Probes screeningThe results of FISH

Probes screening

The results of FISH using all the DNA probes are summarized in Table 2 and Fig. 1. P. donghaiense could not be labeled by the probes targeting both SSU rRNA (DP1704A23) and ITS rDNA (DP0159A25, DP0498A21). The complex second structure of rRNA may preclude its hybridization with DP1704A23, since rRNA expression in cells is often thought to be at a high level. Except for certain species [8], rDNA is generally thought to be unsuitable for probe targeting, because the cells labeled with rDNA targeting probe tend to display weak fluorescence [32], which disturb their differentiation from other species in natural samples [39]. Things seem to get worse for P. donghaiense, since the cells marked by both DP0159A25 and DP0498A21 did not display any visible fluorescence under epifluorescence microscopy. The possible reason for this is that the copies of ITS rDNA within genomic DNA of P. donghaiense are at least less than A. catenella [32], A. tarmarense [32] and H. akashiwo [8]. Therefore, P. donghaiense cells could not provide enough biding molecules for the rDNA targeting probe, and the hybridized cells with less fluorescein labeled probe naturally give out weak and even invisible fluorescence, as shown in this study.The effect of the secondary structure of the LSU rRNA on the accessibility of probes to the target sites has been shown in previous studies [40]–[42]. Again, our findings reconfirm this. The four rRNA-targeted probes with even slight alternation in the 5′ portion of the sequence displayed different performance (Table 2 and Fig. 1). Among them, only DP0443A labeled P. donghaiense cells with fluorescent intensity equivalent to the positive control probe (DU0512A18), while P. donghaiense cells marked by DP0587A did not show any fluorescence. The cells labeled with DP0602A and DP0512A displayed more or less intensive fluorescence compared with the positive control probe labeling cells, respectively. The further quantification analyses of fluorescent intensity of cells labeled with different probes were shown in Fig. 2. Apparently, the fluorescent intensity of DP0443A labeling cells were significantly more intensive (p

