Amino acids analysisThe methodology

Amino acids analysis
The methodology for acid hydrolysis of protein material
was adapted from Zumwalt et al. [22]. To a test tube with a
screw cap with PTFE coating was rigorously weighed
10 mg of freeze-dried material. To each sample, 2 mL
hydrochloric acid (HCl) 6 M was added; the content of the
tubes was frozen in liquid nitrogen, evacuated during 1 min
with a vacuum pump and refilled with nitrogen. After
thawing, the suspension was sonicated for 5 min in an
ultrasound bath at room temperature. The procedure of
freezing–vacuum–sonication was repeated twice. The
hydrolysis took place during 24 h at 110 C using a heating
block. After cooling to room temperature, 500 lL of the
Fig. 1 The S. Bartolomeu pear.
a Fresh pears and pears dried by
different technologies:
b Traditional, c GH1, d GH2
and e HAT
Eur Food Res Technol (2011) 233:637–646 639
123
internal standard solution (norleucine 5.0 mM in HCl
0.1 M) was added and the tubes content was evaporated to
dryness under vacuum in a centrifugal evaporator. The
resulting material was dissolved in 1 mL HCl 0.1 M and
filtered with 0.45 lm filters. For the analysis of free amino
acids, 10 mg of each sample was suspended in 2 mL of a
solution of HCl 0.1 M and spiked with 500 lL of the
internal standard solution. The suspension was left stirring
for several hours and then was filtered with 0.45 lm filters.
The solutions containing the released amino acids were
dried under vacuum using a centrifugal evaporator.
The derivatization of amino acids for GC analysis was
performed according to the methodology described by
MacKenzie et al. [23]. The resultant solid residue was
dissolved in 200 lL of a solution of 3 M HCl in isobutanol.
This solution was prepared by adding 270 lL of acetyl
chloride per mL of dry isobutanol; the isobutanol was dried
with calcium hydride, distilled and stored with molecular
sieves 4 A ° . The mixture was heated to 120 C for 10 min
and, after shaking in a vortex, was heated for further
30 min. After cooling to ambient temperature, the excess of
reagent was evaporated under vacuum using a centrifugal
evaporator. Then, 200 lL of a solution of 0.2 mg mL-1
BHT prepared in ethyl acetate was added and the solvent
was removed under vacuum in a centrifugal evaporator.
Afterwards, 100 lL of heptafluorobutyric anhydride was
added and the mixture was heated during 10 min at 150 C.
After cooling to room temperature, the excess of solvent
was removed under vacuum and the material obtained was
dissolved in 50 lL of ethyl acetate and analysed immediately
or frozen at -20 C until analysis.
Separation of amino acids was achieved by gas chromatography,
carried out in a PerkinElmer Clarus 400
instrument (PerkinElmer, Massachusetts, USA) equipped
with a flame ionisation detector (FID). The injector was
kept at 250 C and the detector at 260 C. Hydrogen was
used as carrier gas. A DB-1 (30 m, 0.25 mm i.d. and
0.15 lm thickness) fused-silica capillary column (J & W
Scientific) was used with the following temperature programme:
1 min hold at 70 C, increase to 170 C at 2.0 C/
min and then to 250 C (5 min hold) at 16 C min-1. The
compounds were identified by their retention times and
chromatographic comparison with authentic standards.
