Heparin saccharide microarray fabri

Heparin saccharide microarray fabrication and interrogation
Saccharides from porcine mucosal heparin (Celsus Labs, Cincinnati,
OH, USA) were generated via partial digestion with heparinase
I (IBEX Technologies, Montreal, Canada) and size exclusion chromatography
fractionation using the procedure described previously
Table 1
Glycan composition of probes.
Expression system for screening of proteins / D.M.E. Otto et al. / Anal. Biochem. 411 (2011) 261–270 263[25,26]. A concentration series of approximately 8mer saccharides
was prepared, lyophilized, and resuspended in formamide (Sigma–
Aldrich Chemie, Steinheim, Germany) supplemented with 1.5 M
betaine (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA). Saccharide microarrays
were fabricated onto GAPS II microarray slides (Corning, Corning,
NY, USA) from low to high concentration with spots 0.36 mm apart
using a single MicroSpot 2500 split pin and a MicroGrid TAS robot
(Genomic Solutions, Huntingdon, UK) operated at 57% humidity
and 17 C. The coupling chemistry involves nucleophilic attack of
the amine on gamma aminopropylsilane (GAPS) slides to the carbonyl
of the heparin saccharide [27]. Spots were quality controlled
visually under a microscope, and slides were immediately microwave
heated (5 min at 50% power in an 850-W oven followed by
10 min cooling at room temperature in the dark) three times in succession
[27]. Slides were washed with deionized water (pH 7.0),
dried using an air compressor, and stored with dessicant at room
temperature in a sealed bag until required.
Slides were blocked with 1% (w/v) BSA (Fraction V, Sigma–
Aldrich) in PBS. Arrays were then sequentially incubated with
approximately 20 nM biotinylated protein–EGFP conjugates in filtered
physiological buffer, 1% BSA, 0.1% Tween 20 (Sigma–Aldrich),
and 1 lg/ml AlexaFluor-546-labeled streptavidin (Invitrogen) in
filtered PBS, 1% BSA, and 0.05% Tween 20. Incubations were performed
for 1 h at room temperature using a 16-well array incubation
chamber (Whatman) in a moist environment. Slides were
washed with deionized water (pH 7.0) for 5 min after each incubation
and dried using an air compressor.
Microarrays were scanned at 532 nm with 10 lm resolution
using a GenePix 4000A scanner (Molecular Devices) operated with
GenePix Pro 3.0 software. The photomultiplier tube intensity was
adjusted to the maximum permitted without saturation of any signals.
Fluorescent intensity analysis with GenePix Pro 3.0 software
used features fitted by eye to spots so that the diameter matched
that of the spot as closely as possible. Intensity values were exported
into Excel, and the mean of the difference between the mean feature
and background intensities for replicate spots was calculated.
Assessment of protein–protein interactions using Biacore
Measurement of protein–protein interactions was performed by
surface plasmon resonance using a Biacore X (Biacore, Uppsala,
Sweden). Streptavidin-coated chips were obtained from Biacore.
All experiments were performed in PBS containing 0.005% Tween
20 at pH 7.0. HCl (100 mM) was used for regeneration of the chips.
To immobilize the proteins, biotin–JAM-B–EGFP or biotin–JAM-C–
EGFP (8 lg/ml) was injected for 50 min over the surface of a
streptavidin chip at a flow rate of 1 ll/min. Unbound protein was
removed from the chip by washing with buffer. A JAM/anti-GFP
Ab mixture (1:10 molar ratio) was prepared, incubated at room
temperature for 1 h to allow complex formation, and then injected
for 12 min over the surface of the JAM-B- or JAM-C-coated chip.
The solution was replaced with running buffer for 6 min, and the
chip was regenerated with HCl and used sequentially for the next
injections of JAM/anti-GFP Ab. Anti-GFP Ab only (the amount used
in the 1:10 JAM/anti-GFP Ab complex) was injected over the chip
surface as a control at a flow rate of 5 ll/min. BIAevaluation software
was used for analysis of the data.
Results
High-throughput cloning and expression of type 1 membrane and
secreted proteins
The Gateway cloning system has several advantages over
conventional cloning strategies, particularly in terms of speed,
simplicity, and versatility [16]. Fig. 1A illustrates the key features
of the system developed for high-throughput surface expression
and screening of type 1 membrane and secreted proteins for protein–glycan
and protein–protein interactions. An entry clone containing
the leader peptide and extracellular region of interest,
corresponding to either a type 1 membrane protein or a secreted
protein, is recombined with a destination vector to generate an
expression clone. This encodes a GPI-anchored version of the protein
of interest together with an EGFP tag, an Avitag biotin acceptor
peptide, and a site for PP cleavage. This versatile expression system
can be used to generate cell-bound and cleaved forms of proteins
that can be optionally biotinylated using the BirA enzyme (Fig. 1B).