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หัวตรวจผลลัพธ์ของปลาโดยใช้โพรบดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสรุปในตารางที่ 2 และรูปที่ 1 P. donghaiense ไม่ได้มีป้ายชื่อตามวัดที่กำหนดเป้าหมาย SSU rRNA (DP1704A23) และของ rDNA (DP0159A25, DP0498A21) สองโครงสร้างที่ซับซ้อนของ rRNA อาจดักคอการ hybridization กับ DP1704A23 เนื่องจาก rRNA นิพจน์ในเซลล์มักจะคิดว่า จะอยู่ในระดับสูง ยกเว้นบางพันธุ์ [8], rDNA โดยทั่วไปคิดว่า จะไม่เหมาะสมสำหรับการวัดเป้าหมาย เพราะเซลล์ติดป้าย rDNA สอบสวนการกำหนดเป้าหมายมีแนวโน้มแสดงเรืองแสงอ่อน [32], ซึ่งรบกวนพวกเขาแตกต่างจากสายพันธุ์อื่น ๆ ในธรรมชาติตัวอย่าง [39] สิ่งที่ดูเหมือนจะเลวร้ายยิ่งสำหรับ P. donghaiense เนื่องจากเซลล์ที่ทำเครื่องหมาย โดย DP0159A25 และ DP0498A21 ไม่แสดงผลใด ๆ เรืองแสงที่มองเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence ดังนี้คือสำเนาของ rDNA ภายในออกดีเอ็นเอของ P. donghaiense catenella A. น้อยกว่าน้อย [32], A. tarmarense [32] และ H. akashiwo [8] ดังนั้น P. donghaiense เซลล์สามารถให้โมเลกุลพอ biding สำหรับ rDNA สอบสวนการกำหนดเป้าหมาย และการเซลล์ผสมพันธุ์กับวัดน้อยป้าย fluorescein ธรรมชาติอ่อนแอ และมองไม่เห็นแม้แต่เรืองแสง ดังที่แสดงในการศึกษานี้ ได้รับการแสดงผลของโครงสร้างรองของ LSU rRNA ในการเข้าถึงหัวไซต์เป้าหมายในการศึกษาก่อนหน้านี้ [40] – [42] อีกครั้ง ผลการวิจัยของเรายืนยันนี้ RRNA เป้าหมายหัวสี่กับการสับแม้เล็กน้อยในส่วน 5 ′ของลำดับการแสดงประสิทธิภาพที่แตกต่างกัน (ตารางที่ 2 และรูปที่ 1) ในหมู่พวกเขา DP0443A เพียงติดป้ายเซลล์ P. donghaiense ฟลูออเรสเซนต์ความเข้มเท่ากับโพรบควบคุมบวก (DU0512A18), ในขณะที่ P. donghaiense เซลล์ที่ทำเครื่องหมาย โดย DP0587A ไม่ได้แสดงการเรืองแสง เซลล์ที่ชื่อ DP0602A และ DP0512A แสดงเรืองแสงที่เข้มข้นมากหรือน้อยเมื่อเทียบกับโพรบควบคุมบวกเซลล์ การติดฉลากตามลำดับ วิเคราะห์นับเพิ่มเติมของฟลูออเรสเซนต์ความเข้มของเซลล์ที่ติดป้ายวัดต่าง ๆ ถูกแสดงในรูป 2 เห็นได้ชัด ฟลูออเรสเซนต์ความเข้มของเซลล์ DP0443A ติดฉลากได้เข้มข้นมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) กว่าของเซลล์ที่ทำเครื่องหมาย โดยวัดเป้าหมาย rRNA LSU อื่น ๆ จากการค้นพบเหล่านี้ DP0443A อาจเป็นที่ดีสุดในบรรดาโพรบดีเอ็นเอเหล่านี้ออก ดังนั้น เราสังเคราะห์โพรบ PNA (PP0443A) กับลำดับนิวคลีโอไทด์ DP0443A เดียวกัน และใช้มันอย่างยิ่งกับ P. donghaiense ตามที่คาดไว้ การสอบสวน PNA PP0443A ติดป้ายเซลล์ P. donghaiense เรืองแสงที่เข้มข้นกว่าตัวควบคุมเชิงบวกและ DP0443A (รูปที่ 1) นอกจากนี้ ความแตกต่างของหลอดฟลูออเรสเซนต์ความเข้มระหว่างพวกเขาถูกอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) (2 รูป) ดังนั้น เราได้รับการสอบสวน PNA เหมาะสำหรับตรวจจับปลาของ P. donghaiense

