2.5. Species-specific PCR amplifica

2.5. Species-specific PCR amplification
The PCR assays were performed in a total reaction volume of 25 μL containing 2 μL of DNA extract (20 ng for meats and 100 ng for samples and other tested food ingredients), 67 mmol L− 1 Tris–HCl (pH 8.8), 16 mmol L− 1 (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20, 0.2 mmol L− 1 of each dNTP (Bioron, Ludwigshafen, Germany), 400 nmol L− 1 of each primer for the target species or 600 nmol L− 1 for eukaryotic sequences (Table 1), 1.5 mmol L− 1 of MgCl2 for pork and cow species and 2.5 mmol L− 1 for the others, and 1 U of SuperHot Taq DNA polymerase (Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm, Germany). The reactions were performed in a thermal cycler MJ Mini (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) using the following programmes: (i) initial denaturation at 94 °C for 5 min; (ii) 32 cycles (for pork, rabbit and cow DNA) or 35 cycles (for hare and eukaryotic DNA) or 38 cycles (for red deer DNA) at 94 °C for 30 s, 60 °C (except for cow and hare 65 °C) for 30 s and 72 °C for 30 s; (iii) and a final extension at 72 °C for 5 min.

The amplified fragments were analysed by electrophoresis in a 2.0% agarose gel containing Gel Red 1 × (Biotium, Hayward, CA, USA) for staining and carried out in TAE buffer (40 mmol L− 1 Tris–acetate, 1 mmol L− 1 EDTA) for 60 min at 120 V. The agarose gel was visualised under UV light and a digital image was obtained using a Kodak Digital Science™ DC120 (Rochester, NY, USA). Each extract was amplified at least in duplicate assays.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 species-specific PCR ขยายดำเนิน PCR assays ปริมาณปฏิกิริยารวมของ μL 25 μL 2 ของสารสกัดดีเอ็นเอประกอบด้วย (20 ng สำหรับเนื้อสัตว์และ 100 ng ตัวอย่างและอื่น ๆ ทดสอบส่วนผสมอาหาร), 67 mmol L− 1 ตรี – HCl (pH 8.8), mmol 16 1 L− (NH4) 2SO4, 0.01% Tween 20, mmol 0.2 L− 1 ของแต่ละ dNTP (Bioron, Ludwigshafen เยอรมนี), 400 nmol L− 1 แต่ละพื้นสำหรับชนิดเป้าหมาย หรือ 600 nmol L− 1 ลำดับ eukaryotic (ตาราง 1), mmol 1.5 L− 1 ของ MgCl2 สำหรับพันธุ์หมูและวัวและ 2.5 mmol L− 1 สำหรับคนอื่น และ 1 U ของ SuperHot Taq DNA พอลิเมอเรส (Genaxxon ซื้อ GmbH, Ulm เยอรมนี) ปฏิกิริยาจะดำเนินใน cycler ร้อนมินิ MJ (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส CA, USA) โดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้: (i) เริ่มต้น denaturation ที่ 94 ° C สำหรับ 5 นาที (ii) รอบ 32 (สำหรับหมู กระต่าย และวัวดีเอ็นเอ) หรือรอบ 35 (สำหรับกระต่ายและ eukaryotic DNA) หรือรอบ 38 (สำหรับกวางแดงดีเอ็นเอ) ที่ 94 ° C สำหรับ s, 60 ° C (ยกเว้นวัวและกระต่าย 65 ° C) 30 30 s และ 72 ° C สำหรับ 30 s (iii) และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 5 นาทีชิ้นส่วนเอาต์ได้ analysed โดย electrophoresis ในเจ 2.0% agarose ประกอบด้วยเจลอาบน้ำแดง 1 × (Biotium, Hayward, CA, USA) สำหรับการย้อมสี และดำเนินการในบัฟเฟอร์เต้ (40 mmol L− 1 ตรี – acetate, L− 1 EDTA 1 mmol) ใน 60 นาทีที่ 120 V เจ agarose มี visualised ภายใต้แสง UV และภาพดิจิทัลได้รับใช้เป็นโกดักดิจิตอลวิทยาศาสตร์™ DC120 (โรเชสเตอร์ NY สหรัฐอเมริกา) สารสกัดแต่ละถูกขยายน้อยใน assays ซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 สายพันธุ์เฉพาะการขยาย PCR