To evaluate this system, we selected several well-characterized
membrane and secreted proteins known to mediate either glycan
or protein interactions. These included members of the siglec family
of sialic acid-binding Ig-like lectins, the heparan sulfate-binding
proteins FGF-1 and BACE, and the heterotypic adhesion molecule
partners JAM-B and JAM-C. These proteins bind their ligands in a
divalent cation-independent manner; therefore, binding assays
were performed using Ca2+- and Mg2+-free media. Following drug
selection and FACS sorting for EGFP expression, stably expressing
CHO cell lines could be generated for all constructs tested. Flow
cytometric analysis for total endogenous EGFP expression and surface-expressed
EGFP revealed diagonal scatter in dot plots, indicating
efficient surface expression (Fig. 2).
Cell-based screens for protein–glycan interactions
To investigate whether the surface-expressed proteins could be
used to measure protein–glycan interactions, we focussed on siglecs-7,
-8, and -9, which are known from previous studies to have
distinct preferences for sialylated glycans [24]. Clustered siglecs
bind with high avidity to glycans presented in multimeric arrays
on PAA backbones [19,28], but when siglec-binding activity is expressed
at the cell surface, it is often inhibited by cis interactions
with sialic acids [5]. Therefore, CHO cells expressing siglecs-7, -8,
and -9 were treated with sialidase to remove the cis-interacting
sialic acids and assayed for binding to PAA–glycans (Fig. 3 and Table
1). None of the siglec-expressing CHO cells bound to lactose–
PAA used as a negative control, but selective binding was seen with
PAA–glycans known to bind each siglec, namely Sia2,8Sia (siglec-
7), 60
SU-SLex (siglec-8), and SLex (siglec-9) (Fig. 3 and Table 1).
These results demonstrate the utility of the cell expression system
for screening glycan interactions of membrane proteins.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เฮพาริน saccharide microarray ประดิษฐ์และมืดSaccharides จากช่วง mucosal เฮพาริน (Celsus Labs ซินซินนาติOH สหรัฐอเมริกา) ถูกสร้างผ่านการย่อยอาหารบางส่วนกับ heparinaseฉัน (IBEX เทคโนโลยี มอนทรีออล แคนาดา) และ chromatography แยกขนาดแยกส่วนที่ใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ตารางที่ 1องค์ประกอบ Glycan คลิปปากตะเข้ระบบคัดกรองโปรตีนนิพจน์ / D.M.E. ออตโต et al. / ทางทวารหนัก Biochem 411 (2011) 261-270 263 [25,26] ชุดความเข้มข้นประมาณ 8mer saccharidesถูกเตรียม lyophilized และ resuspended ใน formamide (ซิกมา-Aldrich Chemie, Steinheim เยอรมนี) เสริม ด้วย 1.5 Mbetaine (ซิก-Aldrich, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) Saccharide microarraysมีหลังสร้างบน microarray II ช่องสไลด์ (คอร์นทำ ผลิตกระจกของมันNY, USA) จากความเข้มข้นน้อยไปมากด้วยจุดแร 0.36 มม.