PHB analysesFor analyses on PHB pro

PHB analyses
For analyses on PHB production cultures were grown in
NH4
+ containing medium, washed in nitrogen-free
medium and transferred to NO3
- containing medium for
7 days. Cells were harvested (1500 × g, 10 min), washed
with phosphate buffered saline (PBS) and lyophilized for
24 hours. The PHB contents of the cells were determined
upon methanolysis of 5 to 10 mg lyophilized cells
in presence of 2 ml methanol/sulfuric acid (85:15, v/v)
and 2 ml chloroform. The resulting methyl esters of 3-
hydroxybutyrate were analysed by gas chromatography
using an Agilent 6850 GC (Agilent Technologies, Waldbronn,
Germany) as described previously [28,29].
Fluorescence and electron microscopy
In vivo localization of GFP fusion proteins was analysed
with a confocal laser scanning microscope Leica TCS
SP2 using a HCX PLAPO 63x/1.32-0.6 oil Ph3 CS
objective. GFP, chlorophyll and Nile Red were excited at
488 nm, and fluorescence was detected at a bandwidth
of 500-520 nm, 680-720 nm and 580-600 nm, respectively.
For electron microscopic analyses, cells were centrifuged
at 2000 × g for 5 min followed by cryo-fixation
and resin embedding. The samples were high-pressure
frozen in a Leica EM-PACT 2 and subsequently freeze
substituted (Leica EM AFS 2; Leica, Vienna, Austria)
with pure acetone containing 2% (w/v) osmium tetroxide,
0.1% (w/v) uranyl acetate and 5% (v/v) H2O. Freeze
substitution was carried out at -90°C for 4 h, -60°C for
8 h, -30°C for 8 h and held at 0°C for 3 h with a heating
time of 1 h in between each step. After washing the
samples with ice cold acetone for three times and infiltration
in Epon 812 (Ted Pella, Inc., USA) for 24 h, the
resin was polymerized at 60°C for 72 h. Ultrathin sections
were cut with a Leica Ultracut (Leica, Vienna,
Austria), mounted on uncoated 400 mesh copper grids
and post-stained with 2% (w/v) uranyl acetate for 20
min and 0.5% (w/v) lead citrate for 1 min. Transmission
electron microscopy was carried out on a JEOL 2100
TEM operated at 80 kV in combination with a fast-scan
2 k × 2 k CCD camera F214 (TVIPS, Gauting,
Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PHB วิเคราะห์
วิเคราะห์เกี่ยวกับวัฒนธรรมการผลิต PHB ถูกปลูกใน

NH4 ที่มีขนาดกลางล้างในไนโตรเจนฟรี
ขนาดกลางและโอนไปยัง NO3
- มีสื่อกลางในการ
7 วัน เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยว (1500 ×กรัม, 10 นาที), ล้าง
ด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS) และแห้งเพื่อ
24 ชั่วโมง PHB เนื้อหาของเซลล์ที่ได้รับการพิจารณา
เมื่อ methanolysis ของ 5 ถึง 10 มิลลิกรัมเซลล์แห้ง
ในการปรากฏตัวของเมทานอล 2 มล. / กรดกำมะถัน (85:15, v / v)
2 มล. คลอโรฟอร์ม ส่งผลให้เอสเทอเมธิลจาก 3 - ไฮดรอกซี
ถูกวิเคราะห์โดยแก๊ส chromatography
ใช้ agilent 6850 GC (เทคโนโลยี agilent, Waldbronn, เยอรมนี
) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [28,29]
เรืองแสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
ในร่างกายของฟิวชั่น จำกัด gfp. โปรตีนที่ได้รับการวิเคราะห์
ด้วย confocal TCS เลเซอร์สแกนกล้องจุลทรรศน์ LEICA
sp2 ใช้ HCx plapo 63x/1.32-0.6 PH3 น้ำมัน cs
วัตถุประสงค์ GFP คลอโรฟิลและแม่น้ำไนล์สีแดงรู้สึกตื่นเต้นที่
488 นาโนเมตรและเรืองแสงได้รับการตรวจพบในแบนด์วิดธ์ของ
500-520 นาโนเมตร 680-720 นาโนเมตรและ 580-600 นาโนเมตรตามลำดับ.