Quantification was based on the internal standard method
using L-norleucine, and the calibration curves were built for
18 amino acids. For asparagine (Asn) and aspartic acid
(Asp), as well as for glutamine (Gln) and glutamic acid
(Glu), the methodology does not allow the distinction
between the amide and carboxylic acid functions. As such,
those amino acids were quantified together as Asx and Glx,
respectively. Also, the methodology used did not allow the
detection of His. The limit of quantification of analysed
amino acids was determined to be ten times the value of the
residual signal peaks.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์กรดอะมิโนวิธีสำหรับไฮโตรไลซ์กรดโปรตีนวัสดุถูกดัดแปลงจาก Zumwalt et al. [22] การทดสอบหลอดด้วยการฝาครอบสกรูกับเคลือบไฟเบอร์ถูกทดสอบน้ำหนักกรอบวัสดุ 10 มก. แต่ละอย่าง 2 mLเพิ่มกรดไฮโดรคลอริก (HCl) 6 M เนื้อหาของการหลอดถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว อพยพในช่วง 1 นาทีกับปั๊มสุญญากาศ และเติม ด้วยไนโตรเจน หลังจากthawing ระบบกันสะเทือนถูก sonicated สำหรับ 5 นาทีในการอัลตร้าซาวด์ที่อ่างอาบน้ำที่อุณหภูมิห้อง ขั้นตอนของจุดเยือกแข็งสุญญากาศ-sonication ถูกซ้ำสอง ที่ไฮโตรไลซ์เกิดระหว่าง 24 ชมที่ใช้ให้ความร้อน C 110บล็อก หลังจากทำความเย็นกับอุณหภูมิห้อง 500 จะของลูกแพร์ Bartolomeu S. fig. 1สดแพร์และแพร์แห้งโดยเทคโนโลยีที่แตกต่างกัน:b แบบดั้งเดิม c GH1, d GH2และอีหาดใหญ่อาหาร Eur Res 233:637 Technol (2011) – 646 639123สารละลายมาตรฐานภายใน (norleucine HCl 5.0 มม.เพิ่ม 0.1 M) และหลอดเนื้อหาหายไปไปความแห้งกร้านภายใต้สุญญากาศใน evaporator แรงเหวี่ยง ที่วัสดุได้ถูกละลายใน 1 mL HCl 0.1 M และกรองกับตัวกรอง 0.45 lm สำหรับการวิเคราะห์ของฟรีอะมิโนกรด มิลลิกรัม 10 ของแต่ละอย่างถูกหยุดชั่วคราวใน 2 mL ของการโซลูชั่นของ HCl 0.1 M และ spiked กับ 500 จะของสารละลายมาตรฐานภายใน การระงับที่เหลือกวนเวลาหลายชั่วโมงแล้ว ถูกกรองกับ 0.45 lmโซลูชั่นที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนนำออกใช้ได้อบแห้งภายใต้สุญญากาศโดยใช้ evaporator แรงเหวี่ยงมี derivatization ของกรดอะมิโนสำหรับวิเคราะห์ GCปฏิบัติตามวิธีที่อธิบายไว้โดยแมค et al. [23] ตกค้างแข็งผลแก่ได้ละลายใน 200 จะแก้ไขปัญหาของ 3 M HCl ใน isobutanolวิธีนี้ถูกจัดเตรียม โดยการเพิ่ม 270 จะของ acetylคลอไรด์ต่อ mL isobutanol แห้ง isobutanol ไม่แห้งมีแคลเซียมไฮไดรด์ กลั่น และเก็บไว้กับโมเลกุลsieves 4 A องศา ส่วนผสมมีอุณหภูมิ 120 C สำหรับ 10 นาทีและ หลังจากการสั่นในการ vortex ถูกความร้อนสำหรับเพิ่มเติม30 นาที หลังจากทำความเย็นกับอุณหภูมิ เกินของรีเอเจนต์หายไปภายใต้สุญญากาศโดยใช้แรงเหวี่ยงที่evaporator 200 แล้ว จะของโซลูชันมิลลิกรัม 0.2 mL-1เพิ่มบาทเตรียมในเอทิล acetate และตัวทำละลายถูกเอาออกไปภายใต้สุญญากาศใน evaporator แรงเหวี่ยง100 หลัง ถูกจะ heptafluorobutyric