ใช้ 2500 MicroSpot เดียวแยก pin และหุ่นยนต์ MicroGrid TASดำเนินการ (genomic โซลูชั่น Huntingdon, UK) ที่ 57% ความชื้นและ c 17 โจมตี nucleophilic ของเกี่ยวข้องกับเคมีคลัปamine บนภาพนิ่ง aminopropylsilane (ช่องว่าง) แกมมา carbonylของ saccharide เฮพาริน [27] จุดที่ถูกควบคุมคุณภาพมองเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ และภาพนิ่งได้ทันทีไมโครเวฟความร้อน (5 นาทีที่ 50% พลังงานในเตาอบประมาณ 850 W ตามด้วย10 นาทีความเย็นที่อุณหภูมิห้องในมืด) ครั้งที่สามในการสืบทอด[27] ภาพนิ่งถูกล้าง ด้วยน้ำ deionized (pH 7.0),แห้งใช้เป็นเครื่องอัดอากาศ และเก็บไว้กับ dessicant ห้องอุณหภูมิในถุงปิดผนึกจนต้องภาพนิ่งบล็อก 1% (w/v) (V เศษ ซิก-บีเอสเอAldrich) ใน PBS อาร์เรย์ถูกแล้วตามลำดับ incubated ด้วยประมาณ 20 conjugates โปรตีน – EGFP biotinylated nM ในกรองสรีรวิทยาบัฟเฟอร์ บีเอสเอ 1%, 0.1% Tween 20 (ซิก-Aldrich),และ 1 lg/มล AlexaFluor-546-ป้าย streptavidin (Invitrogen) ในกรอง PBS บีเอสเอ 1% และ 0.05% Tween 20 ดำเนิน incubationsสำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้องใช้บ่มเรย์ดี 16หอ (Whatman) ในสภาพแวดล้อมชุ่มชื่น ภาพนิ่งได้ล้าง ด้วยน้ำ deionized (pH 7.0) ใน 5 นาทีหลังจากแต่ละคณะทันตแพทยศาสตร์และใช้การอัดอากาศแห้งMicroarrays ถูกสแกนที่ 532 nm ด้วยความละเอียด 10 lmใช้สแกนเนอร์ 4000A GenePix (อุปกรณ์โมเลกุล) ดำเนินการด้วยGenePix Pro 3.0 ซอฟต์แวร์ มีความเข้มหลอด photomultiplierปรับค่าสูงสุดที่อนุญาต โดยไม่มีความเข้มของสัญญาณใด ๆวิเคราะห์ความเข้มเรืองแสงกับซอฟต์แวร์ GenePix Pro 3.0ใช้คุณลักษณะการติดตั้ง โดยตาจุดให้ตรงเส้นผ่าศูนย์กลางที่พักอย่างใกล้ชิดที่สุด ค่าความเข้มส่งออกใน Excel และค่าเฉลี่ยของความแตกต่างระหว่างคุณลักษณะหมายถึงและคำนวณพื้นหลังการปลดปล่อยก๊าซสำหรับจุด replicateการประเมินผลของการโต้ตอบโปรตีน – โปรตีนโดยใช้ Biacoreวัดโปรตีน – โปรตีนโต้ถูกดำเนินการโดยการสั่นพ้อง plasmon ผิวใช้ X Biacore (Biacore, Uppsalaสวีเดน) เคลือบ Streptavidin ชิได้รับจาก Biacoreดำเนินการทดลองทั้งหมดใน PBS ประกอบด้วย 0.005% Tween20 ที่ pH 7.0 HCl (100 mM) ใช้สำหรับการฟื้นฟูของการชิการ immobilize โปรตีน ไบโอติน – แจม-B – EGFP หรือไบโอติน – แยม-C-EGFP (8 lg/ml) เป็นหัวฉีดสำหรับ 50 นาทีเหนือพื้นผิวของการชิ streptavidin ที่อัตราไหลจะ 1 นาที Unbound โปรตีนได้เอาจากชิพ โดยการซักผ้าด้วยบัฟเฟอร์ แยม/ป้องกัน-GFPส่วนผสม Ab (1:10 อัตราส่วนสบ) ถูกเตรียม incubated ห้องอุณหภูมิสำหรับ h 1 ให้กำเนิดซับซ้อน และจากนั้น ฉีดสำหรับ 12 นาทีเหนือพื้นผิวของชิติด B หรือแยม-C-เคลือบโซลูชันถูกแทนที่ ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับต่ำสุด 6 ทำงานและชิถูกสร้าง ด้วย HCl และใช้ลำดับถัดไปฉีดต่อต้าน Ab. ติดต่อต้าน-GFP-GFP Ab เท่านั้น (จำนวนที่ใช้1:10 ในคอมเพล็กซ์ Ab แยม/ป้องกัน-GFP) ถูกฉีดผ่านชิพพื้นผิวเป็นตัวควบคุมอัตราไหลของจะ 5 นาทีซอฟต์แวร์ BIAevaluationใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลผลลัพธ์อัตราความเร็วสูงโคลนและของเมมเบรน 1 ชนิด และโปรตีน secretedเกตเวย์ cloning ระบบมีข้อดีหลายผ่านปกติโคลนกลยุทธ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแง่ของความเร็วความเรียบง่าย และคล่องตัว [16] Fig. 1A แสดงคุณสมบัติที่สำคัญระบบที่พัฒนาขึ้นสำหรับอัตราความเร็วสูงผิวนิพจน์และคัดกรองเมมเบรนชนิด 1 และวิลเลียม secreted สำหรับโปรตีน – glycanและโต้ตอบโปรตีน – โปรตีน โคลนเป็นรายการที่ประกอบด้วยนำเพปไทด์และภูมิภาค extracellular น่าสนใจที่สอดคล้องกับโปรตีนเมมเบรนชนิด 1 หรือที่ secretedโปรตีน มี recombined กับเวกเตอร์ปลายทางเพื่อสร้างความนิพจน์โคลน นี้จแมปรุ่น GPI ยึดของโปรตีนน่าสนใจพร้อมกับมีป้าย EGFP, acceptor การไบโอติน Avitagเพปไทด์ และเว็บไซต์สำหรับปริ PP ระบบนี้นิพจน์เอนกประสงค์สามารถใช้ในการสร้างเซลล์ที่ถูกผูกไว้ และแหวกรูปแบบของโปรตีนที่ได้เลือกใช้เอนไซม์ BirA (Fig. 