filter placed on an LB agar plate t

filter placed on an LB agar plate that was then incubated
at 37 °C overnight to allow conjugation to occur. P. putida
KT2440 transconjugants on the filter were selected on
Pseudomonas Isolation Agar containing 100 μg ml−1 kanamycin
(PIAKan100). Single colonies were subsequently
streaked on LB agar containing 15 % sucrose (wt/vol), and
incubated at 30 °C overnight. Sucrose-resistant colonies
were screened for the appropriate deletion by colony PCR
employing GoTaq Flexi DNA polymerase and a pair of
primers amZ-F/amZ-R. To verify the nucleotide sequence
of phaC1phaC2 cluster of the phaZ minus mutants, a DNA
fragment containing phaC1phaC2 genes from genomic
DNA of the mutants was amplified by PCR employing
GoTaq Flexi DNA polymerase and a pair of primers
amC1-F/C2-R1, ligated into pGEM®-T Easy resulting in
pGC1∆ZC2, and sequenced using SP6, T7, C1seq 1–3 and
C3seq 1–3 primers.
Shake flasks for verifying the function and evaluating
the unsaturated MCL‑PHA production of the MCL‑PHA
depolymerase minus mutant
A defined mineral salts (DMS) medium plus 5.0 g l−1 NA
or 5.0 g l−1 UDA or a mixture of 2.5 g l−1 NA and 2.5 g l−1
UDA as the only carbon sources was used. The DMS
medium contained per liter: 6.35 g Na2HPO4, 2.7 g KH2PO4,
0.39 g MgSO4, 0.5 g (NH4)2SO4 and 1 ml of trace element
solution [35]. Cultures grown overnight in Difco nutrient
broth (NB) were used as the seed cultures and transferred
into Erlenmeyer flasks containing the DMS medium and fatty
acid to achieve the initial optical densities OD600nm = 0.2.
Fermentation conditions
The carbon-limited fed-batch fermentations were performed
at 30 °C with 3.0 l initial working volume in a
Minifors 5 l stirred tank bioreactor (InforsHT, Bottmingen,
Switzerland). The inoculum medium, the initial fermentation
medium, seed culture preparation and fermentation
system were set up and controlled with data acquisition
conducted as described previously [38].
A mixture of NA + UDA (1:1 mol/mol) was fed based
on the mass of the substrate reservoir. A total of 1 g l−1 of
NA + UDA was added to the initial fermentation medium.
The additional carbon substrate was exponentially fed
according to Eq. 1.
where St (g) is the total carbon source required to produce
biomass Xt (g) at time t (h), YX/S (g g−1) is the yield of biomass
from total carbon, X0 is the initial biomass and μ is the
desired specific growth rate (0.15 h−1 was used in this study).
Analytical procedures
Dry cell weights (DCW) were determined with lyophilized
biomass. The biomass was obtained by centrifugation of
St = (1)
Xt
YX/S
=
X0
YX/S
· eμt ,
Fig. 1 Suicide plasmid for
excising the phaZ gene from the
P. putida KT2440 chromosome
via double homologous recombination
(a) and the construction
scheme for producing the
phaZ-knockout mutant P. putida