วิเคราะห์อิเล็กตรอนกล้องจุลทรรศน์เซลล์ถูกปั่น
ที่ 2000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วยการแช่ในการตรึง
และฝังเรซินตัวอย่างมีแรงดันสูง
แช่แข็งใน LEICA em-สัญญาที่ 2 และต่อมาหยุด
แทน (LEICA em AFS 2; LEICA, เวียนนา, ออสเตรีย)
ด้วยอะซิโตนบริสุทธิ์ที่มี 2% (w / v) tetroxide ออสเมียม
0.1% (w / v) อะซีเตต uranyl และ 5% (v / v) h2o แช่แข็ง
ทดแทนได้ดำเนินการที่ -90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 ชั่วโมง -60 ° C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง
-30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 ชั่วโมงและจัดขึ้นที่ 0 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 ชั่วโมงด้วยความร้อน
เวลา 1 ชั่วโมงในระหว่าง ในแต่ละขั้นตอนหลังจากล้าง
ตัวอย่างด้วยน้ำแข็งอะซิโตนเย็นสามครั้งและการแทรกซึม
ใน EPON 812 (ted pella, inc. usa) เวลา 24 ชั่วโมง,
เรซินเป็น polymerized ที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมง ส่วนบางเฉียบ
ถูกตัดด้วย ultracut LEICA (LEICA, เวียนนา, ออสเตรีย
) ติดตั้งอยู่บนเคลือบผิว 400 กริดทองแดงตาข่าย
และหลังการย้อมสีมี 2% (w / v) อะซีเตต uranyl 20
นาทีและ 0.5% (w / v) ซิเตรตนำ 1 นาที ส่ง
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนได้รับการดำเนินการใน JEOL 2100
Tem ทำงานที่ 80 กิโลโวลต์ร่วมกับการสแกนอย่างรวดเร็ว k
2 × 2 k ข้อมูล f214 กล้อง (tvips, Gauting, เยอรมนี
)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิเคราะห์ PHB
สำหรับวิเคราะห์ใน PHB ผลิตวัฒนธรรมถูกปลูกใน
NH4
ประกอบด้วยกลาง ล้างในไนโตรเจนฟรี
กลาง และโอนย้ายการ NO3
- มีขนาดกลางสำหรับ
วัน เซลล์ถูก harvested (1500 × g, 10 นาที) , ล้าง
กับฟอสเฟต buffered น้ำเกลือ (PBS) และ lyophilized สำหรับ
24 ชั่วโมง เนื้อหา PHB ของเซลล์ถูกกำหนด
เมื่อ methanolysis 5-10 มิลลิกรัม lyophilized เซลล์
ในของ 2 ml กรดกำมะถัน/เมทานอล (85:15, v/v)
และคลอโรฟอร์ม 2 ml Esters methyl ผลลัพธ์ 3-
hydroxybutyrate ได้ analysed โดย chromatography ก๊าซ
ใช้ GC มี 6850 Agilent (Agilent เทคโนโลยี Waldbronn,
เยอรมนี) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [28,29] .
Fluorescence และอิเล็กตรอน microscopy
แปลในสัตว์ทดลองของโปรตีน GFP ฟิวชั่นถูก analysed
ด้วยเลเซอร์ confocal สแกนกล้องจุลทรรศน์ไล TCS
SP2 ใช้เป็นน้ำมัน 63x/1.32-0.6 PLAPO อื่น ๆ HCX Ph3 CS
วัตถุประสงค์ GFP คลอโรฟิลล์ และไนล์เรดได้ตื่นเต้นที่
488 nm และ fluorescence พบที่แบนด์วิธการ
500-520 nm, 680-720 nm และ 580-600 nm ตามลำดับ.
สำหรับวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน เซลล์ถูก centrifuged
ที่ 2000 × g สำหรับ 5 นาทีตาม ด้วย cryo เบี
และเรซิ่นฝัง ตัวอย่างมีความดันสูง
ในไล EM-สนธิสัญญา 2 และตรึงต่อ
แทน (ไล EM ไปศึกษา 2 ไลก้า เวียนนา ออสเตรีย)
ด้วยอะซีโตนบริสุทธิ์ tetroxide,
0.1% (w/v) 2% (w/v) ออสเมียม uranyl acetate และ 5% (v/v) H2O ตรึง
แทนได้ดำเนินการใน-90 ° C สำหรับ 4 h,-60 ° C สำหรับ
8 h,-30 ° C สำหรับ 8 จัดขึ้นที่ 0 ° C สำหรับ h 3 กับให้ความร้อน และ h
เวลา h 1 ระหว่างแต่ละขั้นตอน หลังจากซักผ้า
ตัวอย่าง ด้วยอะซีโตนน้ำแข็งเย็นสำหรับครั้งที่สามและแทรกซึม
ใน 812 Epon (Ted Pella, Inc., USA) ใน 24 ชม
ยางถูก polymerized ที่ 60° C สำหรับส่วน Ultrathin 72 h.
ถูกตัดกับ Ultracut ไล (ไล เวียนนา,
ออสเตรีย), เมาท์บนกริด 400 ตาข่ายทองแดงเคลือบ
และหลังสี มี 2% (w/v) uranyl acetate สำหรับ 20
min และ 0.5% (w/v) นำซิเตใน 1 นาทีส่ง
microscopy อิเล็กตรอนถูกดำเนินการบน JEOL 2100
ยการดำเนินที่ 80 kV ร่วมกับการสแกนอย่างรวดเร็ว
2 k × 2 k CCD กล้อง F214 (TVIPS, Gauting,
เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์ phb
ซึ่งจะช่วยในการวิเคราะห์ในวัฒนธรรมการผลิต phb เติบโตใน

NH 4 ประกอบด้วยขนาดกลางทาสในไนโตรเจน - แบบไม่เสียค่าบริการ
ขนาดกลางและจะพาท่านไปส่งยังไม่มี 3
- -
มีขนาดกลางสำหรับ 7 วัน เซลล์ก็เก็บเกี่ยว( 1500 × G 10 นาที)ล้าง
พร้อมด้วยแบบเต็มบัฟเฟอร์ฟอสเฟตน้ำเกลือ( PBS )และ lyophilized สำหรับ
24 ชั่วโมง เนื้อหา phb ของเซลล์ที่มีกำหนด
เมื่อ methanolysis 5 ถึง 10 เซลล์ lyophilized มก.
ในการประชุมของ 2 โรงงานเมธานอลมล./กรดซัลฟูริก( 85 : 15 v / v )
และ 2 ยุคต้นๆมล. ส่งผลให้ได้ผลิต Methyl esters 3 -
hydroxybutyrate ก็วิเคราะห์โดยก๊าซ chromatography
การใช้, Agilent , 6850 GC (, Agilent ,เทคโนโลยี, waldbronn ,
เยอรมนี)ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[ 28,29 ].
คุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซและอิเลคตรอน
ซึ่งจะช่วยการตรวจวิเคราะห์สารเคมีในการแปลเอกสารข้อมูลไปยังสถานี Vivo gfp การผสมผสานของโปรตีนก็วิเคราะห์
พร้อมด้วยการสแกนเลเซอร์ confocal กล้องจุลทรรศน์ leica tcs
SP 2 โดยใช้น้ำมัน HCx plapo 63 x / 1.32-0.6 ที่ pH 3 CS
วัตถุประสงค์ gfp ,คโล - โระฟิลและแม่น้ำ Nile สีแดงก็รู้สึกตื่นเต้นที่
488 nm ,และคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซมีการตรวจพบที่แบนด์วิดธ์
ของ 500-520 nm , 680-720 nm และ 580-600 nm ,ตามลำดับ.
สำหรับอิเลคตรอนขนาดเล็กซึ่งทำการวิเคราะห์,เซลล์เป็น centrifuged
ที่ 2000 × G สำหรับ 5 นาทีตามด้วย CRYO แปลว่า - ที่ยึด
เรซินและฝังตัว.ตัวอย่างมีแรงดันสูง
แช่แข็งใน leica EM - สัญญา 2 และต่อมาแช่แข็ง
แทน( leica EM แผ่นกรอง AFS 2 ; leica ,เวียนนา,ออสเตรีย)
ด้วยบริสุทธิ์อะซีโทนที่มี 2% ( w / v )ออสเมียม tetroxide ,
0.1% ( w / v ) uranyl เกลือของกรดน้ำส้มและ 5% ( v / v ) H 2 O แช่แข็ง
การทดแทนเป็นการกระทำที่ -90 ° C สำหรับ 4 ชั่วโมง, - 60 ° C สำหรับ
8 H , - 30 ° C สำหรับ 8 ชั่วโมงและจัดขึ้นที่ 0 ° C สำหรับ 3 ชั่วโมงพร้อมด้วยเครื่องทำความร้อน
เวลา 1 ชั่วโมงในระหว่างการวิ่งแต่ละขั้นตอน.หลังจากล้างทำความสะอาด
ตัวอย่างที่มีน้ำแข็งเย็นอะซีโตนสำหรับสามแทรกซึมและเวลา
ใน epon 812 (เท็ด Pella Corporation , Inc ., USA )สำหรับ 24 ชั่วโมง
เรซินที่เป็น polymerized ที่ 60 ° C สำหรับ 72 ชั่วโมง ultrathin ส่วน
ก็ถูกตัดด้วย leica ultracut ( leica ,เวียนนา,
ออสเตรีย),ติดตั้งบน uncoated 400 ตาข่ายทองแดงเครือข่าย
และหลังแต้มสีพร้อมด้วย 2% ( w / v ) uranyl เช่นอะคีเทต 20
นาทีและ 0.5% ( w / v )นำ citrate สำหรับ 1 นาทีการส่ง
การตรวจวิเคราะห์สารเคมีอิเลคตรอนก็ถูกหามออกมาใน(ประธาน)ชั่วคราว jeol 2100
ที่ดำเนินการใน 80 kV ในการใช้งานร่วมกับอย่างรวดเร็ว - การสแกน
2 K × 2 K กล้อง CCD F 214 ( tvips gauting
เยอรมัน)