ตรวจ PCR ได้ดำเนินการในปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมด 25 ไมโครลิตรมี 2 ไมโครลิตรของสารสกัดดีเอ็นเอ (20 ng สำหรับเนื้อและ 100 ng สำหรับตัวอย่างและส่วนผสมอาหารที่ผ่านการทดสอบและอื่น ๆ ), 67 มิลลิโมล L- 1 Tris-HCl ( พีเอช 8.8), 16 มิลลิโมล L- 1 (NH4) 2SO4, 0.01% Tween 20 0.2 mmol L- 1 ของแต่ละ dNTP (Bioron, Ludwigshafen, เยอรมนี), 400 นาโนโมล L- 1 ของแต่ละรองพื้นสำหรับสายพันธุ์เป้าหมายหรือ 600 นาโนโมล L- 1 สำหรับลำดับ eukaryotic (ตารางที่ 1) 1.5 mmol L- 1 ของ MgCl2 สำหรับเนื้อหมูและวัวสายพันธุ์และ 2.5 มิลลิโมล L- 1 สำหรับคนอื่น ๆ และ 1 U ของ SuperHot Taq DNA polymerase (Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm, เยอรมนี) . ปฏิกิริยาที่ได้รับการดำเนินการในการระบายความร้อน Cycler MJ Mini (ชีวภาพ -Rad ห้องปฏิบัติการ, ดาว, CA, USA) โดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้: (i) การสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; (ii) 32 รอบ (เนื้อหมูกระต่ายและดีเอ็นเอวัว) หรือ 35 รอบ (สำหรับกระต่ายและ DNA ยูคาริโอ) หรือ 38 รอบ (ดีเอ็นเอกวางสีแดง) ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 60 ° C (ยกเว้นสำหรับวัวและกระต่าย 65 ° C) เป็นเวลา 30 และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที; (III) และนามสกุลสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาทีเศษขยายการวิเคราะห์ electrophoresis ใน agarose เจล 2.0% ที่มีเจลสีแดง 1 × (Biotium เฮย์เวิร์ด, CA, USA) สำหรับการย้อมสีและการดำเนินการในบัฟเฟอร์ TAE (40 มิลลิโมล L- 1 Tris-acetate, 1 มิลลิโมล L- 1 EDTA) สำหรับ 60 นาทีที่ 120 โวลเจล agarose ได้รับการมองเห็นภายใต้แสงยูวีและภาพดิจิตอลที่ได้รับการใช้โกดักดิจิตอลวิทยาศาสตร์™ DC120 (โรเชสเตอร์, นิวยอร์ก, ประเทศสหรัฐอเมริกา) สารสกัดแต่ละถูกขยายอย่างน้อยในการตรวจซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 ชนิด โดยเฉพาะการขยาย PCR พบ
ได้ในปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมด 25 μ L มี 2 μล. สกัดดีเอ็นเอ ( 20 ng สำหรับเนื้อสัตว์และ 100 ng สำหรับตัวอย่างและทดสอบวัสดุอาหาร ) , 67 มิลลิโมล L − 1 สำหรับ– HCl ( พีเอช 8.8 ) 16 มิลลิโมล L − 1 ( NH4 ) 2so4 0.01 % Tween 20 , 0.2 มิลลิโมล L − 1 ของแต่ละ dntp ( bioron Ludwigshafen ประเทศเยอรมนี , )400 ? L − 1 ของแต่ละสีรองพื้นสำหรับเป้าหมายชนิดหรือ 600 ? L − 1 สำหรับ eukaryotic ลำดับ ( ตารางที่ 1 ) 1.5 mmol l − 1 ไอโซโทปสำหรับหมูและวัว และ 2.5 mmol l ชนิด− 1 สำหรับคนอื่น ๆและ 1 U ของฮอตแท็ค DNA polymerase ( genaxxon วิทยาศาสตร์ชีวภาพ GmbH , อูลม์ , เยอรมนี ) ปฏิกิริยาการวิจัยในความร้อนรอบ MJ Mini ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา ) โดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้ : ( i ) ( เริ่มต้นที่ 94 ° C เป็นเวลา 5 นาที ; ( 2 ) 32 รอบ ( หมูกระต่ายและดีเอ็นเอวัว ) หรือ 3 รอบ ( สำหรับกระต่ายและดีเอ็นเอ eukaryotic ) หรือ 38 รอบ ( กวางแดง DNA ) ที่ 94 ° C เป็นเวลา 30 , 60 ° C ( ยกเว้นวัวกับกระต่าย 65 ° C ) สำหรับ 30 และ 72 ° C 30 s ; ( iii ) และขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที

ทำการวิเคราะห์โดยวิธีชิ้นส่วนใน 2.0 % เจลที่มีเจลสีแดง 1 × ( biotium เฮย์เวิร์ด , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) สำหรับติดออกมา เท บัฟเฟอร์ ( 40 มิลลิโมล L − 1 บริษัท 1 mmol l ( acetate , − 1 ตามลำดับ ) สำหรับ 60 นาทีที่ 120 โวลต์เจลก็มองเห็นภายใต้ แสงยูวี และภาพดิจิตอล ได้ใช้โกดักดิจิตอลวิทยาศาสตร์™ dc120 ( โรเชสเตอร์ , นิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกา )แต่ละแยกก็ขยายอย่างน้อยในเลือดซ้ำ