anhydrideเพิ่ม และส่วนผสมถูกความร้อนระหว่างที่ 150 เซลเซียส 10 นาทีหลังจากทำความเย็นกับอุณหภูมิห้อง เกินของตัวทำละลายถูกเอาออกไปภายใต้สุญญากาศและวัสดุรับได้ละลายใน 50 จะของเอทิล acetate และ analysed ทันทีหรือแช่แข็งที่-20 C จนถึงการวิเคราะห์สำเร็จ โดย chromatography ก๊าซ แยกกรดอะมิโนดำเนินการในการ PerkinElmer Clarus 400ตราสาร (PerkinElmer รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับมีเปลวไฟ ionisation จับ (FID) หัวฉีดที่มีเก็บไว้ที่ 250 C และเครื่องตรวจจับที่ 260 C. ไฮโดรเจนได้ใช้เป็นผู้ขนส่งก๊าซ DB-1 (30 m, 0.25 มม.ประชาชน และความหนา 0.15 lm) นส่วน fused รูพรุนคอลัมน์ (J และ Wวิทยาศาสตร์) ใช้กับโปรแกรมอุณหภูมิต่อไปนี้:ค้างไว้ 1 นาทีที่ 70 C เพิ่มถึง 170 C 2.0 C /นาทีแล้ว 250 C (5 นาทีค้าง) ที่ 16 C min-1 ที่สารประกอบไม่ระบุเวลาเก็บรักษาของพวกเขา และการเปรียบเทียบกับอาหารมาตรฐาน chromatographicนับเป็นไปตามวิธีการมาตรฐานภายในL norleucine และปรับแต่งเส้นโค้งถูกสร้างขึ้นเพื่อกรดอะมิโน 18 Asparagine (Asn) และ aspartic กรด(Asp), เช่นส่วน glutamine (Gln) และกลูตาเมต(Glu), ระเบียบวิธีไม่ให้แตกระหว่าง amide และฟังก์ชัน carboxylic กรด เช่นกรดอะมิโนเหล่านั้นได้ quantified กันเป็น Asx และ Glxตามลำดับ ยัง วิธีใช้ไม่อนุญาตการตรวจสอบของเขา จำนวนนับของ analysedกำหนดให้ สิบครั้งค่าของกรดอะมิโนยอดสัญญาณส่วนที่เหลือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์กรดอะมิโน
วิธีการสำหรับการย่อยสลายกรดของวัสดุโปรตีน
ดัดแปลงมาจาก Zumwalt et al, [22] เพื่อหลอดทดลองที่มี
ฝาเกลียวที่มีการเคลือบ PTFE ได้รับการชั่งน้ำหนักอย่างจริงจัง
10 มิลลิกรัมของวัสดุที่แห้ง ตัวอย่างแต่ละ 2 มิลลิลิตร
กรดไฮโดรคลอริก (HCl) 6 M ถูกบันทึก; เนื้อหาของ
ท่อถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวอพยพในช่วง 1 นาที
กับปั๊มสุญญากาศและเติมด้วยไนโตรเจน หลังจากที่
ละลายระงับถูก sonicated เป็นเวลา 5 นาทีในการ
อาบน้ำอัลตราซาวนด์ที่อุณหภูมิห้อง ขั้นตอนของการ
แช่แข็งสูญญากาศ sonication ซ้ำเป็นครั้งที่สอง
การย่อยสลายเกิดขึ้นในช่วง 24 ชั่วโมงที่ 110 องศาเซลเซียสโดยใช้ความร้อน
บล็อก หลังจากที่การระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้อง 500 LL ของ
รูป 1. เอส Bartolomeu ลูกแพร์
ลูกแพร์สดและลูกแพร์แห้งโดย
เทคโนโลยีที่แตกต่าง:
ขดั้งเดิมค GH1, GH2 d
และ e HAT
Eur อาหาร Res เทคโนโลยี (2011) 233: 637-646 639
123
สารละลายมาตรฐานภายใน (norleucine 5.0 มิลลิใน HCl
0.1 M) ถูกบันทึกและเนื้อหาหลอดก็จะระเหย
แห้งภายใต้สูญญากาศในเครื่องระเหยแบบแรงเหวี่ยง
วัตถุอันเป็นผลถูกละลายใน 1 มิลลิลิตร 0.1 M HCl และ
กรอง 0.45 ไมครอนกรอง สำหรับการวิเคราะห์ของอะมิโนอิสระ
กรด 10 มิลลิกรัมของกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนถูกระงับใน 2 มิลลิลิตร
แก้ปัญหาของ HCl 0.1 M และถูกแทง 500 LL ของ
สารละลายมาตรฐานภายใน ระงับถูกทิ้งกวน
เป็นเวลาหลายชั่วโมงแล้วถูกกรองด้วย 0.45 ไมครอนกรอง.
