2. Materials and methods2.1. Rice m

2. Materials and methods
2.1. Rice materials

A total of 96 rice accessions were collected by Bangladesh Institute of Nuclear Agriculture (BINA) and used in this study. They included 86 landraces from southern Bangladesh, 9 indica varieties and lines, and salt tolerant Nona Bokra, the donor of SKC1, was used as the tolerant control (Table S1).

2.2. Screening for salinity tolerance

Hydroponic system based on the IRRI protocol [16] was used in the glasshouse at BINA to evaluate the salt tolerance responses of rice genotypes at the seedling stage. Three replications of 20 plants were tested under salt stress of 12 dS m− 1. The modified standard evaluation score (SES) of IRRI [17] was used to assess visual symptoms of salt toxicity 21 days after sowing. Binadhan-8 was used as a second tolerant control and Binadhan-7 was the susceptible control.

2.3. Marker genotyping

DNA was extracted from 6–8 individuals in each accession following the method of Zheng et al. [18]. To facilitate marker-assisted selection (MAS), sequence tagged site (STS) markers, rather than single nucleotide polymorphism (SNP) markers, were developed based on Insertion/Deletions (InDels) between the Nipponbare and 9311 genome sequences at the SKC1 (Chr. 1) [6], SalT (Chr. 1) [8] and DST (Chr. 3) [19] loci. Primers ( Table 1) were designed using Oligo 7.0 software. Eight STS markers were developed, 2 for SKC1, 3 for SalT and 3 for DST ( Table 1). Wn11463 and Wn11466 were designed based on 4 bp and 17 bp InDels downstream of SKC1 (LOC_Os01g20160); Wn13900 was based on a 4 bp InDel upstream of SalT (LOC_Os01g24710); Wn13902 and Wn13903 were based on 7 bp and 8 bp InDels in the SalT coding region; Th32637 was based on a 3 bp InDel upstream in DST (LOC_Os03g57240); and Th32638 and Th32369 were based on 12 bp and 18 bp InDels in the coding region of DST.

Table 1.
STS markers for three salt-tolerant genes.
Gene Marker Forward primer sequence (5′–3′) Reverse primer sequence (5′–3′)
SKC1 Wn11463 TCCTCCTTCTCTCGCAAC GATCCACTCGTCACAGG
Wn11466 GCTTCCCAATAATTTCGACCT CCCACCAATACTAAAGATCCTG
SalT Wn13900 GTACGGGTTCACATCCTC ACCCTCTATTAATTCACTACCA
Wn13902 CACCAGCGTCATACTCT CAAAACTGAGTAGGAATACCGTGA
Wn13903 CTGTATCAACTGCATTCGTGT GCTTGGTCAAACTCCGT
DST Th32637 TCGTATAGTAGGCTTTCATGGC TTTCACAGGTGCGAGAGCTT
Th32638 AGAGAAGCCAAGAAATCGAC TCCAAGCTCCACCTACTCC
Th32639 CTATTTGGCTTCGCAAGGACA CGCCCACTTTAATCATATTCCCT
Table options
One hundred and ninety-four SSR markers randomly distributed across 12 chromosomes of rice were selected from Gramene (http://www.gramene.org/) and used to screen for polymorphisms in 4 DNA pools bulked by 24 genotypes each. Finally, 58 polymorphic markers were selected to genotype each accession, of which 8, 5, 8, 3, 4, 7, 3, 7, 3, 4, 1, and 5 were located on each of 12 chromosomes, respectively. Chromosome 11 was represented by only one marker.

