2.7. Real-time RT-PCR assay and seq

2.7. Real-time RT-PCR assay and sequencing analysis
To evaluate the real-time RT-PCR, 69 RNA shrimp samples that had been tested by nested RT-PCR were used for detection of CMNV by real-time RT-PCR. The real-time RT-PCR was performed on ABI 7300 Real time PCR System (Applied Biosystem). The reaction mixture contained 1 μl of cDNA, 2 μl of master mix (5 × HOT FIREpol Probe qPCR Mix Plus (ROXX) (Solis Biodyne, Tartu, Estonia), 0.25 μl of each primer at a concentration of 10 μM (Table 1), and 6.5 μl of water, for a final reaction volume of 10 μl. The shrimp samples were evaluated in triplicate for each mixture. A 10-fold dilution of pCMNV was used as a standard in the same condition. The standard curves were evaluated in duplicate for each mixture tested. The cycling consisted of 15 min at 95 °C followed by 40 cycles of 95 °C for 30 s and 60 °C for 1 min. The data were analyzed using the 7300 Real Time PCR software. To confirm the TaqMan assay results, the real-time PCR products were subjected to electrophoresis on 1.5% agarose gel and photographed.
For sequencing, the CMNV-positive RNA sample from shrimp was amplified and purified using the GenepHlow Gel/PCR kit (Geneaid Biotech, New Taipei City, Taiwan) then sequenced with an automated DNA sequencer, the ABI Prism 3730xl genetic analyzer (Applied Biosystems) at Bio Basic Inc. in Canada. A basic local alignment search tool (BLAST) search was used to align the sequence of the CMNV PCR product with the NCBI database

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7 แบบเรียลไทม์ RT-PCR assay และการวิเคราะห์ลำดับการประเมินการแบบเรียลไทม์ RT-PCR ตัวอย่างกุ้ง RNA 69 ที่ได้รับการทดสอบ โดยซ้อนกัน RT-PCR ถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจหา CMNV โดยแบบเรียลไทม์ RT-PCR RT-PCR แบบเรียลไทม์ทำ ABI 7300 จริงเวลาระบบ PCR (ใช้ Biosystem) ส่วนผสมของปฏิกิริยาอยู่ 1 μl ของ cDNA, μl 2 ของส่วนผสมหลัก (5 ×โพรบ FIREpol ร้อน qPCR ผสมบวก (ROXX) (เที่ยว Biodyne ตาร์ตู เอสโทเนีย), 0.25 μl แต่ละพื้นที่ความเข้มข้น 10 μ m (ตาราง 1), และ 6.5 μl น้ำ 10 μl ระดับปฏิกิริยาสุดท้าย ตัวอย่างกุ้งถูกประเมินลข้อสำหรับแต่ละส่วนผสม การเจือจาง 10-fold ของ pCMNV ถูกใช้เป็นมาตรฐานในเงื่อนไขเดียวกัน เส้นโค้งมาตรฐานถูกประเมินในซ้ำสำหรับแต่ละส่วนผสมที่ผ่านทดสอบ ขี่จักรยานประกอบด้วย 15 นาทีที่ 95 ° C ตาม ด้วย 40 รอบ 95 ° c สำหรับ 30 s และ 60 ° C เป็นเวลา 1 นาที ข้อมูลที่ได้วิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์เวลาจริง PCR 7300 เพื่อยืนยันผลการทดสอบ TaqMan ผลิตภัณฑ์ PCR แบบเรียลไทม์การอิบนเจล 1.5% agarose และถ่ายภาพสำหรับ sequencing ตัวอย่างบวก CMNV RNA จากกุ้งถูกขยาย และบริสุทธิ์โดยใช้ชุด GenepHlow เจล/PCR (Geneaid เทคโนโลยีชีวภาพ ใหม่ไทเป ไต้หวัน) แล้วเรียงลำดับกับซีเควนมีดีเอ็นเออัตโนมัติ ตัวปริซึม ABI 3730xl พันธุกรรมวิเคราะห์ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ที่ชีวภาพพื้นฐาน Inc. ในแคนาดา ค้นหาเครื่องมือ (ระเบิด) ค้นหาตำแหน่งพื้นฐานท้องถิ่นใช้ในการจัดลำดับผลิตภัณฑ์ CMNV PCR กับฐานข้อมูล NCBI

