5.2.1. Sample preparation for measu

5.2.1. Sample preparation for measuring caspase activity by
fluorometry
On day zero, 6  105 cells per well are seeded in six-well suspension
tissue culture plates. The next day the cells are stimulated
and collected in 1.5-ml Eppendorf tubes at regular time intervals.
After centrifugation of the cells for 5 min at 250g and removing
the PBS, the cells are lysed in 150 ll cold caspase lysis buffer (1%
NP-40, 10 mM Tris–HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2). The
following protease inhibitors should be added to caspase lysis
buffer directly before cell lysis: 1 mM PMSF, 0.3 mM aprotinin,
and 1 mM leupeptin. Pefablock protease inhibitors or other total
protease inhibitor mixes should not be used because they interfere
with caspase activity. To block the catalytic cysteine of caspases to
prevent the activation of caspase cascades, 1 mM of oxidized glutathione
(GS-SG) is added during lysis, which is carried out on ice to
stop further biochemical activity. Next, the cell debris is removed
by centrifuging the lysate for 10 min at 20,800g (4 C) and the cytosol
is transferred to another Eppendorf tube (cytosolic cell lysate).
After protein concentration determination, the equivalent of 10 lg
protein is transferred to a new Eppendorf for caspase activity
measurement, while the remainder is used for immunoblotting

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5.2.1 การเตรียมความพร้อมสำหรับการวัดตัวอย่างกิจกรรม caspase โดย
fluorometry
ในวันศูนย์ 6? 105 เซลล์ต่อดีจะเมล็ดในการระงับหกดี
จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ วันถัดไปเซลล์ถูกกระตุ้น
และรวบรวมไว้ในหลอด Eppendorf 1.5 มิลลิลิตรในช่วงเวลาปกติ.
หลังจากการหมุนเหวี่ยงของเซลล์เวลา 5 นาทีที่ 250 กรัมและลบ
พีบีเอสเซลล์จะ lysed ใน 150 บัฟเฟอร์สลาย caspase เย็น LL (1%
NP -40, 10 mM Tris-HCl พีเอช 7.4, 10 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 3 มม MgCl2)
น้ำย่อยต่อไปนี้ควรจะเพิ่มสลาย caspase
บัฟเฟอร์โดยตรงก่อนที่จะสลายเซลล์: 1 มิลลิ PMSF 0.3 มิลลิ Aprotinin,
และ 1 มิลลิ leupeptin Pefablock น้ำย่อยหรืออื่น ๆ รวม
ผสมสารยับยั้งเอนไซม์โปรติเอไม่ควรใช้เพราะพวกเขายุ่งเกี่ยว
กับกิจกรรมเซ่ เพื่อป้องกัน cysteine ​​เร่งปฏิกิริยาของ caspases เพื่อ
ป้องกันไม่ให้การทำงานของน้ำตกเซ่, 1 มิลลิกลูตาไธโอนออกซิไดซ์
(GS-SG) จะเพิ่มขึ้นในช่วงสลายซึ่งจะดำเนินการในน้ำแข็งเพื่อ
หยุดกิจกรรมทางชีวเคมีเพิ่มเติม ถัดไปเศษเซลล์จะถูกลบออก
โดยการปั่นแยก lysate 10 นาทีที่ 20,800g (4 องศาเซลเซียส) และเซลล์
จะถูกโอนไปยังอีกหลอด Eppendorf (lysate เซลล์ cytosolic).
หลังจากที่การกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนเทียบเท่า 10 LG
โปรตีนจะถูกโอน ไปอยู่ที่ใหม่ Eppendorf กิจกรรม caspase
วัดในขณะที่ส่วนที่เหลือจะใช้สำหรับการ immunoblotting

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5.2.1 . การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวัดกิจกรรมแคสเปสด้วย

fluorometry วันที่ 6  105 ศูนย์ เซลล์ต่อเมล็ดได้เป็นอย่างดีในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อดีช่วงล่าง
6 แผ่น ในวันถัดไปที่เซลล์ถูกกระตุ้น
และเก็บใน 1.5-ml เพนดอร์ฟหลอดในช่วงเวลาปกติ
หลังการปั่นเหวี่ยงของเซลล์เป็นเวลา 5 นาที 250 และการลบ
พีบีเอสเซลล์จะ lysed 150 จะหนาวแคสเปสการสลายบัฟเฟอร์ ( 1 %
np-40 10 มม. นอกจากนี้ –กรดไฮโดรคลอริก pH 7.4 10 mM NaCl , 3 มม. MgCl2 )
ต่อไปนี้ protease inhibitors ควรเพิ่มการสลาย
แคสเปสบัฟเฟอร์โดยตรงก่อนการสลายเซลล์ : 1 mM PMSF และ 0.3 aprotinin มม.
ลูเพปติน 1 มิลลิเมตร pefablock protease inhibitors หรือตัวยับยั้งโปรติเอสรวม
อื่นผสม ไม่ควรใช้ เพราะเขายุ่ง
กับกิจกรรมแคสเปส . เพื่อป้องกันการ caspases กรดอะมิโน

ป้องกันการแคสเปสน้ำตก 1 มม. ไดซ์กลูตาไธโอน
( gs-sg ) เพิ่มในระหว่างการสลาย ซึ่งเป็นการดำเนินการบนน้ำแข็ง

หยุดกิจกรรมทางชีวเคมีต่อไป ถัดไป , เศษเซลล์จะถูกเอาออกโดยการ lysate
สารสำหรับ 10 นาทีที่ 20800g ( 4  C ) และไซโตซอล
จะถูกโอนไปยังอีกหลอดเพนดอร์ฟ ( lysate เซลล์ cytosolic ) .
หลังจากโปรตีนความมุ่งมั่น เทียบเท่า 10 LG
โปรตีนส่งไปใหม่เพนดอร์ฟ สำหรับการวัดแคสเปสกิจกรรม
, ในขณะที่ส่วนที่เหลือใช้วิธี