2. Method for Producing Euglena of

2. Method for Producing Euglena of the Present Invention
The method for producing a Euglena of the present
invention is a method for producing a Euglena carrying a ยีนดีดี and a ยีนจากภายนอกที่สนใจ in an expressible
manner, the method comprising the step of:
(1) introducing the ยีนดีดีและยีนจากภายนอก of
interest into a Euglena by the อะโกรแบคทีเรียม method.
[0033]
The drug resistance gene, the ยีนจากภายนอกที่สนใจ,
and the Euglena are as explained in Section 1 above. [0034]
The อะโกรแบคทีเรียม method was originally used as a
การทรานสฟอร์ม method for plants. The อะโกรแบคทีเรียม method uses อะโกรแบคทีเรียม tumefaciens (hereafter, "อะโกรแบคทีเรียม"), a gram-
negative soil bacterium that causes tumors called crown gall in
plants. A gene region called transferred-DNA (T-DNA), which is a portion of a large พลาสมิด called tumor-inducing (Ti) พลาสมิด
possessed by อะโกรแบคทีเรียม, is removed, enters plant cells
through a type-IV secretion system, and is introduced into the
nuclear genome by homologous recombination, leading to tumor
formation. The removal of T-DNA requires a group of genes called the virulence (vir) region. Although the sequences of both






บริเวณ are present on the Ti พลาสมิด, these บริเวณ are known to function together even if they are not on the same พลาสมิด.
[0035]
The อะโกรแบคทีเรียม method is preferably a ไบนารี เวคเตอร์
method. The ไบนารี เวคเตอร์ method, which was developed utilizing
the properties of อะโกรแบคทีเรียม described above, uses two
different พลาสมิดs. In the ไบนารี เวคเตอร์ method, the vir region
and the T-DNA region, which are inherently on the same พลาสมิด,
are carried on different พลาสมิดs, and these พลาสมิดs are
10 simultaneously used. More specifically, อะโกรแบคทีเรียม carrying
both a พลาสมิด containing only the vir region (helper พลาสมิด)
and a พลาสมิด containing only the T-DNA region (ไบนารี เวคเตอร์) is
used. The process is as follows. First, a gene to be introduced
into an organism used as a host is inserted into the T-DNA region 15 on a ไบนารี เวคเตอร์, and this พลาสมิด is introduced into
อะโกรแบคทีเรียม carrying a helper พลาสมิด. The thus-obtained
อะโกรแบคทีเรียม carrying the two types of พลาสมิดs is co-cultured
with the host organism, thereby introducing the desired gene into
the host. The co-culturing method for อะโกรแบคทีเรียม infection may 20 be either a method using a solid medium or a method using a
liquid medium. A method using a liquid medium is more preferable.
Additionally, in co-culturing, it is desirable to add a phenol
compound as an อะโกรแบคทีเรียม infection induction substance. The
phenol compound used as an infection induction substance is most
desirably acetosyringone.
[0036]
The method for producing a Euglena of the present
invention may further comprises the step of:
(2) culturing the Euglena obtained in step (1) in the presence of
the drug to which the introduced ยีนดีดี shows
resistance. [0037]
สภาวะ for the culture are not particularly limited.
When ซีโอซิน or ไฮโกรไมซิน is used as the drug, the culture is
preferably performed at a pH of 6 to 8. When 6418 is used as the







drug, the culture is preferably performed at a pH of 5 to 8.
Although a pH near 5.0 is generally considered to be advantageous
to the growth of Euglena, performing the culture under the above
สภาวะ is advantageous since these drugs are more stably
5 maintained, and a Euglena carrying a drug resistance gene and a
ยีนจากภายนอกที่สนใจ in an expressible manner is more efficiently obtained.
When a drug that is stable to acids and bases is used
as the drug, the culture สภาวะ can be set without being
particularly affected by pH สภาวะ.
[0039]
There is no particular limitation on the culture
สภาวะ in step (2) . Examples include the following สภาวะ.
For example, the culture is performed in a KH selective plate
medium. The concentration of the drug in the medium is not
particularly limited. When a ซีโอซิน resistance gene is introduced,
ซีโอซิน is used in an amount of, for example, 20 to 100 µg/ml. If
necessary, one or more other drugs may be further added to the
medium. There is no particular limitation, and when a ซีโอซิน
resistance gene is introduced, for example, ซีโฟแทกซีม may be
further added to the medium in an amount of 50 to 200 jig/mi. This
prevents อะโกรแบคทีเรียม alone from forming colonies after the
establishment of infection, and is thus advantageous.
[0040]
When a ไฮโกรไมซิน resistance gene is introduced,
ไฮโกรไมซิน is used in an amount of, for example, 5 to 100 jig/ml. Further, ซีโฟแทกซีม may be added to the medium in an amount of 50 to 200 jig/mi. This prevents อะโกรแบคทีเรียม alone from forming
colonies after the establishment of infection, and is thus
advantageous.
[0041]
When a G418 resistance gene is introduced, G418 is used

