Concentration of total RNAwas estim

Concentration of total RNAwas estimated bymeasuring the absorbance
at 260 nm (NanoDrop 1000, Thermo Scientific). The RNA quality was
verifiedwith an agarose gel (0.8%) electrophoresis. Prior to reverse transcription
(RT) all RNA sampleswere treatedwith DNAase for 3 h at 37 °C
(AMBION, Copenhagen, Denmark) thatwas thereafter deactivated. Success
rate of chromosomal DNA elimination was verified with PCR. Total
RNA (500 ng) was reverse transcribed using GeneAmp RNA PCR Kit
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in a final volume of 100 μl
containing 1× Buffer, 5.5mMMgCl2, 0.5mMof each dNTP, 2.5 μM random
hexamers, 40 U RNase inhibitor and 125 U of Multiscribe Reverse
Transcriptase. The following program was used for the RT: 25 °C for
10 min, 48 °C for 30 min and 95 °C for 5 min (SureCycler 8800, Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA). The cDNA was stored at −80 °C.
2.3.3. Primer design and selection of target sequence for qPCR
Two reference genes were selected for the RT-qPCR: ACT1 (actin 1,
GeneBank # AJ389086) and LSC2 (β subunit of succinyl-CoA ligase,
GeneBank # ALNQ01000029). LSC2 was identified by alignment with

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ความเข้มข้นของ RNAwas รวมประมาณ bymeasuring absorbance ที่ที่ 260 nm (NanoDrop 1000 เทอร์โมวิทยาศาสตร์) มีคุณภาพอาร์เอ็นเอverifiedwith agarose มีเจ electrophoresis (0.8%) ก่อนกลับ transcription(RT) ทั้งหมดอาร์เอ็นเอ sampleswere treatedwith DNAase สำหรับ h 3 ที่ 37 ° C(AMBION โคเปนเฮเกน เดนมาร์ก) thatwas หลังจากนั้นปิดใช้งาน ประสบความสำเร็จอัตราการตัดดีเอ็นเอของโครโมโซมถูกตรวจ ด้วย PCR ผลรวมอาร์เอ็นเอ (500 ng) ถูกย้อนทับศัพท์ใช้ชุด PCR ของอาร์เอ็นเอ GeneAmp(ใช้ Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี้ CA, USA) ในปริมาตรสุดท้ายของ 100 μlประกอบด้วย 1 ลอกบัฟเฟอร์ 5.5mMMgCl2, 0.5mMof แต่ละ dNTP สุ่ม μM 2.5hexamers, 40 ผล U RNase และ 125 U กลับ MultiscribeTranscriptase โปรแกรมต่อไปนี้ใช้สำหรับการ RT: 25 ° C สำหรับ10 นาที 48 ° C 30 นาที และ 95 ° C สำหรับ 5 นาที (SureCycler 8800, Agilentเทคโนโลยี ซานตาคลารา CA, USA) CDNA ถูกเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส2.3.3 การรองพื้นการออกแบบและเลือกลำดับเป้าหมายสำหรับ qPCRเลือกอ้างอิงสองยีนสำหรับ RT qPCR: ACT1 (แอกติน 1GeneBank # AJ389086) และ LSC2 (ย่อยβของ ligase succinyl CoAGeneBank # ALNQ01000029) LSC2 ที่ระบุการจัดตำแหน่งด้วย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ความเข้มข้นของ rnawas รวมทั้งหมดประมาณ โดยมีการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร (
nanodrop 1000 , เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ) คุณภาพ RNA คือ
าริอีลีเมนต์เป็นเจล ( 0.8% ) เรส ก่อนกลับ ถอดความ
( RT ) ทั้งหมดนี้เพื่อ treatedwith dnaase 3 H ที่ 37 ° C
( ambion , โคเปนเฮเกน , เดนมาร์ก ) เป็นหลังจากนั้นถูกปิด ความสำเร็จ
อัตราการกำจัดโครโมโซมอลดีเอ็นเอยืนยันด้วย PCR อาร์เอ็นเอทั้งหมด
( 500 กรัม ) คือ ย้อนกลับ และใช้ geneamp RNA PCR Kit
( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) ในเล่มสุดท้ายของ 100 μ L
ประกอบด้วย 1 ×บัฟเฟอร์ 5.5mmmgcl2 0.5mmof , แต่ละ dntp 2.5 μ M สุ่ม
hexamers 40 ยูเลสยับยั้งและ 125 U ของ multiscribe ย้อนกลับ
อาการ . โปรแกรมต่อไปนี้ใช้ RT :25 ° C
10 นาที , 48 องศา C นาน 30 นาทีและ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที ( surecycler 8800 Agilent
, เทคโนโลยี , ซานตาคลารา แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) วิธีที่ถูกเก็บไว้ที่− 80 องศา
2.3.3 . การออกแบบและเลือกลำดับเป้าหมาย ไพรเมอร์สำหรับ qpcr
2 อ้างอิงยีนคัดเลือก RT qpcr : act1 ( actin 1
genebank # aj389086 ) และ lsc2 ( บีตาย่อยของ COA ไลเกส
genebank ซัคซินิล , # alnq01000029 )lsc2 ระบุตำแหน่งด้วย