3. Results3.1. An efficient protein

3. Results
3.1. An efficient protein extraction method Two methods were performed for the protein extraction. One method was performed using a lysis buffer and another method was performed using 0.01% PBS buffer. The extracted protein was detected using SDS-PAGE (Fig. 1). In SDS-PAGE, 0.01% PBS buffer extracts contained abundant proteins (Fig. 1. lanes 1 and 2), but a lysis buffer extract lost many large molecular weight proteins and the number of protein bands also decreased(Fig. 1. lanes 3 and 4). Therefore, we chose 0.01% PBS buffer as an optimal extraction method used for 2D-PAGE.
3.2. Differentially expressed proteins of hepatopancreas between cold stress
treated shrimp and control shrimp Hepatopancreas protein samples of normal shrimps were separated
by 2-DE (pH range 3–10)(Fig. 2). After silver staining, approximately 913 spots on each gel were distinguished by ImageMaster 2D software. It showed that 2.74% (25 spots) of the total proteins were distributed in the range of pI 3–4, 81.93% (180, 346 and 222 spots distributed in the range of pI 4–5, 5–6 and 6–7, respectively) of the total proteins were distributed in the range of pI 4–7, and 15.33% (93, 32 and 15 spots distributed in the range of pI 7–8, 8–9 and 9–10, respectively) of the total proteins were distributed in the range of pI 7–10. So to enhance the resolution, a pH gradient of 4–7 was suitable for the separation of hepatopancreas proteins, as most of these proteins had pIs within the range of 4–7. Hepatopancreas protein samples of cold stress treated shrimp and normal shrimp were separated by 2DE (Fig. 3A and B). After silver staining, the total six 2-DE gels were analyzed using ImageMaster 2D software, thirty seven protein spots showed significantly differential expression in the hepatopancreas of cold stress treated shrimp compared with that of control shrimp, and the identified spots are marked with numbers (Fig. 3A and B). Thirteen (35.14%) of these spots showed significantly decreased expression (expression levels were ≤0.67-fold of controls) in cold stress treated shrimp compared with control group; Twenty-four (64.86%) showed significantly increased expression (expression levels were ≥1.5-fold of controls) in that of cold stress treated shrimp compared with control group. All protein spots that showed differential expression in the hepatopancreas of cold stress treated shrimp were analyzed by MALDI-TOF/ TOF MS (shown in Table 2). Some different spots were identified as the same proteins, and this might be the results of different protein isoforms or post-translational modifications.
3.3. Real-time PCR of the differentially expressed protein genes Besides expression at the post-translational level, we determined the expression of certain genes of interest at the transcriptional level