in an amount of, for example, 5 to 100 jig/ml. Further, ซีโฟแทกซีม
may be added to the medium in an amount of 50 to 200 jig/mi. This






prevents อะโกรแบคทีเรียม alone from forming colonies after the establishment of infection, and is thus advantageous.
[0042]
The number of cells at the start of culture is not
particularly limited and is, for example, lx104 to 1x108 cells.
[0043]
The culture period is not particularly limited, and is,
for example, 2 to 7 days.
[0044]
Step (2) may be performed only once or, if necessary,
may be performed two or more times.
When the step is performed two or more times, the
number of cells at the start of culture is not particularly
limited, but may be reduced in a stepwise manner if necessary. 15 Although there is no particular limitation, the number of cells
at the start of culture may be reduced to about one-fifth to
about one-half of that of the previous stage.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วิธีการผลิตยูกลีนาของประดิษฐ์อยู่ วิธีการผลิตยูกลีนาปัจจุบันประดิษฐ์เป็นวิธีการผลิตยูกลีนาที่ถือครองเป็นยีนดีดีและยีนจากภายนอกที่สนใจเป็นในการ expressibleลักษณะ วิธีการขั้นตอนการประกอบด้วย:(1) แนะนำยีนดีดีและยีนจากภายนอกของ สนใจเป็นยูกลีนาโดยวิธีอะโกรแบคทีเรียม[0033]ยีนต้านทานยาเสพติด ยีนจากภายนอกที่สนใจและยูกลีนาอยู่ตามที่อธิบายไว้ในส่วนที่ 1 [0034] เดิมใช้วิธีการอะโกรแบคทีเรียมเป็นการวิธีการทรานสฟอร์มสำหรับพืช วิธีอะโกรแบคทีเรียมใช้อะโกรแบคทีเรียม tumefaciens (โดย, "อะโกรแบคทีเรียม"), กรัมแบบลบดินแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของเนื้องอกเรียกว่าปากปราศรัยน้ำใจเชือดคราวน์ในรดน้ำต้นไม้ โอนย้ายดีเอ็นเอ (T-DNA), ซึ่งเป็นส่วนของพลาสมิดขนาดใหญ่ที่เรียกว่าเนื้องอก-inducing (ตี้) เรียกว่าภูมิภาคยีนพลาสมิดต้อง โดยอะโกรแบคทีเรียม เอาออก เข้าสู่เซลล์พืชผ่านระบบหลั่งชนิด IV และนำเข้าสู่การนิวเคลียร์จีโนม โดย homologous recombination นำไปสู่เนื้องอกการก่อ เอาของดีเอ็นเอทีจำเป็นต้องใช้กลุ่มของยีนที่เรียกว่า virulence (vir) ภูมิภาค ถึงแม้ว่าลำดับของทั้งสอง บริเวณตั้งอยู่บนตี้พลาสมิด บริเวณเหล่านี้เป็นที่รู้จักกันทำงานร่วมกันแม้ว่าพวกเขาไม่ได้อยู่ในพลาสมิดเดียวกัน [0035]วิธีอะโกรแบคทีเรียมควรเป็นไบนารีเวคเตอร์ วิธีการ ไบนารีเวคเตอร์วิธี ซึ่งได้รับการพัฒนาใช้คุณสมบัติของอะโกรแบคทีเรียมที่อธิบายไว้ข้างต้น ใช้สองพลาสมิดs แตกต่างกัน ในวิธีการไบนารีเวคเตอร์ ภูมิภาค vir และ ภูมิภาค T-ดีเอ็นเอ ซึ่งมีความในพลาสมิดเดียวกัน ดำเนินการใน พลาสมิดs ที่แตกต่างกัน และ พลาสมิดs เหล่านี้จะ 10 พร้อมใช้ อื่น ๆ โดยเฉพาะ โดยอะโกรแบคทีเรียม ทั้งพลาสมิดแบบที่ประกอบด้วยเฉพาะ vir ภูมิภาค (พลาสมิดผู้ช่วย) และพลาสมิดที่ประกอบด้วยเฉพาะดีเอ็นเอทีภูมิภาค (ไบนารีเวคเตอร์) ใช้ กระบวนการมีดังนี้ แรก ยีนจะถูกนำมาใช้ เป็นสิ่งมีชีวิตที่ใช้เป็นโฮสต์แทรก T-ดีเอ็นเอ บริเวณ 15 ไบนารีเวคเตอร์ และพลาสมิดนี้จะนำเข้าสู่ อะโกรแบคทีเรียมแบกพลาสมิดผู้ช่วย ดังรับ แบกสองชนิด พลาสมิดs อะโกรแบคทีเรียมเป็นอ่างร่วม กับสิ่งมีชีวิตของโฮสต์ จึงแนะนำยีนต้องเป็น โฮสต์ วิธี culturing ร่วมสำหรับอะโกรแบคทีเรียมติดเชื้อ 20 พฤษภาคมจะเป็นวิธีการที่ใช้สื่อแข็งหรือใช้วิธีการ ขนาดกลางของเหลว วิธีการใช้สื่อของเหลวได้มากขึ้นกว่า นอกจากนี้ ใน culturing ร่วม เป็นสิ่งที่ต้องการเพิ่มวาง