PCR was carried out in a 20 μL reaction mixtures containing 10 μL of 2 × Taq MasterMix II (Beijing Cowin Biotech Co., Ltd.), 0.5 μmol L− 1 SSR primers and 1.0 μL of template DNA. Amplifications were performed with pre-denaturation of 2 min at 94 °С, 30 cycles of 30 s at 94 °С, 30 s at 50–55 °С, 30 s at 72 °С and extension of 2 min at 72 °С. PCR products were visualized on 2% agarose gels using GelRed staining or on 6% non-denaturing polyacrylamide gel using silver staining.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุข้าวทั้งหมด 96 สายข้าวที่เก็บรวบรวมโดยบังคลาเทศสถาบันนิวเคลียร์เกษตรกรรม (BINA) และนำมาใช้ในการศึกษาครั้งนี้ พวกเขารวม 86 พันธุ์พื้นเมืองจากทางใต้ของบังคลาเทศ, 9 พันธุ์ indica และเส้นและทนเค็ม Nona Bokra ผู้บริจาคของ SKC1 ที่ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมที่ใจกว้าง (ตาราง S1). 2.2 การคัดกรองความเค็มความอดทนของระบบไฮโดรโปนิขึ้นอยู่กับโปรโตคอล IRRI [16] ถูกใช้ในเรือนกระจกที่ BINA การประเมินการตอบสนองทนเค็มของยีนข้าวในขั้นต้นกล้า สามซ้ำ 20 พืชได้มีการทดสอบภายใต้ความเครียดเกลือ 12 dS m- 1. คะแนนการประเมินผลมาตรฐานการปรับเปลี่ยน (SES) ของ IRRI [17] ถูกนำมาใช้ในการประเมินอาการภาพของความเป็นพิษเกลือ 21 วันหลังหยอดเมล็ด Binadhan-8 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมใจกว้างที่สองและ Binadhan-7 คือการควบคุมความเสี่ยงที่. 2.3 genotyping เครื่องหมายดีเอ็นเอถูกสกัด6-8 คนในแต่ละภาคยานุวัติต่อไปนี้วิธีการของเจิ้งเหอและอัล [18] เพื่ออำนวยความสะดวกการเลือกเครื่องหมายช่วย (MAS) ลำดับที่ติดแท็กเว็บไซต์ (STS) เครื่องหมายมากกว่าความแตกต่างเบื่อหน่ายเดียว (SNP) เครื่องหมายได้รับการพัฒนาอยู่บนพื้นฐานของการแทรก / ลบ (InDels) ระหว่าง Nipponbare และ 9311 ลำดับจีโนมที่ SKC1 (Chr 1). [6] เกลือ (Chr. 1) [8] และเวลา (Chr. 3) [19] ตำแหน่ง ไพรเมอร์ (ตารางที่ 1) ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟแวร์ Oligo 7.0 แปดเครื่องหมายเอสทีได้รับการพัฒนา 2 SKC1 3 เกลือและ 3 เวลา (ตารางที่ 1) Wn11463 Wn11466 