Fig. 1. One-dimensional electrophoretogram of hepatopancreas proteins extracted using 0.01% PBS buffer and a lysis buffer separately. Protein samples extracted from hepatopancreas were loaded onto lanes of a 12% SDS-PAGE. Gels were stained with Coomassie blue stain G-250. Lane 1 and lane 2 were proteins extracted using 0.01% PBS buffer; lane 3 and lane 4 were proteins extracted with a lysis buffer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์3.1. การมีประสิทธิภาพโปรตีนสกัดวิธีสองวิธีดำเนินการการสกัดโปรตีน วิธีหนึ่งทำโดยใช้ lysis บัฟเฟอร์ และวิธีดำเนินการใช้บัฟเฟอร์ PBS 0.01% ตรวจพบโปรตีนสกัดใช้ SDS-หน้า (รูปที่ 1) ใน SDS-หน้า สารสกัดจากบัฟเฟอร์ของ PBS 0.01% ประกอบด้วยโปรตีนมากมาย (รูปที่ 1. เลน 1 และ 2), แต่สารสกัดจากบัฟเฟอร์ lysis เป็นโปรตีนโมเลกุลขนาดใหญ่น้ำหนักมากและจำนวนวงโปรตีนยังลดลง (รูปที่ 1. เลนที่ 3 และ 4) ดังนั้น เราเลือกบัฟเฟอร์ PBS 0.01% เป็นวิธีการสกัดที่ดีที่สุดที่ใช้สำหรับหน้า 2D3.2. งูแสดงโปรตีนของ hepatopancreas ระหว่างเย็นความเครียดกุ้งและกุ้งควบคุม Hepatopancreas แยกจากกันตัวอย่างโปรตีนของกุ้งปกติโดยเดอ 2 (ค่า pH อยู่ในช่วง 3 – 10)(Fig. 2) หลังจากย้อมสีเงิน จุดประมาณ 913 ในแต่ละเจได้โดดเด่น ด้วยซอฟต์แวร์ 2D ImageMaster แสดงให้เห็นว่า ได้กระจาย 2.74% (25 จุด) ของโปรตีนรวมในช่วง 3 – 4, pI 81.93% (180, 222 และ 346 จุดแจกจ่ายในช่วงปี่ 4-5, 5-6 และ 6 – 7 ตามลำดับ) ของโปรตีนทั้งหมดถูกแจกจ่ายในช่วงปี่ 4 – 7 และ 15.33% (93, 32 และ 15 จุดแจกจ่ายในช่วงปี่ 7-8 , 8 – 9 และ 9 – 10 ตามลำดับ) ของโปรตีนทั้งหมดถูกแจกจ่ายในช่วงปี่ 7-10 ดังนั้น เพื่อเพิ่มความละเอียด การไล่ระดับค่า pH 4-7 เป็นเหมาะสำหรับการแยกของ hepatopancreas โปรตีน เป็นส่วนใหญ่ของโปรตีนเหล่านี้มี pIs ภายในช่วง 4 – 7 ตัวอย่างโปรตีน Hepatopancreas เย็นความเครียดถือว่ากุ้งและกุ้งปกติถูกคั่น ด้วย 2DE (รูป 3A และ B) หลังจากย้อมสี เงินรวมหกเจเดอ 2 ถูกวิเคราะห์โดยใช้ ImageMaster ซอฟต์แวร์ 2D สามสิบเจ็ดจุดโปรตีนแสดงนิพจน์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญใน hepatopancreas กุ้งเย็นความเครียดที่ได้รับการรักษาเมื่อเทียบกับที่ของกุ้งควบคุม และจุดที่ระบุถูกทำเครื่องหมายตัวเลข (รูป 3A และ B) สิบสาม (35.14%) ของจุดเหล่านี้แสดงให้เห็นอย่างมีนัยสำคัญลดนิพจน์ (นิพจน์ระดับถูก ≤0.67-พับของตัวควบคุม) ในกุ้งเย็นความเครียดที่ได้รับการรักษาเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ยี่สิบสี่ (64.86%) พบนัยนิพจน์ (นิพจน์ระดับถูก ≥1.5-พับของตัวควบคุม) ในของกุ้งเย็นความเครียดที่ได้รับการรักษาเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม โปรตีนทุกจุดที่แสดงค่านิพจน์ hepatopancreas เย็นเครียดรักษากุ้งถูกวิเคราะห์ โดย MALDI TOF / MS TOF (แสดงในตารางที่ 2) บางจุดต่าง ๆ ถูกระบุเป็นโปรตีนเหมือนกัน และนี้อาจจะผลของ isoforms โปรตีนแตกต่างกันหรือแก้ไขโพสต์แปล3.3 แบบเรียลไทม์ PCR ของยีนโปรตีนแสดงแตกต่างกันนอกจากนิพจน์ที่ระดับโพสต์แปล เรากำหนดการแสดงออกของยีนบางอย่างน่าสนใจในระดับ transcriptionalรูปที่ 1 Electrophoretogram one-dimensional hepatopancreas โปรตีนสกัดโดยใช้บัฟเฟอร์ PBS 0.01% lysis บัฟเฟอร์ต่างหาก ตัวอย่างโปรตีนที่สกัดจาก hepatopancreas ถูกโหลดลงบนเลน 12% SDS-หน้า เจถูกย้อม ด้วย Coomassie G-250 สีย้อมสีน้ำเงิน 1 เลนและ 2 เลนมีโปรตีนสกัดโดยใช้บัฟเฟอร์ PBS 0.01% โปรตีนสกัด ด้วย lysis บัฟเฟอร์ 3 เลนและ 4 เลนได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการทดลอง
3.1 วิธีการสกัดโปรตีนที่มีประสิทธิภาพสองวิธีได้ดำเนินการในการสกัดโปรตีน วิธีการหนึ่งที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้บัฟเฟอร์สลายและอีกวิธีหนึ่งที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้ 0.01% บัฟเฟอร์พีบีเอส โปรตีนที่สกัดได้เมื่อตรวจพบการใช้ระบบ SDS-PAGE (รูปที่ 1). ในระบบ SDS-หน้า 0.01% สารสกัดจากพีบีเอสบัฟเฟอร์ที่มีโปรตีนที่อุดมสมบูรณ์ (รูปที่ 1. เลนที่ 1 และ 2) แต่สารสกัดสลายหายไปบัฟเฟอร์ขนาดใหญ่จำนวนมากน้ำหนักโมเลกุลโปรตีนและจำนวนของวงดนตรีโปรตีนลดลง (รูปที่ 1. 3 เลน และ 4) ดังนั้นเราจึงเลือกที่ 0.01% พีบีเอสบัฟเฟอร์เป็นวิธีการสกัดที่ดีที่สุดที่ใช้สำหรับ 2D-PAGE.