1B) biotinylatedการประเมินระบบนี้ เราเลือกหลายแห่ง characterizedเมมเบรนและโปรตีนที่เรียกว่าบรรเทา glycan ใด secretedหรือโต้ตอบโปรตีน เหล่านี้รวมสมาชิกในครอบครัว siglecของกรด sialic ผูกเหมือน Ig lectins, heparan ซัลเฟตผูกโปรตีน FGF-1 และ BACE และโมเลกุลยึดเกาะ heterotypicคู่แจม B และ c ติด โปรตีนเหล่านี้ผูก ligands ของพวกเขาในการdivalent cation อิสระลักษณะ ดังนั้น ผูก assaysดำเนินการโดยใช้ Ca2 + - และ Mg2 + -ฟรีสื่อการ ยาต่อไปนี้เลือกและ FACS เรียงลำดับสำหรับนิพจน์ EGFP, stably แสดงสามารถสร้างรายการเซลล์ช่อสำหรับโครงสร้างทั้งหมดที่ทดสอบ ขั้นตอนการcytometric วิเคราะห์รวมนิพจน์ EGFP endogenous และ แสดงพื้นผิวEGFP เส้นทแยงมุมกระจายเปิดเผยในจุดผืน แสดงมีประสิทธิภาพผิวนิพจน์ (Fig. 2)เซลล์ตามหน้าจอสำหรับโปรตีน – glycan โต้ตอบการตรวจสอบว่า เป็นโปรตีนที่แสดงพื้นผิวเราใช้วัดโปรตีน – glycan โต้ focussed ใน siglecs-7-8 และ-9 ซึ่งเป็นที่รู้จักจากการศึกษาก่อนหน้านี้ได้กำหนดลักษณะที่แตกต่างกันสำหรับ sialylated glycans [24] Siglecs คลัสเตอร์ผูกกับ avidity สูงเพื่อแสดงในอาร์เรย์ multimeric glycansPAA backbones [19,28], แต่ เมื่อแสดงกิจกรรมผูก siglecที่ผิวเซลล์ มันเป็นมักจะห้าม โดยโต้ตอบล่วงหน้าด้วยกรด sialic [5] ดังนั้น ช่อเซลล์แสดง siglecs-7, -8และ-9 ได้รับการรักษา ด้วย sialidase เอาแบบ cis-โต้ตอบกรด sialic และ assayed สำหรับผูกกับ PAA – glycans (Fig. 3 และตาราง1) . ไม่มีเซลล์ช่อกำลัง siglec กับแล็กโทส –PAA ใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ แต่ผูกเลือกไม่เห็นด้วยPAA – glycans รู้จักผูกแต่ละ siglec ได้แก่ Sia2, 8Sia (siglec-7), 60SU-SLex (siglec-8), และ SLex (siglec-9) (Fig. 3 และตารางที่ 1)ผลเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงอรรถประโยชน์ของระบบเซลล์นิพจน์คัดกรอง glycan โต้ของเมมเบรนโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เฮผลิต microarray saccharide และสอบปากคำ
saccharides จากเฮเยื่อเมือกหมู (Celsus Labs, Cincinnati,
OH, USA) ถูกสร้างขึ้นผ่านการย่อยบางส่วนกับ heparinase
ฉัน (IBEX Technologies, Montreal, แคนาดา) และโคยกเว้นขนาด
แยกโดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
ตารางที่ 1
ไกลแคน องค์ประกอบของโพรบ.
ระบบการคัดกรองการแสดงออกของโปรตีน / DME อ็อตโตและคณะ / ก้น Biochem 411 (2011) 261-270 263 [25,26] ชุดความเข้มข้นของนํ้าตาลประมาณ 8mer
ถูกจัดทำขึ้นแห้งและ resuspended ในไมด์ (Sigma-
Chemie ดิช, Steinheim, เยอรมนี) เสริมด้วย 1.5 ล้าน
เบทาอีน (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) microarrays Saccharide
ถูกประดิษฐ์บนช่องว่างที่สองสไลด์ microarray (Corning, Corning,
NY, USA) จากต่ำไปความเข้มข้นสูงมีจุด 0.36 มมออกจากกัน
โดยใช้ Microspot เดียว 2500 แยกขาและ Microgrid มาตรฐานการบัญชีฉบับหุ่นยนต์
(โซลูชั่นจีโนม, Huntingdon สหราชอาณาจักร) ดำเนินการที่ ความชื้น 57%
และ 17 C. เคมีที่เกี่ยวข้องกับการมีเพศสัมพันธ์ nucleophilic โจมตีของ
เอมีนในแกมมา aminopropylsilane (ช่องว่าง) ภาพนิ่งคาร์บอนิล
ของ saccharide เฮ [27] จุดที่ได้รับการควบคุมคุณภาพ
การมองเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์และภาพนิ่งได้รับทันทีไมโครเวฟ
ความร้อน (5 นาทีที่กำลังไฟ 50% ในเตาอบ 850-W ตามด้วย
10 นาทีระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้องในที่มืด) สามครั้ง
[27] ภาพนิ่งถูกล้างด้วยน้ำกลั่นปราศจากไอออน (pH 7.0),
แห้งโดยใช้เครื่องอัดอากาศและเก็บไว้กับ dessicant ณ ห้อง
อุณหภูมิในถุงที่ปิดสนิทจนต้องใช้.