DZ18 (b)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กรองวางบนแผ่นวุ้นปอนด์ที่ incubated แล้วที่ 37 ° C ค้างคืนให้ผันจะเกิดขึ้น P. putidaKT2440 transconjugants ตัวกรองถูกเลือกบนPseudomonas แยกวุ้นที่ประกอบด้วย ml−1 100 μกานามัยซิน(PIAKan100) มีอาณานิคมเดียวต่อมาลายบนอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ที่ประกอบด้วยซูโครส 15% (wt/vol), และได้รับการกกที่ 30 ° C ค้างคืน ซูโครสป้องกันอาณานิคมคัดสำหรับการลบที่เหมาะสมโดยอาณานิคม PCRจ้าง GoTaq Flexi ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสและคู่ของไพรเมอร์ amZ-F/amZ-r การตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ของคลัสเตอร์ phaC1phaC2 ของ phaZ ลบกลายพันธุ์ ดีเอ็นเอส่วนที่ประกอบด้วยยีน phaC1phaC2 ออกดีเอ็นเอของสายพันธุ์ที่ถูกขยาย โดย PCR จ้างGoTaq Flexi ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสและคู่ของไพรเมอร์amC1-F/C2-R1 ควบเข้า pGEM® T ง่ายส่งผลให้pGC1∆ZC2 และเรียงลำดับโดยใช้ C1seq SP6, T7, 1-3 และไพรเมอร์ 1-3 C3seqเขย่าขวดสำหรับฟังก์ชันการตรวจสอบ และประเมินผลการผลิต MCL‑PHA MCL‑PHA ไม่อิ่มตัวdepolymerase ลบกลายพันธุ์เกลือแร่ที่กำหนด (DMS) ปานกลางบวกกับ 5.0 g l−1 นาหรือ 5.0 g l−1 UDA หรือส่วนผสมของนา l−1 2.5 g และ 2.5 g l−1ใช้ UDA เป็นแหล่งคาร์บอนเพียง การ DMSกลางอยู่ต่อลิตร: 6.35 g Na2HPO4, 2.7 g KH2PO40.39 กรัม MgSO4, 0.5 กรัม (NH4) 2SO4 และ 1 มิลลิลิตรของธาตุโซลูชั่น [35] วัฒนธรรมที่ปลูกในสารอาหาร Difco ค้างคืนน้ำซุป (NB) ถูกใช้เป็นวัฒนธรรมเมล็ด และโอนย้ายใน Erlenmeyer ขวดที่ประกอบด้วยขนาดกลาง DMS และไขมันกรดเพื่อให้ได้ความหนาแน่นออปติคอลเริ่มต้น OD600nm = 0.2สภาวะการหมักดำเนินการการหมักแหนมเลี้ยงชุดคาร์บอนจำกัดที่ 30 ° C ด้วย 3.0 l เริ่มต้นทำงานในการMinifors 5 l กวนถัง bioreactor (InforsHT, Bottmingenสวิตเซอร์แลนด์) Inoculum ปานกลาง การหมักเริ่มต้นปานกลาง เมล็ดวัฒนธรรมการเตรียมและการหมักระบบถูกตั้งค่า และควบคุมได้ ด้วยการเก็บข้อมูลดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [38]ส่วนผสมของ NA + UDA (1:1 โมล/โมล) ถูกเลี้ยงตามใหญ่พื้นผิวอ่างเก็บน้ำ ทั้งหมดของ l−1 1 กรัมของNA + UDA ถูกสื่อเริ่มต้นหมักชี้แจงถูกเลี้ยงพื้นคาร์บอนเพิ่มเติมตาม Eq. 1ที่เซนต์ (g) เป็นแหล่งคาร์บอนรวมที่จำเป็นในการผลิตชีวมวล Xt (g) ที่เวลา t (h), YX เอส (g−1 กรัม) เป็นผลผลิตของชีวมวลจากคาร์บอนรวม X0 คือ ชีวมวลเริ่มต้น และμคือการต้องการอัตราการเติบโตเฉพาะ (0.15 h−1 ใช้ในการศึกษานี้)อนกับน้ำหนัก (DCW) กำหนดด้วย lyophilized เซลล์แห้งชีวมวล ชีวมวลได้รับ โดยการหมุนเหวี่ยงของSt = (1)XtYX/S=X0YX/S· eμtPlasmid ฆ่าตัวตายรูปที่ 1 สำหรับยี่ห้อยีน phaZ จากการโครโมโซม P. putida KT2440ผ่านการรวมตัวกันเซทจะมีเตียงใหญ่(ก) และการก่อสร้างแผนการผลิตการphaZ-น่าพิศวงกลายพันธุ์ putida P.DZ18 (b)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวกรองที่วางอยู่บนจานเลี้ยงเชื้อ LB ที่ถูกบ่มแล้ว
ที่ 37 ° C ค้างคืนที่จะอนุญาตให้ผันที่จะเกิดขึ้น P. putida
transconjugants KT2440 กรองได้รับการคัดเลือกใน
Pseudomonas แยกวุ้นที่มี 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1 กานามัยซิ
(PIAKan100) อาณานิคมเดี่ยวภายหลัง
ลายบนอาหารเลี้ยงเชื้อ LB น้ำตาลซูโครส 15% (น้ำหนัก / ปริมาตร) และ
บ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน ซูโครสทนอาณานิคม
ถูกคัดกรองการลบความเหมาะสมโดยวิธี PCR อาณานิคม
จ้างโพลิเมอร์ GoTaq Flexi DNA และคู่ของ
ไพรเมอร์ AMZ-F / AMZ-R เพื่อตรวจสอบลำดับเบส
ของคลัสเตอร์ phaC1phaC2 ของ phaZ ลบกลายพันธุ์ดีเอ็นเอ
ชิ้นส่วนที่มียีน phaC1phaC2 จากจีโนม
ดีเอ็นเอของสายพันธุ์ที่ถูกขยายโดยวิธี PCR จ้าง
โพลิเมอร์ GoTaq Flexi ดีเอ็นเอและคู่ของไพรเมอร์
amC1-F / C2-R1, ligated เข้า pGEM®-T ใช้ง่ายผลใน
pGC1ΔZC2, ติดใจใช้ SP6, T7, C1seq 1-3 และ
C3seq 1-3 ไพรเมอร์.
