inorganic phosphate (Pi) liberation

inorganic phosphate (Pi) liberation between the two incubations was
ascribed to the activity of NKA. The reaction was started by the addition
of 5 μL Na2-ATP (5 mmol L−1) and continued for 15 min. The reaction
was ceased by the addition of an equal volume of perchloric acid
(0.8 mol L−1). The reaction mixture was centrifuged at 1200 g for
20 min at 4 °C. The PiBlue™ Phosphate Assay Kit (BioAssay Systems,
USA) was used to determine Pi concentration. Protein concentration
of homogenates was measured using the Bradford method. All
assays were performed in triplicate. NKA activity is expressed as
mmol Pi mg−1 protein h−1.
2.5. Immunohistochemistry
Immunohistochemical analyses of formalin fixed gill tissue sections
were prepared as per the methods presented in Reilly et al. (2011)
and Babonis et al. (2009). Specific details of Primary and Secondary
antibodies used in this study can be found in Table 1. Briefly, alcohol
preserved gill samples were dehydrated, embedded in paraffin wax,
sectioned at 6 μm and placed onto poly-L-lysine coated slides. Sections
were deparaffinised then rehydrated and blockedwith avidin and biotin
(0.01%, 15 min each) and normal goat serum (2% serum, 1% BSA, 0.1%
cold fish skin gelatin, 0.1% Triton X-100, 0.05% Tween-20, and 0.05%
thimerosal in 0.01 M PBS, pH 7.2) for 30 min at room temperature.
Primary antibodies were applied and the sections were incubated at
4 °C overnight in a humidified chamber. Biotinylated secondary
antibodies were then applied to sections followed by horseradish
peroxidise-labelled streptavidin (1:1000 in PBS; Vector Laboratories,
USA) for 30min each at room temperature. Chromogenic detectionwas
conducted using DAB (3,3′ diaminobenzidine tetrahydrochloride)
liquid substrate (Sigma Aldrich, Australia). Prepared slides of gill
sections were viewed and photographed using an Olympus BH-2
microscope with a Leica DFC290 camera.
2.6. NKAWestern blotting
Western Blottingwas performed as per Choe et al. (2005) to quantify
the relative abundances of NKA, specifically the α-subunit of the NKA
transporter complex (Wilson et al., 2007), in branchial tissue with respect
to environmental salinity. Due to the small amount of tissue available,
sufficient samples volumes were collected from only three animals
per treatment group. Tissues were homogenised and centrifuged and the
pellet resuspended in ice coldhomogenisation buffer (inmmol L−1: 250
sucrose, 30 Tris, 1 EDTA, 100 mg mL−1 phenylmethylsulfonyl fluoride,
5mgmL−1 protease inhibitor cocktail). An aliquot was removed for protein
quantification (Qubit, Life Technologies Australia). Six micrograms
ofproteinfromeachanimal ineachtreatment groupwas then combined

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ถูกปลดปล่อยอนินทรีย์ฟอสเฟต (Pi) ระหว่าง incubations สองascribed กิจกรรมของ NKA ปฏิกิริยาเริ่มต้น โดยการเพิ่มของ 5 μL Na2 ATP (5 mmol L−1) และสำหรับ 15 นาที ปฏิกิริยาถูกเพิ่ม โดยการเพิ่มปริมาตรการเท่ากันของกรด perchloric(0.8 โมล L−1) ส่วนผสมปฏิกิริยาถูก centrifuged ที่ 1200 g สำหรับ20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ชุดทดสอบฟอสเฟต PiBlue ™ (BioAssay ระบบสหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เพื่อกำหนดความเข้มข้นของปี่ ความเข้มข้นของโปรตีนของ homogenates ถูกวัดโดยใช้วิธีแบรดฟอร์ด ทั้งหมดassays ได้ดำเนินการใน triplicate กิจกรรม NKA