ภาพนิ่งถูกบล็อกด้วย 1% (w / v) บีเอสเอ (เศษส่วน V, Sigma-
ดิช ) ในพีบีเอส อาร์เรย์ถูกบ่มแล้วตามลำดับที่มี
ประมาณ 20 นาโนเมตร biotinylated conjugates โปรตีน EGFP ในกรอง
บัฟเฟอร์สรีรวิทยา BSA 1%, 0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich)
และ 1 LG / ml AlexaFluor-546 ป้าย streptavidin (Invitrogen) ใน
การกรองพีบีเอส , 1% BSA และ 0.05% Tween 20. ฟักตัวของเชื้อที่ได้ดำเนินการ
เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้อาร์เรย์ 16 ดีบ่ม
ห้อง (เบอร์) ในสภาพแวดล้อมที่ชื้น ภาพนิ่งที่ถูก
ล้างด้วยน้ำกลั่นปราศจากไอออน (pH 7.0) เป็นเวลา 5 นาทีหลังจากที่แต่ละบ่ม
และแห้งโดยใช้เครื่องอัดอากาศ.
microarrays ถูกสแกนที่ 532 นาโนเมตรที่มีความละเอียด 10 LM
ใช้สแกนเนอร์ 4000A GenePix (อุปกรณ์โมเลกุล) ดำเนินการกับ
GenePix Pro 3.0 ซอฟแวร์ ความเข้มหลอด photomultiplier ได้รับการ
ปรับให้สูงสุดที่ได้รับอนุญาตโดยไม่อิ่มตัวของสัญญาณใด ๆ .
การวิเคราะห์ความเข้มเรืองแสงกับ GenePix Pro 3.0 ซอฟต์แวร์
คุณสมบัติที่ใช้ติดตั้งได้ด้วยตาจุดเพื่อให้มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางที่ตรงกับ
ที่จุดใกล้เคียงมากที่สุด ค่าความเข้มถูกส่งออก
เป็น Excel และค่าเฉลี่ยของความแตกต่างระหว่างค่าเฉลี่ยคุณลักษณะ
และความเข้มของพื้นหลังสำหรับจุดซ้ำที่คำนวณ.
การประเมินผลการปฏิกริยาระหว่างโปรตีนโดยใช้ Biacore
วัดปฏิกริยาระหว่างโปรตีนได้ดำเนินการโดย
พื้นผิวด้วยคลื่น plasmon ใช้ Biacore X (Biacore อัปซาลา,
สวีเดน) ชิป Streptavidin เคลือบที่ได้รับจาก Biacore.
การทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการในพีบีเอสที่มี 0.005% Tween
20 ที่ 7.0 ค่า pH HCl (100 มิลลิเมตร) ถูกนำมาใช้สำหรับการฟื้นฟูของชิป.
เพื่อลื่อโปรตีน, ไบโอติน-JAM-B-EGFP หรือไบโอติน-JAM-C-
EGFP (8 LG / ml) ถูกฉีดสำหรับ 50 นาทีกว่าพื้นผิวของ
streptavidin ชิปที่อัตราการไหล 1 LL / นาที โปรตีนหลุดถูก
ลบออกจากชิปโดยล้างด้วยบัฟเฟอร์ JAM / ป้องกัน GFP
Ab ส่วนผสม (1:10 อัตราส่วนโดยโมล) ถูกจัดทำขึ้นบ่มที่อุณหภูมิห้อง
อุณหภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้การสร้างที่ซับซ้อนแล้วฉีด
เป็นเวลา 12 นาทีกว่าพื้นผิวของ JAM-B- หรือ JAM-C- ชิปเคลือบ.
แก้ปัญหาถูกแทนที่ด้วยการทำงานบัฟเฟอร์ 6 นาทีและ
ชิปถูกสร้างขึ้นใหม่ด้วย HCl และใช้ตามลำดับต่อไป
ฉีด JAM / ป้องกัน GFP Ab ต่อต้าน GFP Ab เท่านั้น (จำนวนเงินที่ใช้
ในการ 01:10 JAM / ป้องกัน GFP Ab ซับซ้อน) ถูกฉีดมากกว่าชิป
พื้นผิวการควบคุมอัตราการไหลที่ 5 LL / นาที ซอฟแวร์ BIAevaluation
ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล.
ผลการ
โคลนสูงผ่านและการแสดงออกของเมมเบรนชนิดที่ 1 และ
หลั่งโปรตีน
ระบบโคลนเกตเวย์มีข้อดีหลายประการมากกว่า
กลยุทธ์โคลนธรรมดาโดยเฉพาะอย่างยิ่งในแง่ของความเร็ว,
ความเรียบง่ายและความคล่องตัว [16] มะเดื่อ 1A แสดงให้เห็นถึงคุณสมบัติที่สำคัญ
ของระบบที่พัฒนาขึ้นสำหรับการแสดงออกของพื้นผิวสูงผ่าน
และการตรวจคัดกรองเมมเบรนชนิดที่ 1 และโปรตีนที่หลั่งสำหรับโปรตีนไกลแคน
และปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน โคลนรายการที่มี
เปปไทด์ผู้นำและภูมิภาค extracellular ที่น่าสนใจ
สอดคล้องกับทั้งชนิดที่ 1 โปรตีนเมมเบรนหรือหลั่ง
โปรตีนเป็น recombined กับเวกเตอร์ปลายทางที่จะสร้าง
โคลนการแสดงออก นี้ encodes รุ่น GPI-ทอดสมอของโปรตีน
ที่สนใจร่วมกับแท็ก EGFP, ใบเสร็จไบโอติน Avitag
เปปไทด์และเว็บไซต์สำหรับการแตกแยก PP ระบบการแสดงออกที่หลากหลายนี้
สามารถนำมาใช้ในการสร้างเซลล์และ cleaved รูปแบบของโปรตีน
ที่สามารถ biotinylated เลือกใช้เอนไซม์ Bira (รูปที่ 1B.).
