3. Results and discussionThe terms

3. Results and discussionThe terms DB and bioautogram are used when a chromatogram(developed plate) is applied to a bioassay to detect the bioactivecompounds in a complex sample. However, also TLC plates withonly applied reference substances or samples on (not developedplate) in combination with a bioassay were introduced as a TLC-DB bioautogram [5,21,23,24]. These two different methodologieswere not clearly distinguished in literature [3,22]. In this study,the demarcation line between both bioanalytical approaches wasclearly drawn. The TCY pattern (as a positive control) was onlyused as a pretest to select the seeded plate incubation time andinvestigate the effect of the growing broth on the visual or bioden-sitometric outcome.3.1. Selection of the analysis time for important bioautographicsteps3.1.1. The cultivation timeThe LB and HB broths, which were already used for B. s. culti-vation, were compared to a further self-designed broth (MLB). Thelatter consisted of peptone from meat and yeast, similar to the LBbroth. PBS were added to stabilize pH influences, glucose for growthand glycerol for viscosity adjustment.The routinely used pre-cultivation of B. s. was omitted in thisstudy. This was time-saving and led to a fast HPTLC-B. s. protocol,if compared to literature [21,24]. The B. s. spore suspension wasdirectly used to inoculate the broth. For monitoring of the bacterialgrowth, the measured value of OD600 nmwas plotted versus time (t)every 30 min over 15 h for three growing broths, i.e. HB, MLB andLB (Fig. S-1). By doing so, the exponential phase of the bacteria wasdetermined. HPTLC plates silica gel 60 were immersed in the bacte-ria broth at different OD600 nm≥ 0.4. Our observation showed thatdipping in B. s. broth with ODs calculated in the range of 0.7–0.9yielded homogeneous and intensive backgrounds. Hence, brothcultivation times of 6–8 h were recommended for our workflow.3.1.2. TheThe seeded plate incubation timeIn a pretest, five HPTLC plate strips containing a TCY calibrationpattern (2–0.5 ng/band each, not developed) were immersed at aspeed of 3.5 cm/s in the bacteria suspension for 6 s. These seededplate strips were incubated between 1 and 5 h (1-h intervals) in ahorizontal position in a moistened plastic box and then revealedwith MTT solution (Fig. S-2). An incubation time of 1 h did not leadto clear inhibition zones. The results obtained from 3 and 4 h werealmost similar to the outcome of 2 h. For prolonged incubationtimes (5 h), biodetectability was reduced. Thus, for a time-savingprotocol, a 2-h incubation time was selected. The five biodensi-tograms clearly showed that the 2-h incubation time led to the bestbiodetectability (Fig. S-2). The