และได้รับการออกแบบขึ้นอยู่กับ 4 bp และ 17 bp InDels ล่อง SKC1 (LOC_Os01g20160); Wn13900 อยู่บนพื้นฐานของต้นน้ำ Indel bp 4 ของเกลือ (LOC_Os01g24710); Wn13902 Wn13903 และอยู่บนพื้นฐานของ bp 7 และ 8 bp InDels ในภูมิภาคเข้ารหัสเกลือ; Th32637 อยู่บนพื้นฐานของ Indel 3 bp ต้นน้ำในเวลา (LOC_Os03g57240); และ Th32638 Th32369 และอยู่บนพื้นฐานของ 12 bp และ 18 bp InDels ในภูมิภาคการเข้ารหัสของเวลา. ตารางที่ 1 เครื่องหมายเอสทีสามยีนเกลือใจกว้าง. ยีนเครื่องหมายลำดับไพรเมอร์ไปข้างหน้า (5'-3 ') ลำดับไพรเมอร์ (Reverse 5' -3) SKC1 Wn11463 TCCTCCTTCTCTCGCAAC GATCCACTCGTCACAGG Wn11466 GCTTCCCAATAATTTCGACCT CCCACCAATACTAAAGATCCTG เกลือ Wn13900 GTACGGGTTCACATCCTC ACCCTCTATTAATTCACTACCA Wn13902 CACCAGCGTCATACTCT CAAAACTGAGTAGGAATACCGTGA Wn13903 CTGTATCAACTGCATTCGTGT GCTTGGTCAAACTCCGT DST Th32637 TCGTATAGTAGGCTTTCATGGC TTTCACAGGTGCGAGAGCTT Th32638 AGAGAAGCCAAGAAATCGAC TCCAAGCTCCACCTACTCC Th32639 CTATTTGGCTTCGCAAGGACA CGCCCACTTTAATCATATTCCCT ตัวเลือกตารางที่หนึ่งร้อย 94 เครื่องหมาย SSR สุ่มกระจายทั่ว 12 โครโมโซมข้าวได้รับการคัดเลือก จาก Gramene (http://www.gramene.org/) และใช้ในการคัดกรองความหลากหลายใน 4 สระดีเอ็นเอเนื้อมีหนังขึ้น 24 ยีนแต่ละ สุดท้าย 58 เครื่องหมาย polymorphic ได้รับเลือกให้เข้า genotype แต่ละที่ 8, 5, 8, 3, 4, 7, 3, 7, 3, 4, 1, 5 และตั้งอยู่ในแต่ละโครโมโซม 12 ตามลำดับ โครโมโซม 11 เป็นตัวแทนจากเพียงหนึ่งเครื่องหมาย. PCR ได้ดำเนินการในผสมปฏิกิริยาไมโครลิตร 20 ที่มี 10 ไมโครลิตรของ 2 × Taq MasterMix ครั้งที่สอง (ปักกิ่งโคลินไบโอเทค จำกัด ), 0.5 ไมโครโมล L- 1 SSR ไพรเมอร์และ 1.0 ไมโครลิตรของ ดีเอ็นเอแม่แบบ เครื่องขยายเสียงได้รับการดำเนินการกับ denaturation ก่อน 2 นาทีที่ 94 °С 30 รอบของ 30 วินาทีที่ 94 °С, 30 วินาทีที่ 50-55 °С, 30 วินาทีที่ 72 °Сและการขยาย 2 นาทีที่ 72 °С ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกมองเห็นในเจล agarose 2% โดยใช้การย้อมสี GelRed หรือ 6% ที่ไม่ denaturing เจลอะคริเลตโดยใช้การย้อมสีเงิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุ

ข้าวทั้งหมด 96 สายพันธุ์ข้าวครั้งนี้ บังกลาเทศ สถาบันการเกษตร นิวเคลียร์ ( Bina ) และที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ พวกเขารวม 86 landraces จากตอนใต้ของบังคลาเทศ , 9 3 พันธุ์และสายพันธุ์ทนเค็มและ Nona bokra , ผู้บริจาค skc1 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมใจกว้าง ( ตาราง S1 ) .

. . การคัดกรอง

ทนความเค็มระบบ hydroponic จาก IRRI โปรโตคอล [ 16 ] ใช้ในเรือนกระจกที่ Bina เพื่อประเมินการตอบสนองของข้าวพันธุ์ทนเค็มที่กล้าขึ้นเวที สามซ้ำ 20 พืชทดสอบภายใต้เค็ม 12 DS m − 1 แก้ไขคะแนนประเมินมาตรฐาน ( SES ) ของ IRRI [ 17 ] ถูกใช้เพื่อประเมินอาการภาพความเป็นพิษของเกลือ 21 วัน หลังหยอดเมล็ดbinadhan-8 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมใจกว้างที่สองและ binadhan-7 คือการควบคุมเสี่ยง

2.3 เครื่องหมายเขต

ดีเอ็นเอจาก 6 – 8 บุคคลในแต่ละชนิดตามวิธีการของเจิ้ง et al . [ 18 ] เพื่อความสะดวกในการใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอช่วยในการคัดเลือก ( MAS ) ลำดับแท็กเว็บไซต์ ( STS ) เครื่องหมายมากกว่าซิงเกิลนิวคลีโอไทด์โพลีมอร์ฟิซึม ( SNP ) เครื่องหมายถูกพัฒนาขึ้นจากการแทรก / ลบ ( indels ) ระหว่าง nipponbare 9311 จีโนมและลำดับที่ skc1 ( Chr . 1 ) [ 6 ] , เกลือ ( Chr . 1 ) [ 8 ] และเวลา ( Chr . 3 ) [ 19 ] สถานะ . ไพรเมอร์ ( ตารางที่ 1 ) ได้รับการออกแบบโดยใช้โอลิโก 7.0 ซอฟแวร์ แปด STS เครื่องหมายถูกพัฒนา 2 skc1 3 สำหรับเกลือและ 3 เวลา ( ตารางที่ 1 )และ wn11463 wn11466 ถูกออกแบบบนพื้นฐาน 4 BP และ 17 BP indels ท้ายน้ำ skc1 ( loc_os01g20160 ) ; wn13900 ยึด 4 BP INDEL น้ำเกลือ ( loc_os01g24710 ) ; wn13902 และ wn13903 ขึ้นอยู่กับ 7 BP และ 8 indels BP ในเกลือเขตนะครับ ; th32637 ยึด 3 BP INDEL ต้นน้ำในเวลา ( loc_os03g57240 )และ และ th32638 th32369 ขึ้นอยู่กับ 12 BP และ 18 indels BP ในรหัสภูมิภาคของ DST


ตามตาราง 1 . เครื่องหมาย 3 ยีนทนเค็ม .
ยีนเครื่องหมาย forward primer ลำดับ ( 5 ′– 3 School ) รองพื้นลำดับย้อนกลับ ( 5 ′– 3 นั้น )
skc1 wn11463 tcctccttctctcgcaac gatccactcgtcacagg
wn11466 gcttcccaataatttcgacct cccaccaatactaaagatcctg wn13900 gtacgggttcacatcctc accctctattaattcactacca

เกลือwn13902 caccagcgtcatactct caaaactgagtaggaataccgtga
wn13903 ctgtatcaactgcattcgtgt gcttggtcaaactccgt
เวลา th32637 tcgtatagtaggctttcatggc tttcacaggtgcgagagctt
th32638 agagaagccaagaaatcgac tccaagctccacctactcc
th32639 ctatttggcttcgcaaggaca ตัวเลือกตาราง cgcccactttaatcatattccct

หนึ่งร้อยเก้าสิบสี่ SSR markers กระจายแบบสุ่มทั่วทั้ง 12 โครโมโซมของข้าวที่ได้รับเลือกจาก gramene ( http :/ / www.gramene . org / ) และใช้หน้าจอเพื่อความหลากหลายในประเภทยก 4 ดีเอ็นเอโดย 24 สายพันธุ์ แต่ละ ในที่สุด , 58 ที่มีเครื่องหมายถูกเลือกกับแต่ละชนิด ซึ่ง 8 , 5 , 8 , 3 , 4 , 7 , 3 , 5 , 3 , 2 , 1 และ 5 ตั้งอยู่ในแต่ละ 12 ) ตามลำดับ โครโมโซมคู่ที่ 11 ถูกแทนด้วย

เพียงหนึ่งเครื่องหมายโดยได้ทำการศึกษาใน 20 μ L ปฏิกิริยาผสม บรรจุ 10 μ L 2 ×แท็ค mastermix II ( Beijing ทางการเทคโนโลยีชีวภาพ Co . , Ltd . ) , 0.5 μโมล L − 1 SSR ชนิด 1.0 μ L ของดีเอ็นเอแม่แบบ amplifications แสดงด้วย ( ก่อน 2 นาทีที่ 94 °С 30 รอบ 30 s ที่ 94 °С 30 เป็น 50 - 55 °С 30 s 72 °Сและเบอร์ 2 นาทีที่ 72 °С .ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกมองเห็นใน 2% ( เจลใช้ gelred staining หรือ 6 % โนนี่ polyacrylamide gel ใช้ silver staining