การแก้ปัญหาที่มีกรดอะมิโนที่ปล่อยออกมาได้รับการ
อบแห้งภายใต้สูญญากาศใช้เครื่องระเหยแบบแรงเหวี่ยง.
อนุพันธ์ของกรดอะมิโนสำหรับการวิเคราะห์ GC ได้รับการ
ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายโดย
แม็คเคนซี่ et al, [23] สารตกค้างที่เป็นของแข็งผลถูก
. ละลายใน 200 LL ของการแก้ปัญหาของ 3 M HCl isobutanol ใน
การแก้ปัญหานี้ถูกจัดทำขึ้นโดยการเพิ่ม 270 LL ของ acetyl
คลอไรด์ต่อมิลลิลิตร isobutanol แห้ง; isobutanol แห้ง
ไฮไดรด์ที่มีแคลเซียมกลั่นและเก็บไว้กับโมเลกุล
sieves 4 ° ส่วนผสมที่ถูกความร้อนถึง 120 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที
และหลังจากเขย่าในน้ำวนถูกความร้อนเป็นเวลาอีก
30 นาที หลังจากที่การระบายความร้อนที่อุณหภูมิโดยรอบส่วนที่เกินจาก
สารระเหยได้รับภายใต้สูญญากาศใช้แรงเหวี่ยง
ระเหย จากนั้น 200 LL ของการแก้ปัญหา 0.2 มิลลิกรัมมิลลิลิตร-1
บาทจัดทำขึ้นเอทิลอะซิเตถูกบันทึกและตัวทำละลาย
จะถูกลบออกภายใต้สูญญากาศในเครื่องระเหยแบบแรงเหวี่ยง.
หลังจากนั้น 100 LL ของสารประกอบ heptafluorobutyric ถูก
เพิ่มและส่วนผสมที่ถูกความร้อนในช่วง 10 นาทีที่ 150 องศาเซลเซียส.
หลังจากที่การระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้องเกินของตัวทำละลาย
จะถูกลบออกภายใต้สูญญากาศและวัสดุได้ถูก
กลืนหายไปใน 50 ของ LL เอทิลอะซิเตและวิเคราะห์ทันที
หรือแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนถึงการวิเคราะห์.
แยกกรดอะมิโนก็ประสบความสำเร็จโดย โคก๊าซ
ดำเนินการใน PerkinElmer Clarus 400
ตราสาร (PerkinElmer, Massachusetts, สหรัฐอเมริกา) ติดตั้ง
เครื่องตรวจจับที่มีเปลวไฟ Ionisation (FID) หัวฉีดที่ได้รับการ
เก็บรักษาไว้ที่ 250 องศาเซลเซียสและเครื่องตรวจจับที่ 260 องศาเซลเซียส ไฮโดรเจนถูก
นำมาใช้เป็นก๊าซ DB-1 (30 ม., 0.25 มมรหัสและ
ความหนา 0.15 ไมครอน) คอลัมน์ฝอยผสมซิลิกา (J & W
วิทยาศาสตร์) ถูกนำมาใช้กับโปรแกรมอุณหภูมิต่อไปนี้:
1 นาทีไว้ที่ 70 องศาเซลเซียสเพิ่มขึ้นถึง 170 C ที่ 2.0? ? C /
นาทีแล้วถึง 250? C (5 นาทีถือ) ที่ 16 องศาเซลเซียส 1 นาที
สารประกอบที่ถูกระบุเวลาการเก็บรักษาของพวกเขาและ
โครมาเปรียบเทียบกับมาตรฐานของแท้.