same procedure was also carried outfor separated sample extracts of Ocimum basilicum L. The bioauto-grams obtained (Fig. S-3) confirmed the 2-h incubation period [36].The short incubation time mitigated the diffusion of the inhibitionzones in the bioautogram as well as the break-off of the adsorbentafter incubation. It also was very time-saving in contrast to otherreports for seeded plate incubation [23].3.1.3. The MTT staining incubation timeReduction of MTT to formazan is associated to oxidation ofNADPH-dependent cellular oxidoreductase enzymes of living cells[37]. The incubated plates were immersed (1 s at a speed of3.5 cm/s) into the MTT solution and then incubated again for 30 minat 37◦C. Afterwards, the plate was dried on the TLC Plate Heater(already adjusted to 50◦C) for 10 min. The fast drying as well as theautomated immersion of the plates, instead of a spraying, enabled abetter visual contrast due to sharp inhibition zones, a homogenousbackground of the bioautogram and an even baseline for densito-metric measurement. It was evident that the fast drying after MTTincubation resulted in the rapid evaporation of the water, avoid-ing any further diffusion of the zones. Since formazan crystals areinsoluble in water, their color was more intense in the absence ofwater. Thus, via the fast drying, a post-treatment of the plate withethanol was skipped [20]. This reported extra step was applied toimprove the contrast due to the solubility of formazan in ethanol.3.2. Densitometric measurement of inhibition zones(biodensitometry)In most literature, the inhibition zone was quantitativelymeasured by a planimeter [4,5,21,23,24,26,27] and in a few otherstudies, densitometry was demonstrated, however, leading to neg-ative peaks [6,25]. DB results were thus similar to the densitometricevaluation of derivatization reagents producing lighter spots thanthe background. For latter, an inverse scan was used. The firstdensitometric measurement of a bioautogram using an inversescan was demonstrated by Akkad et al. (instructed by G.E.M.) [30],however, for quantitative evaluation of HPTLC-esterase inhibitionzones. In our study, the potential of the quantitative evaluation of aHPTLC-B. s. biodensitogram was comprehensively investigated andsuccessfully demonstrated for

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผล และเงื่อนไข discussionThe DB และ bioautogram จะใช้เมื่อ chromatogram (พัฒนาแผ่น) ใช้กับ bioassay การตรวจสอบการ bioactivecompounds ในตัวอย่างที่ซับซ้อน อย่างไรก็ตาม ยังสารอ้างอิงที่มีใช้แผ่น TLC หรือตัวอย่างบน (ไม่ developedplate) ร่วมกับ bioassay ถูกนำมาใช้เป็น bioautogram TLC DB [5,21,23,24] Methodologieswere แตกต่างกันเหล่านี้สองไม่ชัดเจนโดดเด่นในวรรณคดี [3,22] ในการศึกษานี้ เส้นแบ่งระหว่างทั้งสอง wasclearly วิธี bioanalytical ที่วาด รูป TCY (เป็นตัวควบคุมบวก) มี onlyused เป็นแล็ปว่าเลือกโรง andinvestigate แผ่นเงินบ่มเวลาผลของน้ำซุปเติบโต outcome.3.1 visual หรือ bioden-sitometric เลือกเวลาการวิเคราะห์ที่สำคัญ bioautographicsteps3.1.1 การเพาะปลูก timeThe LB และ HB broths ซึ่งถูกใช้ B. s. culti หนดสง ถูกเปรียบเทียบกับการออกแบบเองได้น้ำซุป (MLB) Thelatter ประกอบด้วย peptone จากเนื้อและยีสต์ คล้ายกับ LBbroth PBS ถูกเพิ่มเพื่อรักษาเสถียรภาพของค่า pH มีอิทธิพลต่อ กลูโคสสำหรับกลีเซอร growthand สำหรับปรับความหนืด การเพาะปลูกก่อนใช้ประจำ B. s. ถูกตัดออกใน thisstudy นี้คือ ประหยัดเวลา และนำการ B. HPTLC รวดเร็ว s. รโท ถ้าเทียบกับวรรณคดี [21,24] B. s. สปอร์ wasdirectly ระบบกันสะเทือนที่ใช้ปลูกฝีน้ำซุป สำหรับการตรวจสอบของ bacterialgrowth การ ค่าที่วัดได้ของ OD600 nmwas พล็อตเทียบกับเวลา (t) ทุก 30 นาทีกว่า 15 h 3 เติบโต broths เช่น HB, MLB andLB (มะเดื่อ S-1) การทำเช่นนั้น ขั้นตอนการชี้แจงของ wasdetermined แบคทีเรีย แผ่น HPTLC ซิลิก้าเจล 60 ถูกแช่อยู่ในน้ำซุป bacte ria ที่แตกต่างกัน OD600 nm≥ 0.4 เราสังเกตพบ thatdipping ในซุป s. B. ODs คำนวณในช่วง 0.7 – 0.9yielded พื้นหลังที่เข้มข้น และเหมือนกัน ดังนั้น brothcultivation เวลา 6-8 ชม.แนะนำสำหรับ workflow.3.1.2 ของเรา TheThe เตรียมแผ่นบ่ม timeIn แล็ปว่า ห้าแถบแผ่น HPTLC ประกอบด้วย TCY calibrationpattern (2 – 0.5 ng/วง ละ ไม่พัฒนา) ถูกแช่อยู่ใน aspeed 3.5 cm/s ในการระงับแบคทีเรีย 6 s ว่ามีการได้รับการแผ่นเหล่านี้ seededplate กกระหว่าง 1 ถึง 5 ชั่วโมง (ช่วงเวลา 1 ชม.) ในตำแหน่ง ahorizontal ในกล่องพลาสติกที่ชื้นและโซลูชัน MTT แล้ว revealedwith (มะเดื่อ S-2) มีเวลากกไข่ประมาณ 1 ชม.ได้ไม่ leadto ล้างยับยั้งโซน ผลลัพธ์ที่ได้จาก 3 และ 4 ของ werealmost h คล้ายกับผลของ 2 ชม สำหรับ incubationtimes เป็นเวลานาน (5 ชม.), biodetectability ลดลง ดังนั้น สำหรับเวลา savingprotocol เวลากกไข่ประมาณ 2 ชั่วโมงถูกเลือก Tograms biodensi ห้าที่ชัดเจนว่า เวลากกไข่ประมาณ 2 ชม.นำ bestbiodetectability (มะเดื่อ S-2) กระบวนการเดียวกันก็นำ outfor คั่นตัวอย่างสารสกัดจาก Ocimum basilicum L. Bioauto-กรัมที่ได้รับ (มะเดื่อ S-3) ยืนยันระยะเวลาบ่ม 2-h [36] เวลาบ่มสั้นลดกระจายของ inhibitionzones ใน bioautogram การและการหยุดลงของกกไข่ adsorbentafter นอกจากนี้มันยังถูกมากประหยัดเวลาตรงข้ามกับ otherreports สำหรับบ่มแผ่นเงิน [23] .3.1.3 MTT ที่ย้อมสีกกไข่ timeReduction ของ MTT formazan จะเกี่ยวข้องกับเอนไซม์ ofNADPH ขึ้นอยู่กับเซลลูลาร์ oxidoreductase ออกซิเดชันของเซลล์ชีวิต [37] แผ่น incubated ถูกแช่ (1 s ที่ความเร็ว of3.5 cm/s) ลงในโซลูชัน MTT และจากนั้น ได้รับการกกอีก 30 minat 37◦C หลังจากนั้น จานถูกแห้งบน Heater(already adjusted to 50◦C) แผ่น TLC สำหรับ 10 นาที แห้งและแช่ theautomated ของแผ่น แทนการฉีดพ่น เปิดใช้งาน abetter ภาพคมชัดเนื่องจากโซนยับยั้งคม homogenousbackground bioautogram การและหลักการแม้ densito วัดวัดเร็ว ก็เห็นได้ชัดว่า แห้งอย่างรวดเร็วหลังจาก