ผสมเป็นสารเหนี่ยวนำของการติดเชื้ออะโกรแบคทีเรียม ที่ วางผสมใช้เป็นสารเหนี่ยวนำการติดเชื้อเป็นส่วนใหญ่ desirably acetosyringone[0036]วิธีการผลิตยูกลีนาปัจจุบันสิ่งประดิษฐ์ประกอบด้วยขั้นตอนการเพิ่มเติม:(2) ยูกลีนาที่ได้รับในขั้นตอนที่ (1) หน้า culturing ยาเสพติดที่ยีนดีดีนำแสดงต้านทาน [0037]สภาวะในวัฒนธรรมไม่จำกัดโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ซีโอซินหรือไฮโกรไมซินเป็นยาเสพติด เป็นวัฒนธรรม ควรทำที่ pH 6-8 เมื่อใช้ 6418 เป็น ควรมีทำยา วัฒนธรรมที่ pH 5-8แม้ว่า pH ใกล้ 5.0 โดยทั่วไปนับว่าเป็นประโยชน์ การเจริญเติบโตของยูกลีนา ดำเนินวัฒนธรรมภายใต้ข้างต้น สภาวะเป็นข้อได้เปรียบเนื่องจากยาเหล่านี้มีมาก stably 5 รักษา และยูกลีนาที่ถือครองเป็นยีนต้านทานยาเสพติดและมีประสิทธิภาพมากขึ้นได้รับยีนจากภายนอกที่สนใจในการ expressibleเมื่อมีใช้ยาที่มีเสถียรภาพการกรด และฐาน เป็นยาเสพติด สภาวะวัฒนธรรมสามารถตั้งไม่ให้โดยเฉพาะอย่างยิ่งผลกระทบจาก pH สภาวะ[0039]ไม่จำกัดเฉพาะวัฒนธรรมสภาวะในขั้นตอนที่ (2) ตัวอย่างเช่นสภาวะต่อไปนี้ ตัวอย่าง กระทำวัฒนธรรมจานใช้ KHสื่อ ไม่มีความเข้มข้นของยาในการโดยเฉพาะอย่างยิ่งจำกัด เมื่อยีนต้านทานซีโอซินที่เป็นที่รู้จัก ซีโอซินใช้ในจำนวน เช่น 20-100 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml หาก จำเป็น น้อยยาอื่น ๆ อาจเพิ่มเติมเพิ่มไป สื่อ ไม่จำกัดเฉพาะ และ เมื่อเป็นซีโอซิน นำยีนต้านทาน ตัวอย่าง ซีโฟแทกซีมอาจ เพิ่มเติม เพิ่มสื่อในจำนวน 50-200 ฉลุ/mi นี้ ป้องกันไม่ให้อะโกรแบคทีเรียมคนเดียวเป็นอาณานิคมหลังจาก ก่อตั้ง การติดเชื้อ และเป็นประโยชน์ [0040]เมื่อยีนต้านทานไฮโกรไมซินที่เป็นที่รู้จักไฮโกรไมซินจะใช้ในการ ตัวอย่าง 5-100 ฉลุ/ml เพิ่มเติม ซีโฟแทกซีมอาจเพิ่มระดับปานกลางในจำนวน 50-200 ฉลุ/mi นี้ทำให้อะโกรแบคทีเรียมคนเดียวจากการขึ้นรูป อาณานิคมหลังจากก่อตั้ง การติดเชื้อ และเป็นประโยชน์[0041]เมื่อนำยีนต้านทานการ G418 ใช้ G418ในจำนวน ตัวอย่าง 5-100 ฉลุ/ml เพิ่มเติม ซีโฟแทกซีมอาจจะเพิ่มสื่อในจำนวน 50-200 ฉลุ/mi. นี้ ป้องกันไม่ให้อะโกรแบคทีเรียมคนเดียวเป็นอาณานิคมหลังจากก่อตั้งของการติดเชื้อ และเป็นประโยชน์ [0042]ไม่มีจำนวนของเซลล์ที่จุดเริ่มต้นของวัฒนธรรม จำกัด และ มี ตัวอย่าง lx104 1 x 108 เซลล์โดยเฉพาะอย่างยิ่งการ[0043]วัฒนธรรมระยะเวลาไม่จำกัดโดยเฉพาะอย่างยิ่ง และตัวอย่างเช่น 2-7 วัน[0044] ขั้นตอนที่ (2) อาจจะทำเพียงครั้งเดียว หรือ ถ้าจำ เป็นอาจจะทำครั้งที่สอง หรือมากกว่าเมื่อขั้นตอนการดำเนินการครั้งที่สอง หรือมากกว่า การจำนวนของเซลล์ที่จุดเริ่มต้นของวัฒนธรรมไม่ได้โดยเฉพาะอย่างยิ่งจำกัด แต่อาจจะลดลงด้วยวิธี stepwise หากจำเป็น 15 แต่ไม่จำกัดเฉพาะ จำนวนของเซลล์ ที่จุดเริ่มต้นของวัฒนธรรมอาจจะลดลงไปประมาณ 1 5 ไป ครึ่งหนึ่งของของขั้นก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วิธีการผลิตห้วยทรายของปัจจุบันการประดิษฐ์
วิธีการผลิตห้วยทรายของการประดิษฐ์ในปัจจุบัน
เป็นวิธีการผลิตห้วยทรายถือยีนดีดีและยีนจากภายนอกที่สนใจในลักษณะ expressible
, วิธีการประกอบด้วยขั้นตอน :
( 1 ) แนะนำยีนดีดีและยีนจากภายนอกของ
ความสนใจในอะโกรแบคทีเรียมห้วยทราย โดยวิธีการ 0033
[ ]
ยาต้านยีน , ยีนจากภายนอกที่สนใจ
, และยูกลีนาเป็นตามที่อธิบายไว้ในข้อ 1 ข้างต้น [ ความ ]
อะโกรแบคทีเรียมวิธีแต่เดิมใช้เป็น
การทรานสฟอร์มวิธีพืชการอะโกรแบคทีเรียมวิธีใช้อะโกรแบคทีเรียมซี ( ต่อจากนี้ " อะโกรแบคทีเรียม " ) , กรัม - ลบแบคทีเรียที่ทำให้เกิดเนื้องอกดิน