ปริมาณขึ้นอยู่กับวิธีการมาตรฐานภายใน
โดยใช้ L-norleucine และเส้นโค้งการสอบเทียบที่ถูกสร้างขึ้นสำหรับ
18 กรดอะมิโน สำหรับ asparagine (Asn) และกรด aspartic
(งูเห่า) เช่นเดียวกับการ glutamine (Gln) และกรดกลูตามิก
(Glu) วิธีการที่ไม่อนุญาตให้มีความแตกต่าง
ระหว่างเอไมด์และฟังก์ชั่นกรดคาร์บอกซิ เช่น
กรดอะมิโนเหล่านั้นถูกวัดกันเป็น ASX และ Glx,
ตามลำดับ นอกจากนี้วิธีการที่ใช้ไม่อนุญาตให้มี
การตรวจสอบของเขา ขีด จำกัด ของการวิเคราะห์ปริมาณ
กรดอะมิโนที่มุ่งมั่นจะเป็นสิบครั้งมูลค่าของ
ยอดสัญญาณที่เหลือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กรดอะมิโนการวิเคราะห์

วัสดุโดยใช้กรดของโปรตีนถูกดัดแปลงจากซัมเวิลต์ et al . [ 22 ] ในหลอดทดลองด้วย
ฝาเกลียวเคลือบ PTFE เป็นอย่างจริงจังหนัก
10 mg ของอบแห้งวัสดุ ตัวอย่าง , 2 ml
กรดเกลือ ( HCl ) 6 M เพิ่มเนื้อหาของ
ท่อแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว การอพยพในช่วง 1 นาที
กับปั๊มสุญญากาศและเติมด้วยไนโตรเจน หลังจาก
ละลาย , ถูกระงับ sonicated เป็นเวลา 5 นาทีใน
อัลตร้าซาวด์นํ้าที่อุณหภูมิห้อง กระบวนการแช่แข็งสูญญากาศ– sonication
และทำซ้ำสองครั้ง
ไฮโดรไลซิสเกิดขึ้นในระหว่าง 24 ชั่วโมง ที่ 110  C โดยใช้บล็อกร้อน

หลังจากเย็นที่อุณหภูมิห้อง , 500 จะของ
รูปที่ 1 ลูกแพร์ . bartolomeu .
สดและแห้ง
ลูกแพร์ลูกแพร์เทคโนโลยีที่แตกต่าง :
b แบบดั้งเดิม C gh1 , D และ E หมวก

gh2 EUR อาหาร RES TECHNOL ( 2011 ) – 646 ไม่ได้

233:637 123 ภายในมาตรฐานโซลูชั่น ( นอร์ลิวซีน 5.0 มม. ใน 0.1 M HCl
) เพิ่มเนื้อหาและท่อระเหยแห้งภายใต้สูญญากาศใน

เครื่องเหวี่ยง
ผลวัสดุที่ละลายในกรดไฮโดรคลอริก 0.1 M
1 มิลลิลิตร และกรองด้วยตัวกรอง 0.45 ไมโครเมตร สำหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน
ฟรี10 มิลลิกรัมของแต่ละตัวอย่างถูกระงับใน 2 มิลลิลิตรของสารละลาย 0.1 M HCl และ

C 500 จะโซลูชั่นมาตรฐานภายใน ช่วงล่างซ้ายกวน
เป็นเวลาหลายชั่วโมงแล้ว ก็กรองด้วยตัวกรอง 0.45 ไมโครเมตร
โซลูชั่นที่มีกรดอะมิโนถูกปล่อยแห้งภายใต้สูญญากาศใช้

เครื่องเหวี่ยง กับกรดอะมิโนเพื่อวิเคราะห์ GC คือ
ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายโดย
แม็คเคนซี่ et al . [ 23 ] กากของแข็งที่ละลายใน ผลลัพธ์คือ
200 จะเป็นโซลูชั่นของ 3 M HCl ในไอโซบิวทานอล .