3.2 แสดงความแตกต่างกันของโปรตีนตับระหว่างเย็นความเครียด
ได้รับการรักษาและการควบคุมกุ้งกุ้งตับตัวอย่างโปรตีนกุ้งปกติถูกแยกออก
โดย 2-de (ช่วงค่า pH 3-10) (รูป. 2) หลังจากการย้อมสีเงินประมาณ 913 จุดในแต่ละเจลโดดเด่นด้วยซอฟต์แวร์ ImageMaster 2D มันแสดงให้เห็นว่า 2.74% (25 จุด) ของโปรตีนทั้งหมดถูกกระจายอยู่ในช่วงของพี่ 3-4, 81.93% (180, 346 และ 222 จุดกระจายอยู่ในช่วงของพี่ 4-5, 5-6 และ 6-7 ตามลำดับ) ของโปรตีนทั้งหมดถูกกระจายอยู่ในช่วงของพี่ 4-7 และ 15.33% (93, 32 และ 15 จุดกระจายอยู่ในช่วงของพี่ 7-8, 8-9 และ 9-10 ตามลำดับ) ของ โปรตีนทั้งหมดถูกกระจายอยู่ในช่วงของพี่ 7-10 ดังนั้นเพื่อเพิ่มความละเอียดลาดค่า pH 4-7 มีความเหมาะสมสำหรับการแยกโปรตีนตับที่เป็นที่สุดของโปรตีนเหล่านี้มี PIS อยู่ในช่วงของ 4-7 ตัวอย่างตับโปรตีนของความเครียดกุ้งได้รับการรักษาที่หนาวเย็นและกุ้งปกติถูกแยกจากกันโดย 2DE (รูป. 3A และ B) หลังจากการย้อมสีเงินทั้งหมดหกเจล 2 ที่ถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟแวร์ ImageMaster 2D, สามสิบเจ็ดจุดโปรตีนแสดงให้เห็นอย่างมีนัยสำคัญแตกต่างแสดงออกในตับของกุ้งความเครียดได้รับการรักษาเย็นเมื่อเทียบกับที่ของกุ้งควบคุมและจุดที่ระบุจะมีเครื่องหมายตัวเลข ( รูป. 3A และ B) สิบสาม (35.14%) ของจุดเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าลดลงอย่างมีนัยสำคัญการแสดงออก (ระดับการแสดงออกเป็น≤0.67เท่าของการควบคุม) ในการรักษาความเครียดกุ้งเย็นเทียบกับกลุ่มควบคุม; ยี่สิบสี่ (64.86%) แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ระดับการแสดงออกเป็น≥1.5เท่าของการควบคุม) ในการที่กุ้งความเครียดได้รับการรักษาเย็นเทียบกับกลุ่มควบคุม ทุกจุดโปรตีนที่แสดงให้เห็นการแสดงออกที่แตกต่างกันในตับของความเครียดกุ้งได้รับการรักษาที่หนาวเย็นมาวิเคราะห์โดย MALDI-TOF / TOF MS (แสดงในตารางที่ 2) บางจุดที่แตกต่างถูกระบุว่าเป็นโปรตีนเดียวกันและนี้อาจจะมีผลของการไอโซฟอร์มโปรตีนแตกต่างกันหรือการปรับเปลี่ยนการโพสต์แปลได้.
