The hydrolysis of the fluorogenic peptides Z-FR-MCA, Z-LRMCA
and Z-RR-MCA (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) by purified S.
levis peptidase was continuously monitored in a Hitachi F-2500
spectrofluorimeter by measuring fluorescence at lex = 380 nm and
lem = 460 nm. Approximately 20 mM of purified enzyme were
added to 0.1 M sodium acetate, pH 5.5, containing 2.5 mM DTT
(1.0 ml final volume) and incubated for 3 min at 37 8C. The
substrates were then added at different concentrations and thecatalytic activity was monitored. The apparent second-order rate
constant Kcat/Km was determined under pseudo first-order conditions,
in which [S]Km. Determinations were performed with
different substrate concentrations and calculated using nonlinear
regression data analysis with the aid of the GraFit program
(Leatherbarrow, 2001). The molar concentration of the S. levis
cysteine proteinase was determined by active site titration with E-
64 inhibitor (
The hydrolysis of the fluorogenic peptides Z-FR-MCA, Z-LRMCAand Z-RR-MCA (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) by purified S.levis peptidase was continuously monitored in a Hitachi F-2500spectrofluorimeter by measuring fluorescence at lex = 380 nm andlem = 460 nm. Approximately 20 mM of purified enzyme wereadded to 0.1 M sodium acetate, pH 5.5, containing 2.5 mM DTT(1.0 ml final volume) and incubated for 3 min at 37 8C. Thesubstrates were then added at different concentrations and thecatalytic activity was monitored. The apparent second-order rateconstant Kcat/Km was determined under pseudo first-order conditions,in which [S]Km. Determinations were performed withdifferent substrate concentrations and calculated using nonlinearregression data analysis with the aid of the GraFit program(Leatherbarrow, 2001). The molar concentration of the S. leviscysteine proteinase was determined by active site titration with E-64 inhibitor (
การแปล กรุณารอสักครู่..
การย่อยสลายของ fluorogenic z-fr-mca เปปไทด์ , และ z-lrmca
z-rr-mca ( calbiochem , La Jolla , CA , USA ) โดยบริสุทธิ์ S .
Levis ลูกเต้าคือการติดตามอย่างต่อเนื่องใน ฮิตาชิ f-2500
spectrofluorimeter โดยการวัดการเรืองแสงที่เล็กซ์ = 380 nm และ
เล็ม = 460 nm . ประมาณ 20 มม. ของเอนไซม์บริสุทธิ์ถูก
เพิ่ม 0.1 โมลาร์โซเดียมอะซิเตต , pH 5.5 , ประกอบด้วย
DTT 2.5 มม. ( 1เล่มสุดท้าย 0 มิลลิลิตร ) และบ่มเป็นเวลา 3 นาทีที่ 37 8C .
) จึงเพิ่มกิจกรรมและที่ความเข้มข้นต่าง ๆ thecatalytic ถูกตรวจสอบ . อัตราคงที่ kcat
ที่สองปรากฏ / km ถูกกำหนดภายใต้เงื่อนไขความเทียม
ที่ [ S ] km การใช้พื้นผิวที่แตกต่างกันและคำนวณความเข้มข้นด้วย
ใช้ไม่เป็นเชิงเส้นขั้นตอนการวิเคราะห์ข้อมูลด้วยความช่วยเหลือของโปรแกรม grafit
( leatherbarrow , 2001 ) ความเข้มข้นโดยโมลของ S . Levis
ซีสเตอีนโปรถูกกำหนดโดยการไทเทรตเว็บไซต์ที่ใช้งานกับ E -
64 ใช้
การแปล กรุณารอสักครู่..