วิธีนี้เตรียมได้โดยการเพิ่ม 270 จะของคลอไรด์อะ
ต่อมิลลิลิตรของบริการไอโซบิวทานอล ; ไอโซบิวทานอลก็แห้ง
กับแคลเซียมไฮไดรด์กลั่นและเก็บไว้กับโมเลกุล
ตะแกรง 4 องศา . ส่วนผสมก็ร้อนถึง 120  C 10 นาที
และหลังจากสั่นในน้ำวน , ให้ความร้อนต่อไป
30 นาที หลังจากเย็นเพื่ออุณหภูมิห้อง , ส่วนเกินของสารเคมีที่ระเหยภายใต้สุญญากาศโดยใช้
ถูกระเหยจี

แล้ว 200 จะหาทางออกของ 0.2 มก. แน่นอน
บาทที่เตรียมไว้ในเอทิลอะซิเตตเป็นตัวทำละลาย
และออกภายใต้สุญญากาศในปั๊มแรงเหวี่ยง .
หลังจากนั้น 100 จะ heptafluorobutyric
แอนไฮไดรด์และเพิ่มส่วนผสมอุ่นในช่วง 10 นาที 150  C .
เมื่อเย็นที่อุณหภูมิห้อง , ส่วนเกินของตัวทำละลาย
ถูกลบออกภายใต้สูญญากาศและวัสดุได้รับ
ละลาย 50 จะของเอทิลอะซิเตท และวิเคราะห์ทันที
หรือแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส จน  การวิเคราะห์ .
แยกกรดอะมิโนมีความโดย โครมาโตกราฟีก๊าซ
ดำเนินการใน Perkinelmer clarus 400
( Perkinelmer เครื่องดนตรี ,Massachusetts , USA ) ติดตั้ง
ด้วยเปลวไฟ ionisation ตรวจจับ ( FID ) หัวฉีดคือ
ไว้ที่ 250  C และเครื่องตรวจจับที่ 260  C . ไฮโดรเจนคือ
ใช้เป็นแก๊สตัวพา เป็น db-1 ( 30 เมตร , 0.25 มม. และความหนา 0.15 โดยระบุ
คอลัมน์ซิลิกา C ( J & W
ทางวิทยาศาสตร์ ) ใช้กับโปรแกรมอุณหภูมิต่อไปนี้ :
1 นาทีไว้ที่ 70  C เพิ่มขึ้นถึง 170  2.0  C /
c ที่มินแล้ว 250  C ( 5 นาทีค้าง ) ที่ 16  C min-1 .
สารประกอบกลุ่มเท่าความคงทนของพวกเขาและ
เมื่อเปรียบเทียบกับมาตรฐานของแท้
ปริมาณขึ้นอยู่กับภายในวิธีการมาตรฐาน
ใช้ l-norleucine และเส้นโค้งสอบเทียบถูกสร้างขึ้นสำหรับ
18 กรดอะมิโน . สำหรับ asparagine ( ขึ้น ) และกรดแอสปาร์ติก
( ASP ) รวมทั้งกลูตามีน ( gln ) และกรดกลูตามิก
( GLU ) และไม่อนุญาตให้ความแตกต่าง
ระหว่างเอไมด์และฟังก์ชั่นกรดอินทรีย์ . เช่น มีปริมาณกรดอะมิโน
เหล่านั้นเข้าด้วยกัน และ GLX
ASX , ตามลำดับ นอกจากนี้ วิธีการที่ใช้ไม่อนุญาตให้
ตรวจสอบของเขา ขีดจำกัดของปริมาณของกรดอะมิโน ตั้งใจที่จะวิเคราะห์
เป็นสิบเท่าของมูลค่าของ
ยอดสัญญาณที่เหลือ