MTTincubation ทำให้การระเหยของน้ำ หลีกเลี่ยง-ing ความแพร่โซน ตั้งแต่ formazan ผลึก areinsoluble ในน้ำ สีถูกขันทีใน ofwater ขาด ดังนั้น ผ่านเร็วให้แห้ง การรักษา withethanol แผ่นหลังถูกข้ามไป [20] นี้รายงานขั้นตอนพิเศษไม่ใช้ toimprove ความคมชัดเนื่องจากการละลายของ formazan ใน ethanol.3.2 วัด densitometric ยับยั้งโซน (biodensitometry) ในวรรณคดีส่วนใหญ่ โซนยับยั้งถูก quantitativelymeasured โดย planimeter [4,5,21,23,24,26,27] และ ในบาง otherstudies, densitometry ถูก แสดง อย่างไรก็ตาม ผู้นำ neg ative ยอด [6,25] DB ผลได้ซึ่งคล้ายกับ densitometricevaluation ของสาร derivatization ที่ผลิตพื้นหลังกว่าจุดน้ำหนักเบา สำหรับหลัง แกนผกผันเป็นใช้ วัด firstdensitometric bioautogram ใช้ inversescan ถูกแสดงโดย Akkad et al. (แนะนำ โดย G.E.M.) [30], อย่างไรก็ตาม การประเมินผลเชิงปริมาณของ HPTLC esterase inhibitionzones ในเรื่องการเรียน ศักยภาพของการประเมินเชิงปริมาณของ aHPTLC B. s. biodensitogram ถูกแสดงสำหรับ andsuccessfully ทั้งการตรวจสอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลและเงื่อนไข discussionThe DB bioautogram และถูกนำมาใช้เมื่อ chromatogram (จานพัฒนา) จะถูกนำไปใช้ในการตรวจสอบทางชีวภาพ bioactivecompounds ในตัวอย่างที่ซับซ้อน อย่างไรก็ตามยังแผ่น TLC withonly ใช้สารอ้างอิงหรือตัวอย่างใน (ไม่ developedplate) ร่วมกับชีวภาพถูกแนะนำว่าเป็น bioautogram TLC-DB [5,21,23,24] ทั้งสอง methodologieswere ที่แตกต่างกันอย่างเห็นได้ชัดไม่ได้โดดเด่นในวรรณคดี [3,22] ในการศึกษานี้เส้นแบ่งระหว่างวิธีการวาด Bioanalytical ทั้ง wasclearly รูปแบบ TCY (เป็นตัวควบคุมบวก) ถูก onlyused เป็นก่อนการทดลองเพื่อเลือกเวลาการบ่มเมล็ดแผ่น andinvestigate ผลกระทบของน้ำซุปที่กำลังเติบโตในภาพหรือ Bioden-sitometric outcome.3.1 การเลือกเวลาการวิเคราะห์สำหรับ bioautographicsteps3.1.1 สำคัญ การเพาะปลูก timeThe LB และซุปมิโสะ HB ซึ่งถูกนำมาใช้แล้วสำหรับบีเอส Culti-vation ถูกเมื่อเทียบกับน้ำซุปที่ตัวเองได้รับการออกแบบต่อไป (เอ็ม) Thelatter ประกอบด้วยเปปโตนจากเนื้อสัตว์และยีสต์คล้ายกับ LBbroth พีบีเอสมีการเพิ่มการรักษาเสถียรภาพค่า pH ที่มีอิทธิพลต่อกลูโคสสำหรับกลีเซอรอล growthand สำหรับ adjustment.The ความหนืดใช้เป็นประจำก่อนการเพาะปลูกของบีเอส ถูกมองข้ามใน thisstudy นี่คือที่ช่วยประหยัดเวลาและนำไปสู่​​การได้อย่างรวดเร็วโตกราฟี-B s โปรโตคอลถ้าเทียบกับวรรณกรรม [21,24] บีเอส สปอร์แขวนลอยที่ใช้ในการฉีดวัคซีน wasdirectly น้ำซุป สำหรับการตรวจสอบของ bacterialgrowth ที่ค่าที่วัดได้ของ OD600 nmwas พล็อตเมื่อเทียบกับเวลา (t) ทุก 30 นาทีกว่า 15 ชั่​​วโมงเป็นเวลาสามซุปมิโสะที่เพิ่มขึ้นคือ HB, เอ็ม andLB (รูป. S-1) โดยการทำเช่นขั้นตอนการชี้แจงของแบคทีเรีย wasdetermined แผ่นกราฟีซิลิกาเจล 60 ถูกแช่อยู่ในน้ำซุป bacte-RIA ที่แตกต่างกัน OD600 nm≥ 0.4 การสังเกตของเราแสดงให้เห็นใน thatdipping บีเอส น้ำซุปกับ ODS การคำนวณในช่วงของ 0.7-0.9yielded ภูมิหลังเป็นเนื้อเดียวกันและเข้มข้น ดังนั้นครั้ง brothcultivati​​on 6-8 ชั่วโมงได้รับการแนะนำสำหรับ workflow.3.1.2 