เพื่อประเมินระบบนี้เราเลือกดีหลายลักษณะ
เยื่อและโปรตีนที่หลั่งมาเป็นที่รู้จักกันจะไกล่เกลี่ย ทั้งไกลแคน
ปฏิสัมพันธ์หรือโปรตีน เหล่านี้รวมถึงสมาชิกของครอบครัว siglec
ของกรด sialic ผูกพันเลคติน Ig เหมือนซัลเฟตมีผลผูกพัน heparan
โปรตีน FGF-1 และ BACE และโมเลกุลยึดเกาะ heterotypic
พันธมิตร JAM-B และ JAM-C โปรตีนเหล่านี้ผูกแกนด์ของพวกเขาใน
ลักษณะไอออนอิสระ divalent; ดังนั้นการตรวจผูกพัน
ได้ดำเนินการโดยใช้ Ca2 + - + และ Mg2 ปราศจากสื่อ ต่อไปนี้ยาเสพติด
การเลือกและการเรียงลำดับมาซึ่งการแสดงออก EGFP, เสถียรแสดง
เซลล์ CHO จะถูกสร้างขึ้นสำหรับโครงสร้างทดสอบทั้งหมด การไหลของ
การวิเคราะห์ cytometric สำหรับการแสดงออก EGFP ภายนอกทั้งหมดและพื้นผิวแสดง
EGFP เปิดเผยกระจายเส้นทแยงมุมในแปลงจุดแสดงให้เห็น
การแสดงออกของพื้นผิวที่มีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2)..
หน้าจอมือถือที่ใช้สำหรับการปฏิสัมพันธ์โปรตีนไกลแคน
ในการตรวจสอบไม่ว่าจะเป็นโปรตีนบนผิวแสดงออกอาจจะ
นำมาใช้ การวัดการปฏิสัมพันธ์โปรตีนไกลแคนเราเพ่งความสนใจไป siglecs-7,
-8 และ -9 ซึ่งเป็นที่รู้จักจากการศึกษาก่อนหน้านี้ที่จะมี
การตั้งค่าที่แตกต่างกันสำหรับ glycans sialylated [24] siglecs คลัสเตอร์
ผูกกับความโลภสูงเพื่อ glycans นำเสนอในอาร์เรย์ multimeric
บนกระดูกสันหลัง PAA [19,28] แต่เมื่อกิจกรรม siglec ผูกพันมีการแสดงออก
ที่เซลล์ผิวก็ถูกยับยั้งโดยมักจะถูกต้องปฏิสัมพันธ์
กับกรด sialic [5] ดังนั้นเซลล์ CHO แสดง siglecs-7, -8,
-9 และได้รับการรักษาด้วย sialidase เพื่อลบ CIS-ปฏิสัมพันธ์
กรด sialic และ assayed สำหรับผูกพันกับ PAA-glycans (รูปที่. 3 และตารางที่
1) ไม่มี siglec-แสดงเซลล์ CHO ผูกพันกับ lactose-
PAA ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ แต่เลือกผูกพันก็เห็นด้วย
PAA-glycans เป็นที่รู้จักกันในการผูกแต่ละ siglec คือ Sia2,8Sia (siglec-
7), 60
SU-SLeX (siglec -8) และ SLeX (siglec-9) (รูปที่. 3 และตารางที่ 1).
ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของระบบการแสดงออกเซลล์
สำหรับการคัดกรองไกลแคนปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนเมมเบรน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในเลือดสูง microarray การสอบสวน
ไรด์จากสุกร ( heparin ( เซลซุส Labs , ซิน
โอ้ , USA ) ถูกสร้างขึ้นผ่านการตัดด้วย heparinase
i ( IBEX เทคโนโลยี มอนทรีออล , แคนาดา ) และแยกขนาดโดยใช้วิธีการโครมาโตกราฟี
ยกเว้นอธิบายองค์ประกอบไกลแคนตารางที่ 1


ก่อนหน้านี้ของเครื่องมือตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีน / ระบบคัดกรอง d.m.e. อ๊อตโต้ et al . / ทวารหนัก วิชาเคมี 411 261 - 270 263 ( 2011 ) [ 25,26 ] ของชุดประมาณ 8mer ไรด์
ถูกเตรียมไว้ แห้ง และ resuspended ในฟอร์มาไมด์ ( Sigma )
steinheim chemie ดิช , Germany ) เสริมด้วย 1.5 M
บี ( Sigma ) Aldrich เซนต์หลุยส์ , โม , USA ) ิ
แซ็กคาไรต์ถูกประดิษฐ์บนช่องว่าง 2 microarray ภาพนิ่ง ( Corning , Corning ,
NY , USA ) จากสูงไปต่ำความเข้มข้นกับ 0.36 มม. จุดแยก
ใช้เดี่ยว microspot 2500 แยกขาและ
หุ่นยนต์ microgrid TAS ( จีโนม ) Huntingdon , สหราชอาณาจักร ) ดำเนินการ
ความชื้น 57% และ 17 C coupling เคมีเกี่ยวข้องกับการโจมตี nucleophilic ของ
เอมีนแกมมา aminopropylsilane ( ช่องว่าง ) ภาพนิ่งคาร์บอนิล
ในเลือดสูง [ 27 ] ปอที่มีคุณภาพควบคุม
มองเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ และภาพนิ่งได้ทันที ไมโครเวฟอุ่น (
5 นาที พลัง 50% ใน 850-w เตาอบตาม
10 นาทีความเย็นที่อุณหภูมิห้องในที่มืด ) สามครั้งในการทดแทน
[ 27 ] ภาพนิ่งที่ถูกล้างด้วยคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ ( pH 7.0 ) ,
อบแห้งโดยใช้เครื่องอัดอากาศ และจัดเก็บไว้ที่ห้อง
ศึกษาสมรรถนะอุณหภูมิในถุงปิดผนึกไว้จนต้อง
สไลด์ถูกบล็อกด้วย 1% ( w / v ) BSA ( ส่วน V (
Aldrich ซิกม่า ) ใน PBS เป็นอาร์เรย์ แล้วบ่มด้วย
ประมาณ 20 nm egfp –สารประกอบโปรตีนไลในกรอง
บัฟเฟอร์ทางสรีรวิทยา 1 % BSA , 0.1% Tween 20 ( Sigma ) ดิช )
1 LG / ml alexafluor-546-labeled streptavidin ( Invitrogen )
กรอง PBS , BSA , 1% และ 005 tween 20 incubations จำนวน
1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้งั้นห้องบ่ม
เรย์ ( whatman ) ในสภาพแวดล้อมที่ชื้น สไลด์กำลัง
ล้างด้วยคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ ( pH 7.0 ) 5 นาทีหลังจากที่แต่ละบ่ม
และแห้งโดยใช้ปั๊มลม .
ิถูกสแกนที่ 532 nm กับ 10 โดยละเอียด
ใช้ genepix 4000a สแกนเนอร์ ( อุปกรณ์ระดับโมเลกุล ) ดำเนินการด้วย
genepix Pro 30 ซอฟต์แวร์ ส่วนหลอด
ปรับความเข้มสูงสุดที่อนุญาตให้มีความเข้มของสัญญาณ การวิเคราะห์ความเข้มของการเรืองแสงด้วย

genepix Pro 3.0 ซอฟต์แวร์ที่ใช้คุณสมบัติของเข็มขัด โดยจุดที่ตาเพื่อให้เส้นผ่าศูนย์กลางตรงกัน
ที่จุดมากที่สุด . ค่าความเข้มส่งออก
ลงใน Excel และค่าเฉลี่ยของผลต่างระหว่างค่าเฉลี่ยคุณลักษณะ
และฉากหลังเข้มเพื่อสร้างจุดคำนวณ .
การประเมินของโปรตีนและโปรตีนปฏิสัมพันธ์โดยใช้การวัด biacore
โปรตีน–โปรตีนปฏิสัมพันธ์โดยใช้พื้นผิวโดยใช้ biacore PLASMON
( X ( biacore Uppsala , สวีเดน ,
) ชิป streptavidin เคลือบที่ได้จาก biacore .