จะแสดงเป็นmmol ปี่ mg−1 โปรตีน h−12.5. ImmunohistochemistryImmunohistochemical วิเคราะห์ของ formalin คงเหงือกเนื้อเยื่อส่วนได้จัดทำตามวิธีที่นำเสนอใน Reilly et al. (2011)และ Babonis et al. (2009) รายละเอียดเฉพาะของหลักและรองแอนตี้ที่ใช้ในการศึกษานี้สามารถพบได้ในตารางที่ 1 สั้น ๆ แอลกอฮอล์ตัวอย่างการรักษาเหงือกดีอบแห้ง ฝังในพาราฟินจัดแบ่งเป็นส่วน ๆ ที่ 6 μm และวางลงบนสไลด์ที่เคลือบโพลี-L-ไลซีน ส่วนได้ deparaffinised แล้ว rehydrated และ blockedwith avidin และไบโอติน(0.01%, 15 นาที) และแพะปกติซีรั่ม (ซีรั่ม 2% บีเอสเอ 1%, 0.1%เย็นปลาผิวตุ๋น 0.1% ไตรตั้น X 100, 0.05% Tween-20 และ 0.05%thimerosal ใน PBS 0.01 M, pH 7.2) สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องใช้แอนตี้หลัก และส่วนที่ incubated ที่4 ° C ค้างคืนในห้อง humidified รอง Biotinylatedแอนตี้แล้วใช้ส่วนที่ตาม horseradishstreptavidin peroxidise มัน (1:1000 ใน PBS ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์สหรัฐอเมริกา) สำหรับ 30 นาทีแต่ละที่อุณหภูมิห้อง Chromogenic detectionwasดำเนินการใช้เล็กน้อย (3, 3′ diaminobenzidine tetrahydrochloride)น้ำพื้นผิว (ซิก Aldrich ออสเตรเลีย) เตรียมภาพนิ่งของเหงือกส่วนที่ถูกมอง และถ่ายใช้เป็น Olympus BH-2กล้องจุลทรรศน์กล้องไลก้า DFC2902.6 blotting วิธี NKAWesternBlottingwas ตะวันตกดำเนินตามลชเว et al. (2005) วัดปริมาณabundances ญาติของ NKA โดยเฉพาะที่ด้วยกองทัพย่อยของ NKAขนส่งซับซ้อน (Wilson et al., 2007), ในเนื้อเยื่อ branchial ด้วยความเคารพเค็มเพื่อสิ่งแวดล้อม เนื่องจากจำนวนว่าง เนื้อเยื่อปริมาณตัวอย่างเพียงพอถูกเก็บรวบรวมจากสัตว์เพียงสามต่อกลุ่มบำบัด Homogenised และ centrifuged เนื้อเยื่อและเม็ด resuspended ในบัฟเฟอร์ coldhomogenisation น้ำแข็ง (inmmol L−1: 250ซูโครส ตรี 30, EDTA 1, 100 mg mL−1 phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์5mgmL−1 รติเอสเตอร์ค็อกเทล) ส่วนลงตัวถูกเอาออกสำหรับโปรตีนนับ (Qubit ชีวิตเทคโนโลยีออสเตรเลีย) Micrograms หกgroupwas ineachtreatment ofproteinfromeachanimal รวมแล้ว

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ฟอสเฟตนินทรีย์ (Pi) ปลดปล่อยระหว่างสองฟักตัวของเชื้อที่ได้รับการ
กำหนดกิจกรรมของ NKA ปฏิกิริยาเริ่มต้นโดยการเพิ่ม
5 ไมโครลิตร Na2-เอทีพี (5 มิลลิโมล L-1) และต่อเนื่องเป็นเวลา 15 นาที ปฏิกิริยา
ถูกหยุดโดยการเพิ่มของปริมาณที่เท่ากันของกรดเปอร์คลอริก
(0.8 mol L-1) ผสมปฏิกิริยาถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1,200 กรัมสำหรับ
20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส PiBlue ™ฟอสเฟต Assay Kit (ชีวภาพ Systems,
USA) ถูกใช้ในการตรวจสอบความเข้มข้น Pi ความเข้มข้นของโปรตีน
ของ homogenates วัดโดยใช้วิธี Bradford ทั้งหมด
ได้รับการตรวจดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า กิจกรรม NKA จะแสดงเป็น
มิลลิโมล Pi-1 มิลลิกรัมโปรตีน H-1.
2.5 immunohistochemistry
Immunohistochemical วิเคราะห์ส่วนเนื้อเยื่อเหงือกคงฟอร์มาลิน
ได้จัดทำตามวิธีการที่นำเสนอในลี et al, (2011)
และ Babonis et al, (2009) รายละเอียดที่เฉพาะเจาะจงของประถมศึกษาและมัธยมศึกษา
แอนติบอดีที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้สามารถพบได้ในตารางที่ 1 สั้น ๆ , เครื่องดื่มแอลกอฮอล์
ที่เก็บรักษาไว้เป็นตัวอย่างปลาแห้งที่ฝังอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟิน,
แบ่งที่ 6 ไมโครเมตรและวางไว้บนโพลี-L-ไลซีนสไลด์เคลือบ ส่วน
ที่ถูก deparaffinised rehydrated แล้วและ avidin blockedwith และไบโอติน
(0.01%, 15 นาที) และซีรั่มแพะปกติ (เซรั่ม 2% บีเอสเอ 1%, 0.1%
เจลาตินหนังปลาเย็น 0.1% Triton X-100, 0.05% Tween-20 และ 0.05%
ใน thimerosal 0.01 M พีบีเอสพีเอช 7.2) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง.