เขย่าขวดในการตรวจสอบการทำงานและประเมินผล
การผลิต MCL-PHA ไม่อิ่มตัวของ MCL-PHA
depolymerase ลบ mutant
แร่เกลือ (DMS) กลางกำหนดบวก 5.0 GL-1 NA
หรือ 5.0 GL-1 UDA หรือส่วนผสมของ 2.5 GL-1 NA และ 2.5 GL-1
UDA เป็นแหล่งคาร์บอนเพียงถูกนำมาใช้ DMS
ขนาดกลางที่มีต่อลิตร: 6.35 กรัม Na2HPO4 2.7 กรัม KH2PO4,
0.39 กรัม MgSO4, 0.5 กรัม (NH4) 2SO4 และ 1 มิลลิลิตรของธาตุ
แก้ปัญหา [35] วัฒนธรรมเติบโตค้างคืนใน Difco สารอาหาร
น้ำซุป (NB) ถูกนำมาใช้เป็นวัฒนธรรมเมล็ดและย้าย
เข้าไปในขวด Erlenmeyer ที่มีขนาดกลางและไขมัน DMS
กรดเพื่อให้บรรลุความหนาแน่นแสงเริ่มต้น OD600nm = 0.2.
เงื่อนไขการหมัก
คาร์บอน จำกัด หมักแหนมเลี้ยงชุดได้ดำเนินการ
วันที่ 30 ° C มีปริมาณ 3.0 ลิตรเริ่มต้นการทำงานใน
Minifors 5 ลิตรถังหมักแบบกวน (InforsHT, Bottmingen,
วิตเซอร์แลนด์) สื่อเชื้อ, การหมักครั้งแรก
กลางเตรียมวัฒนธรรมเมล็ดพันธุ์และการหมัก
ระบบได้รับการติดตั้งและควบคุมด้วยการเก็บข้อมูล
การดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [38].
ส่วนผสมของ NA + UDA (1: 1 โมล / โมล) เป็นอาหารตาม
บน มวลของอ่างเก็บน้ำสารตั้งต้น ทั้งหมด 1 GL-1
+ นา UDA ถูกบันทึกอยู่ในสื่อการหมักครั้งแรก.
สารตั้งต้นคาร์บอนเพิ่มเติมเลี้ยงชี้แจง
ตามสมการ 1.
ที่เซนต์ (g) เป็นแหล่งคาร์บอนทั้งหมดที่จำเป็นในการผลิต
ชีวมวล Xt (g) ที่เวลา t (H), YX / S (GG-1) เป็นผลผลิตของชีวมวล
จากคาร์บอนรวม X0 เป็นครั้งแรกและชีวมวล μเป็น
อัตราการเติบโตที่ต้องการที่เฉพาะเจาะจง (0.15 H-1 ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้).