เรียกว่าถุงน้ำดีมงกุฎในพืช ยีนภาคเรียกว่าย้ายดีเอ็นเอ ( t-dna ) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของพลาสมิดขนาดใหญ่ที่เรียกว่าเนื้องอกกระตุ้น ( Ti ) พลาสมิด
อะโกรแบคทีเรียมเข้าสิง ,ออก , เข้าสู่เซลล์พืช
ผ่านประเภทที่สามของระบบการหลั่งและถูกนำเข้าสู่
จีโนมนิวเคลียร์โดยการเปรียบเทียบ ทำให้เกิดการพัฒนาเนื้องอก

การกำจัด t-dna ต้องการกลุ่มของยีนที่เรียกว่าความรุนแรง ( Vir ) ภูมิภาค แม้ว่าลำดับของทั้งคู่






บริเวณที่มีอยู่ในพลาสมิด TI ,บริเวณเหล่านี้เป็นที่รู้จักกันในการทำงานร่วมกัน แม้ว่าพวกเขาจะไม่ได้อยู่ในพลาสมิดเดียวกัน
[ ]
0035 อะโกรแบคทีเรียมวิธี โดยเฉพาะไบนารีเวคเตอร์
วิธี การไบนารีเวคเตอร์วิธีที่พัฒนาขึ้นโดยใช้คุณสมบัติของอะโกรแบคทีเรียม

อธิบายไว้ข้างต้นใช้สองแตกต่างกันพลาสมิด sในไบนารีเวคเตอร์วิธี Vir เขต
และ t-dna ภูมิภาค ซึ่งโดยเนื้อแท้ในพลาสมิดเดียวกัน
จะดำเนินการที่แตกต่างกันพลาสมิด S , และเหล่านี้พลาสมิด s
10 พร้อมกันใช้ มากขึ้นโดยเฉพาะอะโกรแบคทีเรียมแบก
ทั้งพลาสมิดที่มีเฉพาะ vir ภูมิภาค ( ผู้ช่วยพลาสมิด )