ทั้งหมดทดลองใน PBS ที่มี 0.005% Tween
20 ที่ pH 7.0 .กรดไฮโดรคลอริก ( 100 มม. ) ใช้สำหรับการฟื้นฟูของชิป
ประคองโปรตีน biotin ไบโอติน––– jam-b egfp หรือ jam-c –
egfp ( 8 ) / ml ฉีด 50 นาทีผ่านพื้นผิวของ
streptavidin ชิพที่อัตราการไหล 1 จะจับกับโปรตีน
ลบออก / min จากชิป โดยล้างด้วยบัฟเฟอร์ แยม / anti GFP
AB ( อัตราส่วนผสม 1 : 10 ) ได้เตรียมการ บ่มที่ห้อง
อุณหภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อให้รูปแบบซับซ้อน แล้วฉีด
12 นาทีกว่าพื้นผิวของ jam-b - หรือ jam-c-coated ชิป
โซลูชั่นถูกแทนที่ด้วยบัฟเฟอร์วิ่ง 6 นาทีและ
ชิปสร้างใหม่ด้วย HCl และใช้ความสามารถในการฉีดครั้งต่อไปของ AB
Anti GFP แยม / anti GFP AB ( ปริมาณที่ใช้ 1 : 10
ในแยม / anti GFP AB ซับซ้อน ) ถูกฉีดผ่านชิป
พื้นผิวเป็นควบคุมที่อัตราการไหล 5 จะ / นาที biaevaluation
เป็นซอฟต์แวร์ที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล ผล

การโคลนและการแสดงออกของ throughput สูงชนิดที่ 1 และหลั่งโปรตีนเมมเบรน

ประตูโคลนระบบมีข้อดีหลายกว่า
กลยุทธ์โคลนธรรมดา โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแง่ของความเร็ว
ความเรียบง่ายและ ความเก่งกาจ [ 16 ] รูปที่ 1 แสดงให้เห็นถึง
คุณสมบัติหลักของระบบที่พัฒนาขึ้นเพื่อช่วยผิวสีหน้า
และคัดเลือกประเภท 1 และโปรตีนเมมเบรนที่มีโปรตีนและโปรตีนโปรตีนและไกลแคน
และการโต้ตอบ รายการโคลนที่มีหัวหน้าเขตและเปปไทด์และ

สนใจ สอดคล้องกับทั้งประเภท 1 เมมเบรนโปรตีนหรือโปรตีนน้ำนมหลั่ง
คือมีปลายทางที่จะสร้าง
เวกเตอร์การแสดงออกของโคลน นี้ Intel เป็น gpi ยึดรุ่นของโปรตีน
สนใจพร้อมกับ egfp แท็ก , avitag biotin พระนาสิก
เปปไทด์และเว็บไซต์ PP ความแตกแยก นี้อเนกประสงค์ระบบการแสดงออก
สามารถใช้ในการสร้างเซลล์ของโปรตีน
ผูกพันและรูปแบบที่สามารถเลือกใช้เอนไซม์ไลพีระ ( รูปที่ 1A ) .
เพื่อประเมินระบบเราเลือกหลายอย่างดีลักษณะ
เยื่อหลั่งโปรตีนชนิดหนึ่งเรียกว่าไกล่เกลี่ยให้ไกลแคน
หรือปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน ได้แก่ สมาชิกในครอบครัว siglec
ของกรดผูกพัน IG เหมือนเลคติน , heparan ซัลเฟตมีผลผูกพัน
โปรตีนและ fgf-1 bace และ Heterotypic ยึดเกาะโมเลกุล
พันธมิตร jam-b jam-c. โปรตีนเหล่านี้และผูกพวกเขาใน
ลิแกนด์ขนาดในลักษณะอิสระ ดังนั้น การใช้แคลเซียมได้ )
- mg2 - สื่อฟรี ต่อไปนี้การเลือกยา
facs การเรียงลำดับสำหรับการแสดงออกและ egfp อย่างถาวร , การแสดง
โชเซลล์สามารถถูกสร้างขึ้นเพื่อสร้างการทดสอบ การวิเคราะห์ลักษณะการไหล
สำหรับการแสดงออก egfp ทั้งหมดและพื้นผิวภายนอกแสดงออก
egfp เปิดเผยเส้นทแยงมุมกระจายจุดบ่งชี้
แปลงการแสดงออกของพื้นผิวที่มีประสิทธิภาพ ( รูปที่ 2 ) .
เซลล์ตามหน้าจอสำหรับโปรตีนและไกลแคนปฏิสัมพันธ์
เพื่อตรวจสอบว่า พื้นผิวมีโปรตีนเป็นโปรตีนและไกลแคน
ใช้มาตรการโต้ตอบ เราเน้น siglecs-7
- , 8 และ 9 ซึ่งเป็นที่รู้จักจากการศึกษาก่อนหน้านี้ที่จะมีการตั้งค่าที่แตกต่างกันสำหรับ sialylated glycans [
24 ] เมื่อซิกเล็คส์
ผูกกับ avidity สูง glycans นำเสนออาร์เรย์ multimeric
บนฟุต 19,28 Gbps [ ] , แต่เมื่อกิจกรรมผูก siglec แสดงออก
ที่ผิวเซลล์ มันมักจะถูกยับยั้งโดย CIS ปฏิสัมพันธ์กับกรดเซียริก
[ 5 ] ดังนั้น โชเซลล์แสดง siglecs-7 - 8
- 9 และได้รับการรักษาด้วยไซ ลิเดสเอากรดเซียริกและ CIS การโต้ตอบ
assayed ยึดป่า– glycans ( ฟิค3 และตาราง
1 ) ไม่มีของ siglec แสดงโช เซลล์ต้องแลคโตส -
ป้าใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ แต่ที่เลือกผูกเห็นกับ
ป้า– glycans รู้จักมัดแต่ละ siglec คือ sia2,8sia ( siglec -
7 ) , 60
ซู slex ( siglec-8 ) และ slex ( siglec-9 ) ( รูปที่ 1 และตารางที่ 1 ) .
ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของระบบเซลล์
การแสดงออกสำหรับไกลแคนปฏิสัมพันธ์ของเมมเบรนโปรตีนคัดกรอง