การวิเคราะห์
เซลล์น้ำหนักแห้ง (DCW) ถูกกำหนดด้วยความแห้ง
ชีวมวล ชีวมวลได้มาจากการหมุนเหวี่ยง
St = (1)
Xt
YX / S
=
X0
YX / S
·eμt,
รูป การฆ่าตัวตาย 1 พลาสมิดสำหรับ
excising ยีน phaZ จาก
พี โครโมโซม putida KT2440
ผ่าน recombination คล้ายคลึงคู่
(ก) และการก่อสร้าง
โครงการในการผลิต
phaZ-ที่น่าพิศวงกลายพันธุ์ P. putida
DZ18 (ข)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กรองวางบนปอนด์ agar plate ที่ถูกบ่มที่ 37 ° C ข้ามคืนเพื่อให้การเกิดขึ้น P.putidakt2440 transconjugants ที่ถูกเลือกในตัวกรองส่วนของการแยกวุ้น ( 100 μ G − 1 + เหตุผล( piakan100 ) โคโลนีเดี่ยวได้ในภายหลังลายบนอาหารที่มีซูโครสร้อยละ 15 ปอนด์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C ในชั่วข้ามคืน โคโลนีทนต่อซูโครสคัดกรองที่เหมาะสมโดยการลบโดยอาณานิคมการ gotaq Flexi DNA polymerase และคู่ของไพรเมอร์ amz-f / amz-r. ตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ของ phac1phac2 กลุ่มของ phaz ลบพันธ์ , ดีเอ็นเอส่วนที่มี phac1phac2 ยีนจากจีโนมดีเอ็นเอของสายพันธุ์ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้gotaq Flexi DNA polymerase และคู่ของไพรเมอร์amc1-f / c2-r1 ผูกลง , pgem ® - T ง่ายส่งผลให้pgc1 ∆ zc2 และลำดับการใช้ sp6 * * 3 , c1seq 1 – 3 ,c3seq 1 – 3 รองพื้นเขย่าขวดเพื่อตรวจสอบการทำงาน และการประเมินผลที่ไม่อิ่มตัว‑ mcl mcl ‑ผาผา การผลิตของdepolymerase ลบกลายพันธุ์กําหนดแร่เกลือ ( DMS ) กลางบวก 5.0 g L − 1 นาหรือ 5.0 g L − 1 สหรัฐอเมริกาหรือส่วนผสมของ 2.5 G L − 1 และ 2.5 กรัมต่อลิตร− 1อินโดนีเซียเป็นแหล่งคาร์บอนเท่านั้น คือใช้ ที่ออกแบบสื่อที่มีต่อลิตร : na2hpo4 6.35 กรัม kh2po4 2.7 กรัม0.39 กรัม MgSO4 ใ 0.5 กรัม ( NH4 ) 2so4 1 มิลลิลิตรของธาตุโซลูชั่น [ 35 ] วัฒนธรรมการเติบโตค้างคืนใน difco ธาตุอาหารน้ำซุป ( NB ) ถูกใช้เป็นเมล็ดพันธุ์ วัฒนธรรม และโอนในเออร์เลนเมเยอร์ขวดที่มี DMS ขนาดกลาง และไขมันกรดเพื่อให้ได้เริ่มต้นแสงความหนาแน่น od600nm = 0.2สภาวะการหมักคาร์บอน เลี้ยงรุ่นจำนวน fermentations จำกัดที่ 30 ° C กับ 3.0 ลิตรปริมาณเริ่มต้นทำงานในminifors 5 ลิตร ถังหมักแบบกวน ( inforsht bottmingen , ,สวิตเซอร์แลนด์ ) เชื้อกลาง การหมักเริ่มต้นปานกลาง การเตรียมเมล็ดหมักและวัฒนธรรมระบบถูกสร้างขึ้นและควบคุมได้ ด้วยข้อมูลดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 38 ]ส่วนผสมของ Na + สหรัฐอเมริกา ( 1 : 1 โมล / โมล ) คืออาหารตามเกี่ยวกับมวลของพื้นผิวอ่างเก็บน้ำ รวมเป็น 1 G L − 1 แห่งนา + สหรัฐอเมริกาก็เพิ่มสื่อการหมักครั้งแรกพื้นผิวคาร์บอนเพิ่มชี้แจง เดวิสตามอีคิว 1ที่เซนต์ ( G ) เป็นแหล่งคาร์บอนต้องผลิตรวมชีวมวล XT ( G ) ที่เวลา t ( H ) , yx / s ( G G − 1 ) ผลผลิตของชีวมวลจากคาร์บอนรวม x0 เป็นมวลชีวภาพเริ่มต้นและμคืออัตราการเจริญเติบโตจำเพาะที่ต้องการ ( 0.15 H − 1 เป็นเครื่องมือที่ใช้ในการศึกษานี้ )ขั้นตอนการวิเคราะห์น้ำหนักเซลล์แห้ง ( dcw ) พบว่ามีโปรตีนชีวมวล ชีวมวลที่ได้จากการปั่นเหวี่ยงของเซนต์ = ( 1 )XTyx / s=x0yx / sด้วย E μ T ,รูปที่ 1 ฆ่าตัวตายพลาสมิดสำหรับตัด phaz ยีนจากP.putida kt2440 โครโมโซมผ่านคู่โฮโมโลกัสรีคอมบิเนชัน( ) และการก่อสร้างโครงการผลิตphaz โดย P.putida กลายพันธุ์dz18 ( B )