A10 cells were treated with vehicle

A10 cells were treated with vehicle (dH2O), high glucose, and/or EGCG at the indicated concentrations and times.
The cells were lysed in a lysis buffer, sonicated, placed on ice for 1 h, andcentrifuged at 16000 g for 30 min. The supernatants were stored at 70 C until use. After the protein concentrations had been
measured, the supernatants were mixed with Laemmli sample buffer,
boiled for 5 min, subjected to electrophoresis, and then transferred
electrophoretically onto nitrocellulose membranes. The transblots were
blocked overnight with 5% nonfat dry milk in PBS-T buffer (0.05%
Tween 20 in 10 mM phosphate-buffered saline) at 4 C with constant
shaking and then incubated with the ERK1/2 (1:1000) or phosphory-
lated ERK1/2 antibody (1:1000) in 5% nonfat dry milk in PBS-T buffer
for 1 h at room temperature. The primary antibody binding was then
probed by a peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG antiserum. The
signal was detected using chemiluminescence and developed on X-ray
film. The density of the bands was quantified by densitometry using
Quantiscan, as reported previously.
21,22

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

A10 เซลล์ถูกรักษา ด้วยยานพาหนะ (dH2O), กลูโคสสูง และ/หรือ EGCG ที่ระบุความเข้มข้นและเวลาเซลล์ถูก lysed ในบัฟเฟอร์ lysis, sonicated วางบนน้ำแข็งสำหรับ 1 h, andcentrifuged ที่ 16000 g สำหรับ 30 นาที Supernatants ถูกเก็บไว้ที่ 70 C จนใช้ หลังจากที่ความเข้มข้นของโปรตีนได้วัด supernatants ถูกผสมกับบัฟเฟอร์อย่าง Laemmliต้มใน 5 นาที การ electrophoresis และโอนย้ายแล้วelectrophoretically ไป nitrocellulose เข้า ได้ transblotsบล็อกค้างคืนกับ 5% nonfat แห้งนมในบัฟเฟอร์ PBS T (0.05%Tween 20 ใน 10 มม. buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ) ที่ 4 C มีค่าคงสั่นแล้ว incubated กับ ERK1/2 (1:1000) หรือ phosphory-lated ERK1/2 แอนติบอดี (1:1000) ในนมแห้ง nonfat 5% ในบัฟเฟอร์ PBS Tสำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง ผูกหลักแอนติบอดีถูกแล้วพิสูจน์ โดยการป้าย peroxidase แพะกระต่ายป้องกัน IgG antiserum ที่พบสัญญาณใช้ chemiluminescence และพัฒนาบนเอ็กซ์เรย์ฟิล์ม ความหนาแน่นของวงถูก quantified โดย densitometryQuantiscan ตามรายงานก่อนหน้านี้21,22

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

A10 เซลล์ได้รับการรักษาด้วยคัน (dH2O) น้ำตาลสูงและ / หรือ EGCG ที่ความเข้มข้นที่ระบุและเวลา.
เซลล์ถูก lysed ในบัฟเฟอร์สลาย, sonicated วางบนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 ชั่วโมง, andcentrifuged ที่ 16,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาที supernatants ถูกเก็บไว้ที่ 70 C จนถึงการใช้งาน หลังจากที่ความเข้มข้นของโปรตีนที่ได้รับการ
วัด supernatants ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง Laemmli,
ต้มเป็นเวลา 5 นาทีภายใต้อิและจากนั้นก็ย้าย
electrophoretically บนเยื่อ nitrocellulose transblots ถูก
บล็อกค้างคืนกับ 5% ไม่มีน้ำมันนมแห้งในบัฟเฟอร์พีบีเอส-T (0.05%
Tween 20 ในน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์มิลลิ 10) วันที่ 4 C ที่มีอย่างต่อเนื่อง
สั่นและบ่มแล้วกับ ERK1 / 2 (1: 1000) หรือ phosphory -
lated ERK1 / 2 แอนติบอดี (1: 1000) ใน 5% ไม่มีน้ำมันนมแห้งในบัฟเฟอร์พีบีเอส-T
เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีหลักผูกพันจากนั้นก็
ตรวจสอบโดยแพะ peroxidase ที่มีข้อความต่อต้านกระต่าย IgG antiserum
สัญญาณที่ตรวจพบโดยใช้ chemiluminescence และการพัฒนาบน X-ray
ภาพยนตร์ ความหนาแน่นของวงดนตรีที่ได้รับการวัดความหนาแน่นโดยใช้
Quantiscan ตามที่รายงานก่อนหน้านี้.
21,22

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

A10 เซลล์จะถูกกับรถ ( dh2o ) กลูโคสสูง และ / หรือ EGCG ที่ความเข้มข้นและเวลา ) .
เซลล์ก็ lysed ในการสลายบัฟเฟอร์ sonicated วางไว้บนน้ำแข็ง 1 H , andcentrifuged ที่ 16 , 000 กรัมเป็นเวลา 30 นาที supernatants เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส จนใช้ หลังจากได้โปรตีนเข้มข้น
วัด , supernatants ผสม laemmli ตัวอย่างบัฟเฟอร์
ต้มประมาณ 5 นาทีภายใต้วิธีและโอน
electrophoretically ลงไนโตรเยื่อ การ transblots ถูก
บล็อกข้ามคืนด้วย 5 % นมไขมันต่ำ pbs-t แห้งในบัฟเฟอร์ ( 0.05 %
Tween 20 ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 10 มม. ) 4 C คงที่
สั่นแล้วบ่มด้วย erk1 / 2 ( 000 ) หรือ phosphory -
สาย erk1 / 2 ) ( 000 ) ใน 5 % นมไขมันต่ำแห้ง ใน pbs-t
บัฟเฟอร์1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีหลักผูก แล้วตรวจสอบโดยมีแพะ
ป้ายต่อต้านกลุ่มแอนติซีรัมของกระต่าย .
สัญญาณที่ตรวจพบการใช้นโยบายแรงงานและพัฒนาบนฟิล์มเอ็กซเรย์
. ความหนาแน่นของแถบถูก quantified โดย densitometry ใช้

quantiscan ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ 21,22