3.3 Real-time PCR ของที่แตกต่างกันที่แสดงออกของยีนโปรตีนนอกจากนี้การแสดงออกในระดับที่โพสต์แปลเราพิจารณาการแสดงออกของยีนบางอย่างที่น่าสนใจในระดับการถอดรหัสรูป 1. electrophoretogram หนึ่งมิติของโปรตีนสกัดตับโดยใช้บัฟเฟอร์พีบีเอส 0.01% และบัฟเฟอร์สลายแยก ตัวอย่างโปรตีนที่สกัดจากตับถูกโหลดลงในเลนของ 12% SDS-PAGE เจลถูกย้อมด้วยสีฟ้า Coomassie คราบ G-250 เลนที่ 1 และ 2 ช่องทางที่ได้รับโปรตีนสกัดโดยใช้ 0.01% พีบีเอสบัฟเฟอร์; เลนที่ 3 และ 4 เลนถูกโปรตีนสกัดด้วยบัฟเฟอร์สลาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลลัพธ์3.1 . ประสิทธิภาพการสกัดโปรตีนด้วยวิธี 2 วิธีคือการใช้โปรตีนสกัด วิธีหนึ่งคือการใช้บัฟเฟอร์ที่เสื่อมและอีกวิธีหนึ่งคือการใช้ 0.01 % pbs buffer สกัดโดยใช้ SDS-PAGE พบโปรตีน ( รูปที่ 1 ) ในเอนไซม์ 0.01 % PBS buffer สารสกัดโปรตีนที่มีอยู่มากมาย ( รูปที่ 1 เส้นทางที่ 1 และ 2 ) , แต่การสลายบัฟเฟอร์แยกโมเลกุลโปรตีนขนาดใหญ่หลายสูญหายและจำนวนแถบโปรตีนลดลง ( รูปที่ 1 ช่องที่ 3 และ 4 ) ดังนั้นเราจึงเลือก 0.01% PBS buffer เป็นที่ดีที่สุดการสกัดใช้วิธี 2D-PAGE .3.2 . แสดงออกแตกต่างกันโปรตีนของกุ้งระหว่างความเย็นกุ้งกุ้งกุ้งได้รับการควบคุมและโปรตีนตัวอย่างของกุ้งปกติแยกกันโดยแผ่น ( pH ในช่วง 3 - 10 ) ( รูปที่ 2 ) หลังจากที่เงินย้อมประมาณ 990 จุดในแต่ละเจลมีความโดดเด่นด้วยซอฟแวร์ 2D imagemaster . มันแสดงให้เห็นว่า 2.74 % ( 25 จุด ) ของโปรตีนทั้งหมดกระจายอยู่ในช่วงปี่ 3 – 4 , 81.93 % ( 180 , 346 และ 222 กระจายในช่วงของปี่ 4 – 5 , 5 - 6 และ 6 – 7 ตามลำดับจุด ) ของโปรตีนทั้งหมดกระจายอยู่ในช่วงของ พิ 4 – 7 และ 15.33 % ( 93 , 32 และ 15 กระจายในช่วงปี่ที่ 7 – 8 , 8 – 9 และ 9 และ 10 ตามลำดับจุด ) ของโปรตีนทั้งหมดกระจายอยู่ในช่วงปี่ที่ 7 – 10 ดังนั้น เพื่อเพิ่มความละเอียดระดับ pH 4 – 7 เหมาะสำหรับการแยกโปรตีนของกุ้ง ส่วนใหญ่เป็นโปรตีนเหล่านี้ได้ยอมรับว่าในช่วง 4 – 7 โปรตีนของกุ้งตัวอย่างความเย็นรักษากุ้งและกุ้งปกติโดยแยก 2de ( รูปที่ 3A และ B ) หลังจากที่เงิน staining ทั้งหมดหกแผ่นเจล วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้โปรแกรม 2D imagemaster สามสิบเจ็ดโปรตีนจุดพบอย่างมีนัยสำคัญแสดงออกที่แตกต่างกันในตับของกุ้งได้รับความเย็นเมื่อเทียบกับที่ของกุ้ง ควบคุมและระบุจุดที่มีการทำเครื่องหมายด้วยตัวเลข ( รูปที่ 3A และ B ) สิบสาม ( 35.14 ) จุดเหล่านี้จะลดลงการแสดงออก ( ระดับการแสดงออกเป็น≤ 0.67-fold ของการควบคุม ) ในกุ้งได้รับความเย็นเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ยี่สิบสี่ ( 64.86 % ) มีการแสดงออกเพิ่มขึ้น ( ระดับการแสดงออกเป็น≥ 1.5-fold ของการควบคุม ) ของกุ้งได้รับความเย็นเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม โปรตีนที่พบการแสดงออกแตกต่างกันทุกจุดในตับของกุ้งที่ได้รับความเย็น โดยใช้ maldi-tof / tof MS ( แสดงดังตารางที่ 2 ) บางจุดที่แตกต่างกันที่ถูกระบุว่าเป็นชนิดเดียวกัน และนี้อาจจะมีผลต่อโปรตีนที่แตกต่างกันหรือการไปรษณีย์ - แปล .3.3 . เวลาจริง PCR ของยีนแสดงออกแตกต่างกันโปรตีนนอกเหนือจากการแสดงออกในระดับไปรษณีย์ - แปล เราพบการแสดงออกของยีนบางอย่างที่น่าสนใจในระดับ ลองรูปที่ 1 หนึ่ง electrophoretogram มิติของตับโปรตีนสกัดโดยใช้ 0.01 % กันชน PBS และการสลายบัฟเฟอร์ที่แยกต่างหาก ตัวอย่าง โปรตีนสกัดจากตับและตับอ่อนถูกโหลดลงบนเลนของ 12% การศึกษา . เจลมีคราบเปื้อน g-250 เหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้า ซอย 1 และซอย 2 เป็นโปรตีนสกัดโดยใช้ 0.01 % PBS buffer ; ซอย 3 และซอย 4 เป็นโปรตีนที่สกัดด้วยการสลายบัฟเฟอร์