทธิ์ต่อการ BMP วิถีการส่งสัญญาณ . ในวันที่ 18 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย , กลุ่มก้อนจะย้ายไปอาหารที่ปราศจากซีรัมซึ่งเป็น dmem / f-12 อาหารที่มี 3 chir99021 M µและเพิ่ม 30 กับ LX 2 เสริม และเลี้ยงถึง 21 วัน ตั้งแต่เริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย . ในวันที่ 21 ตั้งแต่เริ่มต้น ของการเพาะเลี้ยงแบบลอย , กลุ่มก้อนจะกระจายในเซลล์ accutase โซลูชันกระจาย ( ICT ) และ debris ถูกลบโดยใช้เซลล์ M 40 µเครื่องร่อน . ส่งผลให้เซลล์แขวนลอย 35 ในอาหารที่ปราศจากซีรัม ( 200 µ L ) ซึ่งเป็นส่วนผสมของ dmem 1 / f-12 และอาหาร neurobasal อาหารเพิ่ม 10% KSR , 1 / 2 , 2 1 / 2 b27 อาหารเสริม , อาหารเสริม , 20 µ M y27632 และเมล็ดใน 65 มิลลิเมตร บอยเดน ( ห้อง transwell Corning Incorporated , ) หลังจากการเคลือบผิวด้วย synthemax ™ที่ 2x105 เซลล์ต่อก็เป็นอาหาร ( 1 มล. ) มีองค์ประกอบเดียวกันยังเพิ่มดีกว่า และการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ 37 ° C แสดงที่ 5% C02 . ในวันที่ 24 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย คือในวันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ , 3 chir99021 M µ 10 µ M su-5402 1 nm รีคอมบิแนนท์โปรตีน hwnan bmp4 10 และ 50 นาโนกรัม / มิลลิลิตรแอคทิวินมนุษย์ recombinant หรือเหล่านี้ในการรวมกันอาจจะเพิ่ม การอาหารกันทุก 3 วัน และระดับของการเกิดเยื่อบุผิวที่ถูกพบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ที่ 40 จากวันเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย . ในวิธีนี้ , ม่านตาสีเซลล์เยื่อบุผิวแผ่นที่ 15 ที่ผลิตจากเซลล์ IPS ของมนุษย์ [ 0080 ) โปรแกรมนี้จะขึ้นอยู่กับการประยุกต์ใช้สิทธิบัตรเลขที่ 2013-232795 ยื่นในญี่ปุ่น ( ยื่น วันที่ : 11 พฤศจิกายน 2013 ) ซึ่งจะรวมอยู่ในเนื้อหาของเต็มในที่นี้ 20 การใช้ [ อุตสาหกรรม 0081 ] ไปตามวิธีการผลิตของการประดิษฐ์นี้สีม่านตาหรือเรติ , เซลล์เยื่อบุผิวเม็ดเซลล์เยื่อบุผิวแผ่นสามารถผลิตที่มีประสิทธิภาพสูง 25 ข้อถือสิทธิ 1 วิธีการสำหรับผลิตเม็ดสีจอประสาทตา เซลล์เยื่อบุผิว , ซึ่งประกอบรวมด้วย S ( 1 ) ขั้นตอนแรกของการลงโทษพีพีการเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมเพื่อก่อตัวเป็นเป็นกลุ่มก้อนของพีพี ( 2 ) ขั้นตอนที่สองของการลงโทษที่กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้นในขั้นตอนที่ ( 1 ) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอา