ACC deaminase enzyme activity and I

ACC deaminase enzyme activity and IAA production determination in the presence of heavy metals

ACC deaminase enzyme activity and indole-3 acetic acid production were simultaneously determined in a liquid culture by using a heavy metal (either Cu, Pb, As, Ni, Cr, Cd, or Mn). Bacteria were cultivated in Luria Bertani broth for 24 h at 30 °C and 800 rpm. Later on, the culture was centrifuged at 9000g for 10 min, and the pellet was resuspended in BPF medium until 0.5 absorbance at 600 nm was obtained, equal to 1 × 109 bacteria mL−1. In 10 mL of BPF medium, a 100 μL sample was added to the bacterial suspension and was incubated for 24 h under the same conditions (30 °C and 800 rpm). After that, the bacterial culture was centrifuged at 9000g for 10 min. The pellets were washed twice with 5 mL of buffer Tris–HCl 0.01 M (pH 7.5), and were resuspended in 1 mL of salt minimal medium SM (composition L−1: KH2PO4, 0.4 g, K2HPO4, 2 g, MgSO4, 0.2 g, CaCl2, 0.1 g, FeSO4, 0.005 g, H3BO3, 0.002 g, ZnSO4, 0.005 g, Na2Mo04·2H2O, 0.001 g, MnSO4, 0.003 g, CoSO4, 0.001 g, CuSO4, 0.001 g, NiSO4, 0.001 g, supplemented with glucose, 1 g, sucrose, 1 g, C2H3NaO2, 1 g, sodium citrate, 1 g, malic acid, 1 g, and mannitol, 1 g; pH 6.4). From the bacterial suspension in SM medium, 0.5 mL was taken and mixed with 2.5 mL of SMN medium (SM medium with 5 mM of methionine and 0.5 g of l-Triptophan) supplemented with 50 mg L−1 of heavy metal (either Cu, Pb, As, Ni, Cr, Cd, or Mn) (Belimov et al., 2005).

Bacteria were incubated for 24 h, and then they were centrifuged. The supernatant was saved and stored at 4 °C for later use. An aliquot of 1 mL of supernatant was taken and transferred to a test tube that contained 2 mL of Salkowski reagent. The mixture was kept in room temperature for 30 min (Gordon and Weber, 1951) to get a pink color. The mixture absorbance was measured at 530 nm and the IAA concentration was determined by comparing the sample absorbance with a calibration curve of pure IAA as standard.

On the other hand, the pellet that was obtained from centrifugation was resuspended in 1 mL of buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) and then was centrifuged at 9000g for 10 min. The pellet was resuspended in 600 μL of buffer 0.1 M Tris–HCl (pH 8.5) and 30 μL of toluene. From the cell suspension, 100 μL was taken and mixed with 10 μL of ACC solution 0.5 M and 100 μL of buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5). The reaction mixture was incubated at 30 °C for 30 min. Then, 1 mL 0.56 N HCl was added to the reaction mixture and it was centrifuged at 14,000g for 5 min. 400 μL of 0.56 N HCl and 150 μL of 0.2% of 2,4-dinitrophenylhydrazine in 2 N HCl were taken and mixed with 500 μL of supernatant. The mixture was reacted for 30 min at 30 °C and, in order to stop reaction, 1 mL of 2 N NaOH was added, and its optic density was measured at 540 nm (Belimov et al., 2005)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เอนไซม์ ACC deaminase และ IAA ความมุ่งมั่นการผลิตในโลหะหนักACC deaminase เอนไซม์และกรดอินโดล-3 การผลิตพร้อมกันถูกวัฒนธรรมของเหลว โดยใช้โลหะหนัก (ทั้ง Cu, Pb เป็น Ni, Cr ซีดี หรือ Mn) แบคทีเรียถูกปลูกในซุป Luria Bertani สำหรับ 24 ชั่วโมง ที่ 30 ° C และ 800 rpm ภายหลังเมื่อ วัฒนธรรมคือผลิตภัณฑ์ที่ 9000g 10 นาที และเม็ดถูก resuspended ใน BPF ปานกลางจนถึง 0.5 ค่าที่ 600 นาโนเมตรคือ ได้รับ เท่ากับ 1 × 109 แบคทีเรีย mL−1 10 ml ของ BPF กลาง ตัวอย่าง 100 μL ถูกระงับแบคทีเรีย และ incubated 24 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน (30 ° C และ 800 rpm) หลังจากนั้น วัฒนธรรมจากแบคทีเรียถูกจากที่ 9000g 10 นาที เม็ดถูกล้างสองครั้ง ด้วย 5 mL ของบัฟเฟอร์ทริสเรทติ้ง – HCl 0.01 M (pH 7.5), และได้ resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของ SM ปานกลางเกลือน้อยที่สุด (องค์ประกอบ L−1: KH2PO4, 0.4 กรัม K2HPO4, 2 g, MgSO4, 0.2 g, CaCl2, 0.1 g, FeSO4, 0.005 g, H3BO3, 0.002 g, ZnSO4, 0.005 g, Na2Mo04·2H2O, 0.001 g, MnSO4, 0.003 g, CoSO4, 0.001 g, CuSO4 , 0.001 g, NiSO4, 0.001 g เสริม ด้วยกลูโคส 1 กรัม ซูโครส 1 ก. C2H3NaO2, 1 กรัม โซเดียมซิเตรต 1 กรัม กรด 1 กรัม และ mannitol, 1 g pH 6.4) จากระงับแบคทีเรียใน SM, 0.5 mL นำมา และผสมกับ 2.5 มล.ของ SMN กลาง (กลาง SM กับ 5 มม. ของ methionine และ 0.5 กรัมของ l-Triptophan) เสริม ด้วย 50 มก. L−1 ของโลหะหนัก (ทั้ง Cu, Pb เป็น Ni, Cr ซีดี Mn) (Belimov et al. 2005)แบคทีเรียได้รับการกก 24 ชม. และพวกเขาจากนั้น Supernatant ถูกบันทึก และเก็บไว้ที่ 4 ° C ใช้ในภายหลัง ส่วนลงตัวของ 1 มล.ของ supernatant ถูกถ่าย และโอนย้ายไปหลอดที่อยู่ 2 มล.ของสาร Salkowski ส่วนผสมถูกเก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง 30 นาที (กอร์ดอนและเวเบอร์ 1951) เพื่อให้ได้สีชมพู โดยวัดค่าส่วนผสมที่ 530 nm และ IAA ความเข้มข้นที่ถูกกำหนด โดยการเปรียบเทียบค่าตัวอย่างโค้งสอบเทียบของ IAA บริสุทธิ์เป็นมาตรฐานบนมืออื่น ๆ เม็ดที่ได้รับจากการหมุนเหวี่ยงถูก resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ 0.1 M ทริสเรทติ้ง HCl (pH 7.5) แล้ว ก็จากที่ 9000g 10 นาที เม็ดถูก resuspended ใน μL 600 ของบัฟเฟอร์ 0.1 M ทริสเรทติ้ง – HCl (pH 8.5) และ μL 30 ของโทลูอีน จากระงับเซลล์ 100 μL ถูกนำมา และผสมกับ μL 10 ของ ACC μL 0.5 ม.และ 100 ของบัฟเฟอร์ 0.1 M ทริสเรทติ้ง HCl (pH 8.5) ส่วนผสมของปฏิกิริยา incubated ที่ 30 ° C 30 นาที , 1 mL 0.56 N HCl ถูกผสมปฏิกิริยาและได้ผลิตภัณฑ์ที่ 14,000 กรัมสำหรับ 5 นาที 400 μL ของ 0.56 N HCl แล้วถ่าย และผสมกับ μL 500 ของ supernatant 150 μL 0.2% ของ 2, 4-dinitrophenylhydrazine ในรายชื่อ HCl N 2 ส่วนผสมมีปฏิกิริยา 30 นาทีที่ 30 ° C เพิ่ม 1 มล.ของ 2 N NaOH เพื่อหยุดปฏิกิริยา และโดยวัดความหนาแน่นออปติกที่ 540 nm (Belimov et al. 2005)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แม็กเอนไซม์ deaminase และความมุ่งมั่นผลิต IAA ในการปรากฏตัวของโลหะหนักแม็กเอนไซม์ deaminase และ indole-3 การผลิตกรดอะซิติกได้รับการพิจารณาพร้อมกันในวัฒนธรรมของเหลวโดยใช้โลหะหนัก (เช่นทองแดงตะกั่วในฐานะที่เป็นนิกเกิลโครเมียมแคดเมียม หรือ MN) เชื้อแบคทีเรียที่ได้รับการปลูกฝังใน Luria Bertani น้ำซุปเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสและ 800 รอบต่อนาที ต่อมาเมื่อวัฒนธรรมถูกหมุนเหวี่ยงที่ 9000g เป็นเวลา 10 นาทีและเม็ดถูก resuspended ในระดับปานกลางจนถึง BPF 0.5 การดูดกลืนแสงที่ 600 นาโนเมตรได้รับเท่ากับ 1 × 109 แบคทีเรีย ML-1 ใน 10 มิลลิลิตรของกลาง BPF, ตัวอย่าง 100 ไมโครลิตรถูกเพิ่มลงในการระงับแบคทีเรียและถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน (30 ° C และ 800 รอบต่อนาที) หลังจากนั้นวัฒนธรรมแบคทีเรียถูกหมุนเหวี่ยงที่ 9000g เป็นเวลา 10 นาที เม็ดถูกล้างครั้งที่สองที่มีขนาด 5 ml ของบัฟเฟอร์ Tris-HCl 0.01 M (pH 7.5) และถูก resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของเกลือน้อยกลางเอสเอ็ม (องค์ประกอบ L-1: KH2PO4 0.4 กรัม K2HPO4 2 G, MgSO4 0.2 G, CaCl2 0.1 กรัม FeSO4, 0.005 กรัม H3BO3 0.002 กรัม ZnSO4, 0.005 กรัม Na2Mo04 · 2H2O, 0.001 กรัม MnSO4, 0.003 กรัม CoSO4, 0.001 กรัม CuSO 4, 0.001 กรัม NiSO4, 0.001 กรัมเสริม กับน้ำตาล 1 กรัม, น้ำตาล 1 กรัม, C2H3NaO2 1 กรัมโซเดียมซิเตรต 1 กรัมกรดมาลิก 1 กรัมและ mannitol 1 กรัม; ค่า pH 6.4) จากการระงับแบคทีเรียในสื่อ SM, 0.5 มลถูกนำมาผสมกับ 2.5 มิลลิลิตรของกลาง SMN (กลางเอสเอ็มที่มี 5 มิลลิเมตร methionine และ 0.5 กรัมของ L-Triptophan) เสริมด้วย L-1 ของโลหะหนัก 50 มก. (ทั้งทองแดง PB, As, Ni, Cr ซีดีหรือ MN) (Belimov et al., 2005). แบคทีเรียถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและจากนั้นพวกเขาก็ถูกเหวี่ยง ใสถูกบันทึกไว้และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสเพื่อใช้ในภายหลัง หารของ 1 มิลลิลิตรของสารละลายถูกนำตัวและโอนไปยังหลอดทดลองที่มี 2 มล Salkowski น้ำยา ส่วนผสมที่ถูกเก็บไว้ในอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที (กอร์ดอนและเวเบอร์ 1951) ที่จะได้รับสีชมพู ค่าการดูดกลืนส่วนผสมที่ถูกวัดที่ 530 นาโนเมตรและความเข้มข้นของ IAA ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบการดูดกลืนแสงตัวอย่างด้วยเส้นโค้งการสอบเทียบของ IAA บริสุทธิ์เป็นมาตรฐาน. บนมืออื่น ๆ เม็ดที่ได้รับจากการหมุนเหวี่ยงถูก resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ 0.1 M ทริสเรทติ้ง-HCl (pH 7.5) และจากนั้นได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 9000g เป็นเวลา 10 นาที เม็ดถูก resuspended ใน 600 ไมโครลิตรของ buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) และ 30 ไมโครลิตรของโทลูอีน จากเซลล์แขวนลอย 100 ไมโครลิตรถูกนำมาผสมกับ 10 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาแม็ก 0.5 M และ 100 ไมโครลิตรของ buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) ผสมปฏิกิริยาถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที จากนั้น 1 มิลลิลิตร 0.56 N HCl ถูกเพิ่มเข้ามาผสมปฏิกิริยาและมันก็หมุนเหวี่ยงที่ 14,000g เป็นเวลา 5 นาที 400 ไมโครลิตร 0.56 N HCl และ 150 ไมโครลิตร 0.2% ของ 2,4-dinitrophenylhydrazine 2 N HCl ถูกนำและผสมกับ 500 ไมโครลิตรของสารละลาย ส่วนผสมที่ถูกปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสและเพื่อหยุดปฏิกิริยา 1 มิลลิลิตร 2 N NaOH ที่เพิ่มขึ้นและความหนาแน่นของแก้วนำแสงของวัดที่ 540 นาโนเมตร (Belimov et al., 2005)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

บัญชีกิจกรรมของเอนไซม์และการทำแผนผลิต IAA ในการแสดงตนของโลหะหนักบัญชีกิจกรรมของเอนไซม์และ indole-3 ทำแผนการผลิตกรดได้พร้อมกันพิจารณาในอาหารเหลวโดยการใช้โลหะหนัก ( ให้ทองแดง , ตะกั่ว , นิกเกิล , โครเมียม , แคดเมียม , หรือ MN ) แบคทีเรียปลูกในลุเรียแบร์ตานิซุปเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 30 องศา C และ 800 รอบต่อนาที ต่อมาวัฒนธรรม เป็นระดับที่ 9000g เป็นเวลา 10 นาที และ เม็ด เป็น resuspended ในนำเข้าขนาดกลางจน 0.5 การดูดกลืนแสงที่ 600 nm ได้เท่ากับ 1 × 109 แบคทีเรีย ml − 1 ใน 10 มล. นำเข้าขนาดกลาง 100 μ l ตัวอย่างเพิ่มใน bacterial suspension และบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ( 30 ° C และ 800 รอบต่อนาที ) หลังจากนั้น แบคทีเรีย คือ ระดับที่ 9000g 10 นาทีล้าง 2 ครั้ง ด้วยอัตรา 5 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ทริส– HCl 0.01 M ( pH 7.5 ) , และ resuspended ใน 1 ml เกลือ minimal medium SM ( L − 1 : องค์ประกอบ kh2po4 0.4 กรัม k2hpo4 2 กรัม MgSO4 ใ , 0.2 กรัม ผลิต , 0.1 กรัม feso4 , 0.005 กรัม h3bo3 , 0.002 กรัม znso4 , 0.005 กรัม na2mo04 ด้วย 2H2O-dx 0.001 กรัม mnso4 0.003 กรัม , coso4 0.001 กรัม , CuSO4 , 0.001 กรัม niso4 0.001 กรัม เติมน้ำตาล 1 กรัม น้ำตาลทราย 1 กรัม c2h3nao2 1 กรัม โซเดียมซิเตรท , 1 G , กรด malic , 1 กรัม และแมนนิทอล 1 g ; พีเอช 6.4 ) จากการระงับแบคทีเรียใน SM ) 0.5 มล. ถูกผสมกับ 2.5 ml ของ SMN ขนาดกลาง ( SM ) กับ 5 มิลลิเมตรของเมทไธโอนีนและ 0.5 กรัม l-triptophan ) เสริมด้วย 50 mg L − 1 ( ทั้งทองแดง ตะกั่ว เป็นโลหะหนัก เช่น นิกเกิล , โครเมียม , แคดเมียม , หรือ MN ) ( belimov และ al . , 2005 )แบคทีเรียถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นทำการไฟฟ้า . และน่านถูกบันทึกและเก็บไว้ที่ 4 ° C เพื่อใช้ในภายหลัง เป็นส่วนลงตัวของ 1 มิลลิลิตร นำถูกโอนไปยังหลอดทดลองที่บรรจุ 2 กรัม salkowski เกิดปฏิกิริยา ส่วนผสมจะถูกเก็บไว้ในอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ( กอร์ดอนและ Weber , 1951 ) เพื่อให้ได้สีชมพู ส่วนผสมค่าวัดที่ 530 nm และ IAA ความเข้มข้นถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบตัวอย่างการดูดกลืนแสง ด้วยรูปโค้งของบริสุทธิ์ IAA เป็นมาตรฐานบนมืออื่น ๆ , เม็ดที่ได้จาก 3 เป็น resuspended ใน 1 มิลลิลิตร หรือบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 0.1 M HCl ( pH 7.5 ) และเป็นระดับที่ 9000g นาน 10 นาที เม็ดก็ resuspended 600 μ L ของบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 0.1 M HCl ( ทริส ) pH 8.5 ) และ 30 μ L ของโทลูอีน . จากเซลล์แขวนลอย , 100 μผมเอาผสมกับ 10 μล. แก้ปัญหาบัญชี 0.5 m และ 100 μ L ของบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 0.1 M HCl ( บริษัทพีเอช 8.5 ) ปฏิกิริยาผสมบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 30 นาที จากนั้น 1 ml ( N HCl เป็นเพิ่มปฏิกิริยาผสม และเป็นระดับที่ 14000g 5 นาที 400 μ l ( N HCl และ 150 μ l 0.2% ของ 2,4-dinitrophenylhydrazine 2 N HCl นำมาผสมกับนำμ 500 ล. . ส่วนผสมคือปฏิกิริยาสำหรับ 30 นาทีที่ 30 ° C และ เพื่อหยุดปฏิกิริยา 1 มิลลิลิตร เติม 2 N NaOH และความหนาแน่นของแสงวัด 540 nm ( belimov et al . , 2005 )