แอนติบอดีประถมถูกนำไปใช้และส่วนที่ถูกบ่มที่
4 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืนในห้องความชื้น รอง biotinylated
แอนติบอดีถูกนำไปใช้แล้วส่วนตามด้วยพืชชนิดหนึ่ง
ที่มีข้อความ peroxidise streptavidin (1: 1,000 ในพีบีเอส; ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์,
USA) สำหรับ 30 นาทีในแต่ละที่อุณหภูมิห้อง chromogenic detectionwas
ดำเนินการโดยใช้ป้าย (3,3 'diaminobenzidine tetrahydrochloride)
พื้นผิวเหลว (ซิกม่าดิช, ออสเตรเลีย) เตรียมสไลด์ของเหงือก
ส่วนที่ถูกมองและถ่ายภาพโดยใช้โอลิมปั BH-2
กล้องจุลทรรศน์ด้วยกล้อง Leica DFC290.
2.6 NKAWestern ซับ
ตะวันตก Blottingwas ดำเนินการตามโช et al, (2005) ที่จะหาจำนวน
ญาติของอนุภาค NKA เฉพาะα-subunit ของ NKA
ขนส่งที่ซับซ้อน (วิลสัน et al., 2007) ในเนื้อเยื่อ branchial ด้วยความเคารพ
ความเค็มสิ่งแวดล้อม เนื่องจากจำนวนเงินขนาดเล็กของเนื้อเยื่อที่มีอยู่
เพียงพอตัวอย่างปริมาณที่ถูกเก็บรวบรวมจากเพียงสามสัตว์
ต่อกลุ่มการรักษา เนื้อเยื่อถูก homogenised และปั่นและ
เม็ด resuspended ในบัฟเฟอร์น้ำแข็ง coldhomogenisation (inmmol L-1: 250
ซูโครส 30 ทริส 1 EDTA, 100 มิลลิกรัม mL-1 ฟลูออไร phenylmethylsulfonyl,
5mgmL-1 น้ำย่อยยับยั้งค๊อกเทล) aliquot ถูกลบออกโปรตีน
ปริมาณ (qubit ชีวิตเทคโนโลยีออสเตรเลีย) หกไมโครกรัม
ofproteinfromeachanimal ineachtreatment groupwas รวมแล้ว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อนินทรีย์ฟอสเฟต ( Pi ) การปลดปล่อยให้เป็นอิสระระหว่างสอง incubations คือ
หมวดกิจกรรมของ nka . ปฏิกิริยาเริ่มต้น โดยการเพิ่มμ
5 L N เอทีพี ( 5 mmol l − 1 ) และต่อเนื่องเป็นเวลา 15 นาที ปฏิกิริยา
ถูกหยุดโดยการเพิ่มของปริมาณเท่ากันของเปอร์คลอริกแอซิด
( 0.8 โมล L − 1 ) ปฏิกิริยาผสมที่ระดับ 1200 g
20 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาการ piblue ™ฟอสเฟต 3 ชุด ( ระบบ
สหรัฐอเมริกาปลงผม ) ศึกษาปี่ที่ใช้ โปรตีน
ของ homogenates ถูกวัดโดยใช้วิธีแบรดฟอร์ด ทั้งหมด
) มีการปฏิบัติทั้งสามใบ กิจกรรม nka แสดงเป็น
mmol ปี่มิลลิกรัมโปรตีน− 1 H − 1 .
2.5 สำหรับการวิเคราะห์ของฟอร์มาลินถาวรหลอด

ส่วนเนื้อเยื่อเหงือกเตรียมต่อวิธีการนำเสนอใน Reilly et al . ( 2011 )
และ babonis et al . ( 2009 ) รายละเอียดเจาะจงของประถมศึกษาและมัธยมศึกษา
แอนติบอดีที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้สามารถพบได้ในตารางที่ 1 สั้น ๆ , แอลกอฮอล์
เก็บรักษาตัวอย่างเหงือกมี dehydrated ฝังในพาราฟิน ,
ตัดที่ 6 μ M และวางลงบนสไลด์ เคลือบ poly-l-lysine . ส่วน