Molecular analysesPlants that prese

Molecular analyses
Plants that presented a positive reaction to the GUS histochemical test were used for total DNA extraction. Extractions were made from plantlets cultivated in vitro and also from greenhousecultivated plants.
Seven pairs of primers were chosen in order to analyse the quality of the DNA and the structure of the integrated T-DNA.
These primers defined various sequence domains of the plasmid (Fig. 1A).
Another pair of primers were used to test the presence of residual bacteria by amplification of the virD2 gene from the
virulence plasmid. Amplifications were performed on 25 ng of genomic DNA in a final volume of 50 ml containing 1!PCR
(polymerase chain reaction) buffer, primers and Taq DNA polymerase, as recommended by the manufacturer (Stratagene).
Forty cycles of amplification were performed (94 7C, 1 min; Thyb, 1 min; 72 7C, 2 min), where Thyb was specific for each pair of primers.
A predenaturation step of 3 min and a final elongation step of 7min were used.
The amplification products were observed by electrophoresis on 1% agarose gels stained by ethidium bromide.
Total DNA (5 mg) was digested with SspI, BglII and ScaI (10 U/mg). Standard methodology (Sambrook et al. 1989) was
used to separate DNA on a 0.7% agarose gel in tris-borate-EDTA buffer; it was then transferred to a Hybond Nc
membrane (Appligene) and hybridised with a-[32P]-labelled DNA probes using the random priming labelling method (Feinberg and Volgestein 1983). The pEF probe, corresponding to the EF1a promoter, was used for this analysis (Fig. 1B).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ระดับโมเลกุลพืชที่แสดงปฏิกิริยาเชิงบวกเพื่อทดสอบ histochemical กัส ถูกใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอทั้งหมด สกัดจาก plantlets ปลูกในหลอดทดลอง และ จากพืช greenhousecultivated ทำคู่ที่เจ็ดของไพรเมอร์ถูกเลือกเพื่อวิเคราะห์คุณภาพของดีเอ็นเอและโครงสร้างของดีเอ็นเอรวม Tไพรเมอร์เหล่านี้กำหนดโดเมนลำดับต่าง ๆ ของ plasmid (รูปที่ 1A) ไพรเมอร์คู่อื่นใช้ในการทดสอบของแบคทีเรียตกค้าง โดยการขยายของยีน virD2 จากการplasmid ความรุนแรง Amplifications ได้ดำเนินการใน 25 ฉบับของดีเอ็นเอที่ออกในปริมาณสุดท้ายของ 50 มล.ประกอบด้วย 1 PCRบัฟเฟอร์ (ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส) ไพรเมอร์ และ Taq DNA พอลิเม อเรส แนะนำ โดยผู้ผลิต (Stratagene) ดำเนินการขยายสี่สิบรอบ (94 7 c, 1 นาที Thyb, 1 นาที 7 c 72, 2 นาที), ที่ไหนเฉพาะสำหรับแต่ละคู่ของไพรเมอร์ Thyb ใช้ขั้นตอน predenaturation 3 นาทีและ 7 นาทีขั้นสุดท้ายยืด ผลิตภัณฑ์ขยายถูกตั้งข้อสังเกต โดยอิบน 1% agarose เจที่เปื่อนโบรไมด์ ethidiumดีเอ็นเอทั้งหมด (5 มิลลิกรัม) ถูกย่อย SspI, BglII และ ScaI (10 U มิลลิกรัม) เป็นวิธีมาตรฐาน (Sambrook et al. 1989)ใช้ในการแยกดีเอ็นเอบน agarose เจล 0.7% ในทริสเรทติ้ง-borate-EDTA บัฟเฟอร์ มันแล้วโอนย้ายไปเป็น Nc Hybondเมมเบรน (Appligene) และ hybridised ด้วยการ- [32P] -ปิดฉลากดีเอ็นเอโพรบใช้ด้วยสุ่มที่ติดฉลากวิธี (Feinberg และ Volgestein 1983) หัววัด pEF ที่สอดคล้องกับโปรโมเตอร์ EF1a ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์นี้ (รูปที่ 1B)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์โมเลกุลพืชที่แสดงปฏิกิริยาในเชิงบวกต่อการทดสอบเอกัสถูกใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอทั้งหมด สกัดได้จากต้นที่ปลูกในหลอดทดลองและจาก greenhousecultivated พืชเจ็ดคู่ไพรเมอร์ที่ถูกเลือกเพื่อวิเคราะห์คุณภาพของดีเอ็นเอ และโครงสร้างของแบบ t-dna .ไพรเมอร์เหล่านี้กำหนดโดเมนลำดับต่าง ๆ ของพลาสมิด ( รูปที่ 1A )อีกคู่ของไพรเมอร์เพื่อใช้ทดสอบการตกค้างของแบคทีเรีย โดยเพิ่มปริมาณยีน vird2 จากภัยสังคมพลาสมิด amplifications จำนวน 25 นาโนดีเอ็นเอในหมวดสุดท้าย 50 ml ประกอบด้วย 1 ดีเอ็นเอ( ปฏิกิริยาลูกโซ่ ) บัฟเฟอร์ ดีเอ็นเอดีเอ็นเอพอลิเมอเรสได้ดีและเป็นที่แนะนำโดยผู้ผลิต ( stratagene )สี่สิบรอบขยาย ( 94 จำนวน 5 , 1 นาที ; thyb 1 นาที ; 72 , 5 , 2 นาที ) ที่ thyb คือที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแต่ละคู่ของไพรเมอร์ .เป็น predenaturation ขั้นตอนที่ 3 มิน และขั้นตอนสุดท้ายของการ 7min มาใช้ผลิตภัณฑ์โดยการเพิ่มจำนวนโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสบน 1% , เจลสีทิเดียมโบรไมด์ .ดีเอ็นเอทั้งหมด ( 5 มิลลิกรัม ) ถูกย่อยด้วย bglii ไอพีสตาร์และ , scai ( 10 U / mg ) วิธีการมาตรฐาน ( sambrook et al . 2532 ) คือใช้แยก DNA 0.7% เจลในบริษัทบอเรท EDTA บัฟเฟอร์ มันถูกโอนไปยัง hybond NCเมมเบรน ( appligene ) และ hybridised ด้วย - [ ] - labelled probes 32p ดีเอ็นเอโดยใช้วิธีสุ่มปิดฉลากและไล่ลม ไฟน์เบิร์ก volgestein 1983 ) วัน PEF Probe ที่สอดคล้องกับ ef1a promoter , วิเคราะห์นี้ ( รูปที่ 1A )