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พร็อบคัดกรองผลของปลาที่ใช้ทั้งหมดดีเอ็นเอโพรบจะสรุปในตารางที่ 2 และรูป 1. พี donghaiense ไม่สามารถโดดเด่นด้วยโพรบการกำหนดเป้าหมายทั้งซุ rRNA (DP1704A23) และ rDNA (DP0159A25, DP0498A21) โครงสร้างที่ซับซ้อนของสอง rRNA อาจดักคอผสมพันธุ์กับ DP1704A23 ตั้งแต่การแสดงออก rRNA ในเซลล์มักจะคิดว่าจะอยู่ในระดับสูง ยกเว้นบางชนิด [8], rDNA เป็นความคิดโดยทั่วไปจะไม่เหมาะสมสำหรับการกำหนดเป้าหมายการสอบสวนเพราะเซลล์ที่มีป้ายกำกับ rDNA กำหนดเป้าหมายการสอบสวนมีแนวโน้มที่จะแสดงความอ่อนแอเรืองแสง [32] ซึ่งรบกวนความแตกต่างของพวกเขาจากสายพันธุ์อื่น ๆ ในตัวอย่างธรรมชาติ [39] สิ่งที่ดูเหมือนจะได้รับเลวร้ายยิ่งสำหรับพี donghaiense เนื่องจากเซลล์ที่ถูกทำเครื่องหมายโดยทั้งสอง DP0159A25 และ DP0498A21 ไม่ได้แสดงการเรืองแสงที่มองเห็นใด ๆ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence เหตุผลที่เป็นไปได้สำหรับเรื่องนี้ก็คือสำเนาของ rDNA ภายในดีเอ็นเอของพี donghaiense เป็นอย่างน้อยน้อยกว่าเอ catenella [32], A. tarmarense [32] และเอช akashiwo [8] ดังนั้นพีเซลล์ donghaiense ไม่สามารถให้โมเลกุล biding เพียงพอสำหรับการสอบสวนการกำหนดเป้าหมาย rDNA และเซลล์ไฮบริดที่มีการติดป้ายชื่อ fluorescein สอบสวนน้อยตามธรรมชาติให้ออกจากการเรืองแสงที่อ่อนแอและแม้กระทั่งมองไม่เห็นที่แสดงอยู่ในผล study.The นี้ของโครงสร้างทุติยภูมิของ LSU rRNA ในการเข้าถึงของยานสำรวจไปยังเว็บไซต์เป้าหมายที่ได้รับการแสดงในการศึกษาก่อนหน้านี้ [40] - [42] อีกครั้งค้นพบของเรายืนยันนี้ สี่ probes rRNA กำหนดเป้าหมายด้วยแม้สลับกันเล็กน้อยใน '5 ส่วนของลำดับที่แสดงผลการดำเนินงานที่แตกต่างกัน (ตารางที่ 2 และรูปที่ 1). ในหมู่พวกเขาเท่านั้นที่มีป้ายกำกับ DP0443A พี donghaiense เซลล์ที่มีความรุนแรงเทียบเท่าเรืองแสงเพื่อการสอบสวนควบคุมบวก (DU0512A18) ในขณะที่พีเซลล์ donghaiense ทำเครื่องหมายโดย DP0587A ไม่ได้แสดงการเรืองแสงใด ๆ เซลล์ที่มีป้ายกำกับ DP0602A และ DP0512A แสดงมากหรือน้อยเรืองแสงเข้มข้นเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุมการสอบสวนการติดฉลากบวกตามลำดับ การวิเคราะห์เชิงปริมาณต่อไปของความเข้มของการเรืองแสงของเซลล์ที่มีป้ายกำกับฟิวส์ที่แตกต่างกันมีการแสดงในรูปที่ 2. เห็นได้ชัดว่าความเข้มของการเรืองแสงของเซลล์ติดฉลาก DP0443A อย่างมีนัยสำคัญอย่างเข้มข้นมากขึ้น (p <0.05) กว่าที่ของเซลล์ที่มีเครื่องหมายอื่น ๆ โดย LSU rRNA กำหนดเป้าหมาย probes.Based กับผลการวิจัยเหล่านี้ DP0443A อาจถือได้ว่าเป็นที่ดีที่สุดในดีเอ็นเอเหล่านี้ได้รับการออกแบบ ฟิวส์ ดังนั้นเราสังเคราะห์สอบสวน PNA (PP0443A) ที่มีลำดับเบสเดียวกันเพื่อ DP0443A และนำมาใช้ให้มันผสมพันธุ์กับพี donghaiense เป็นที่คาดหวัง PNA สอบสวน PP0443A ที่มีป้ายกำกับเซลล์ donghaiense พีที่มีการเรืองแสงเข้มข้นมากขึ้นกว่าการควบคุมในเชิงบวกและ DP0443A (รูปที่ 1). นอกจากนี้ยังมีความแตกต่างในความเข้มเรืองแสงระหว่างพวกเขาอย่างมีนัยสำคัญ (p <0.05) (รูป. 2) ดังนั้นเราจึงได้รับการสอบสวน PNA เหมาะสำหรับการตรวจจับปลาพี donghaiense