ของเรา TheThe บ่มเมล็ดแผ่น timeIn ก่อนการทดลองห้าแถบแผ่นกราฟีที่มี TCY calibrationpattern (2-0.5 ng / วงแต่ละไม่ได้พัฒนา) ได้รับการแช่ที่ Aspeed 3.5 ซม. / วินาทีในแบคทีเรียระงับเป็นเวลา 6 วินาที เหล่านี้แถบ seededplate ถูกบ่มระหว่าง 1 และ 5 h (ช่วงเวลา 1 ชั่วโมง) ในตำแหน่ง ahorizo​​ntal ในกล่องพลาสติกชุบแล้ว revealedwith แก้ปัญหา MTT (รูป. S-2) เวลาฟักตัว 1 ชั่วโมงไม่ leadto โซนยับยั้งชัดเจน ผลที่ได้จากการที่ 3 และ 4 ชั่วโมง werealmost คล้ายกับผลของ 2 ชั่วโมง สำหรับ incubationtimes เป็นเวลานาน (5 ชั่​​วโมง) biodetectability ลดลง ดังนั้นสำหรับเวลา savingprotocol, 2 ชั่วโมงเวลาฟักตัวได้รับเลือก ห้า biodensi-tograms อย่างชัดเจนแสดงให้เห็นว่าเวลาฟักตัว 2 ชั่วโมงนำไปสู่​​การ bestbiodetectability (รูป. S-2) ขั้นตอนเดียวกันยังได้ดำเนินการ outfor แยกสารสกัดจากตัวอย่าง Ocimum basilicum ลิตร bioauto กรัมได้ (รูป. S-3) ได้รับการยืนยันระยะฟักตัว 2 ชั่วโมง [36] ได้โดยเริ่มต้นเวลาฟักตัวสั้นลดลงการแพร่กระจายของ inhibitionzones ที่ใน bioautogram เช่นเดียวกับการแบ่งออกจากการบ่ม adsorbentafter นอกจากนี้ยังเป็นอย่างมากที่ช่วยประหยัดเวลาในทางตรงกันข้ามกับ otherreports สำหรับการบ่มเพาะเมล็ดแผ่น [23] .3.1.3 บ่มย้อมสี MTT timeReduction ของ MTT formazan จะมีความสัมพันธ์ต่อการเกิดออกซิเดชัน ofNADPH ขึ้นอยู่กับเอนไซม์ oxidoreductase เซลล์ของเซลล์ที่มีชีวิต [37] แผ่นบ่มถูกแช่ (1 วินาทีที่ความเร็ว of3.5 ซม / s) เป็นวิธีการแก้ปัญหา MTT แล้วบ่มอีกครั้งสำหรับความสนใจ37◦C 30 หลังจากนั้นแผ่นแห้งในเครื่องทำแผ่น TLC (ปรับแล้ว50◦C) เป็นเวลา 10 นาที อบแห้งได้อย่างรวดเร็วเช่นเดียวกับการแช่ theautomated ของแผ่นแทนการฉีดพ่นที่เปิดใช้งานความคมชัดภาพผู้หนุนหลังเนื่องจากการยับยั้งโซนที่คมชัดเป็น homogenousbackground ของ bioautogram และแม้พื้นฐานสำหรับการวัด Densito-ตัวชี้วัด มันเห็นได้ชัดว่าหลังจากที่แห้งเร็ว MTTincubation ผลในการระเหยอย่างรวดเร็วของน้ำให้หลีกเลี่ยงการไอเอ็นจีใด ๆ การแพร่กระจายต่อไปของโซน เนื่องจากผลึก formazan areinsoluble ในน้ำสีของพวกเขาเป็นที่รุนแรงมากขึ้นในกรณีที่ไม่มี ofwater ดังนั้นผ่านการอบแห้งได้อย่างรวดเร็วหลังการรักษา withethanol แผ่นถูกข้าม [20] ขั้นตอนพิเศษรายงานนี้ถูกนำมาใช้ ได้แก่ การปรับปรุงความคมชัดเนื่องจากการละลายของ formazan ใน ethanol.3.2 วัด Densitometric ของโซนยับยั้ง (biodensitometry) ในวรรณคดีส่วนใหญ่บริเวณยับยั้งถูก quantitativelymeasured โดย Planimeter [4,5,21,23,24,26,27] และ otherstudies ไม่กี่ densitometry ก็แสดงให้เห็น แต่นำไปสู่​​การ NEG ยอด -ative [6,25] ผลดีบีจึงเป็นคล้ายกับ densitometricevaluation น้ำยาอนุพันธ์ผลิตจุดเบา thanthe พื้นหลัง สำหรับหลังการสแกนผกผันถูกนำมาใช้ การวัด firstdensitometric ของ bioautogram ใช้ inversescan ถูกแสดงให้เห็นโดยอัคและอัล (รับคำสั่งจาก GEM) [30] แต่สำหรับการประเมินผลเชิงปริมาณของกราฟี-esterase inhibitionzones ในการศึกษาของเรามีศักยภาพของการประเมินผลเชิงปริมาณของ aHPTLC-B s biodensitogram ถูกตรวจสอบครอบคลุมแสดงให้เห็นถึง andsuccessfully สำหรับ