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 แบบ Real-time RT-PCR การทดสอบและการวิเคราะห์ลำดับ
เพื่อประเมินแบบ real-time RT-PCR, 69 ตัวอย่างกุ้งอาร์เอ็นเอที่ได้รับการทดสอบโดยซ้อนกัน RT-PCR ถูกนำมาใช้ในการตรวจหา CMNV โดยแบบ real-time RT-PCR เวลาจริง RT-PCR ได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับ ABI 7300 เวลาจริงระบบ PCR (Applied Biosystem) ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 1 ไมโครลิตรของยีน 2 ไมโครลิตรผสมโท (5 × HOT FIREpol Probe qPCR ผสมพลัส (ROXX) (Solis Biodyne, Tartu, เอสโตเนีย), 0.25 ไมโครลิตรของแต่ละไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้น 10 ไมครอน A (ตารางที่ 1) และ 6.5 ไมโครลิตรน้ำสำหรับปริมาณการเกิดปฏิกิริยาสุดท้ายของ 10 ไมโครลิตร. ตัวอย่างกุ้งได้รับการประเมินในเพิ่มขึ้นสามเท่าสำหรับแต่ละส่วนผสมก. เจือจาง 10 เท่าของ pCMNV ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานในสภาพเดียวกัน. โค้งมาตรฐานได้รับการประเมินใน ซ้ำสำหรับแต่ละส่วนผสมทดสอบ. ขี่จักรยานประกอบด้วย 15 นาทีที่ 95 ° C ตามด้วย 40 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที. วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ 7300 Real Time PCR. ในการยืนยัน ผลการ TaqMan ทดสอบผลิตภัณฑ์ PCR แบบ real-time ถูกยัดเยียดให้ electrophoresis บน agarose gel ที่ 1.5% และถ่ายภาพ.
สำหรับลำดับตัวอย่าง RNA CMNV บวกจากกุ้งถูกขยายและบริสุทธิ์โดยใช้ชุด GenepHlow เจล / PCR (Geneaid ไบโอเทค, นิวไทเป City, Taiwan) แล้วติดใจกับซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติวิเคราะห์ทางพันธุกรรม ABI Prism 3730xl (Applied Biosystems) ในขั้นพื้นฐานชีวภาพ Inc ในประเทศแคนาดา พื้นฐานเครื่องมือในการค้นหาการจัดตำแหน่งในท้องถิ่น (BLAST) ค้นหาถูกใช้ในการจัดลำดับของผลิตภัณฑ์ CMNV PCR ที่มีฐานข้อมูล NCBI

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . เวลาจริงนี้ในการวิเคราะห์ลำดับเพื่อประเมินวิธีเรียลไทม์ , 69 อาร์เอ็นเอตัวอย่างกุ้งที่ได้รับการทดสอบโดยวิธีที่ใช้กันเพื่อการ cmnv โดยวิธี RT-PCR ) แบบเรียลไทม์ RT-PCR แบบเรียลไทม์ คือใช้ระบบ Real Time PCR ABI 7300 ( biosystem ประยุกต์ ) ปฏิกิริยาผสมอยู่ 1 μ L ของยีน 2 μ l Master Mix ( 5 ×ร้อน firepol โพรบ qpcr มิกซ์ พลัส ( Roxx ) ( โซลิส biodyne Tartu , เอสโตเนีย , μ ) 0.25 ลิตรแต่ละ primer ความเข้มข้น 10 μ M ( ตารางที่ 1 ) และμ 6.5 ลิตรน้ำสำหรับ ปริมาตรปฏิกิริยาสุดท้าย 10 μลิตรกุ้งจำนวนประเมินทั้งสามใบแต่ละส่วนผสม เป็น 10 เท่า ( ของ pcmnv ถูกใช้เป็นมาตรฐานในเงื่อนไขเดียวกัน เส้นโค้งมาตรฐานประเมินซ้ำในแต่ละส่วนผสมที่ผ่านการทดสอบ การขี่จักรยานเป็น 15 นาทีที่ 95 องศา C ตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 30 และ 60 องศา C เป็นเวลา 1 นาที วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ 7300 เวลา PCR จริงซอฟต์แวร์ เพื่อยืนยันผลการทดสอบ taqman ผลิตภัณฑ์ PCR แบบเรียลไทม์ได้รับเรสในเจล ( 1.5% และถ่ายภาพสำหรับการติดตาม , cmnv บวก RNA จากตัวอย่างกุ้ง อัตรา และสามารถใช้ genephlow เจล PCR Kit ( geneaid เทคโนโลยีชีวภาพ เมืองไทเป , ไต้หวัน ) แล้วทำการด้วย DNA sequencer แบบอัตโนมัติ , ABI ปริซึม 3730xl พันธุกรรมวิเคราะห์ ( Applied Biosystems ) ที่ Bio พื้นฐาน ในแคนาดา เป็นเครื่องมือค้นหาการปรับพื้นฐานท้องถิ่น ( ระเบิด ) ค้นหาถูกใช้เพื่อจัดลำดับ cmnv PCR กับ ncbi ฐานข้อมูลสินค้า