2.7. Total RNA extraction and RT-qP

2.7. Total RNA extraction and RT-qPCR analysis
Total RNA was extracted using the RNAprep pure plant total
RNA extraction kit (Tiangen, Beijing, China) according to the manufacturer’s
instructions. The possible DNA contamination was
eliminated by adding RNase-free DNase I. The integrity of the RNA
was detected by 0.8% agarose gel electrophoresis.
The RNA samples were reversely transcribed into cDNAs. In
brief, 5 L RNA mixed with 5 L dNTP (2.5 mM) and 1 L oligo
d(T)15 was incubated for 5 min at 65 ◦C. The resulting mixture was
cooled immediately, placed in 5 L M-MLV 5×
reaction buffer, 1 L
cloned ribonuclease inhibitor, 1 L M-MLV reverse transcriptase,
and RNase-free ddH2O to a final volume of 25 L, mixed gently,
and then incubated at 37 ◦C for 1 h. The reaction was completed at
70 ◦C for 15 min. The cDNA products were stored at
−20 ◦C.
Real-time PCR analysis was performed as described by Jain [27].
In brief, the cDNA samples were used as the template and mixed
with 200 nM of each primer and SYBR Green PCR Real Master Mix
(Tiangen, Beijing, China) for real-time PCR analysis using ABI 7500
Real Time PCR System and Software 7500 v2.0.3 (Applied Biosystems,
USA) according to the manufacturer’s instructions. The PCR
conditions were as follows: 95 ◦C for 3 min; 40 cycles of 95 ◦C for
30 s, 57 ◦C for 30 s, and 68 ◦C for 1 min. The fluorescence signal was
obtained during the elongation at 68 ◦C of every cycle. Each pair
of primers designed using Primer Express 3.0 software (Applied
Biosystems, USA) was checked based on the BLAST program in
tomato genomic sequence available in SGN and NCBI databases to
ensure that the primers amplify a unique and desired cDNA segment.
The primer sequences are listed in Table 1. The specificity of
the reactions was verified by melting curve analysis. The relative
mRNA levels for each of the Rubisco genes in RNA isolated from various
samples were quantified with respect to the internal standard,
actins. RT-qPCR was conducted with three replications.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7. รวม RT qPCR วิเคราะห์และสกัดอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ผลรวมพืชบริสุทธิ์ RNAprepอาร์เอ็นเอชุดการแยก (Tiangen ปักกิ่ง จีน) ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ มีการปนเปื้อน DNA ได้ตัดเพิ่มฟรี RNase DNase ฉัน ความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอพบ โดย 0.8% agarose เจ electrophoresisตัวอย่างของอาร์เอ็นเอมี reversely ทับศัพท์เป็น cDNAs ในโดยย่อ อาร์เอ็นเอ 5 L ผสมกับ oligo 1 L และ 5 L dNTP (2.5 mM)d (T) 15 ถูก incubated ใน 5 นาทีที่ 65 ◦C ส่วนผสมได้ถูกระบายความร้อนด้วยทันที วางฟิลด์ L M-MLV 5 5บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 1 Lสารยับยั้ง ribonuclease โคลน กลับ 1 L M MLV transcriptaseและฟรี RNase ddH2O กับปริมาตรสุดท้ายของ 25 L ผสมเบา ๆแล้ว incubated ที่ ◦C 37 สำหรับ 1 h ปฏิกิริยาเสร็จสิ้นที่◦C 70 สำหรับ 15 นาที ผลิตภัณฑ์ cDNA ถูกเก็บไว้ที่−20 ◦Cวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ที่ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ โดยเจน [27]สังเขป ตัวอย่าง cDNA ถูกใช้เป็นแม่แบบ และผสมมี 200 nM ของแต่ละสีรองพื้นและ SYBR Green PCR จริงหลักผสม(Tiangen ปักกิ่ง จีน) สำหรับวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ที่ใช้ ABI 7500ระบบ Real Time PCR และซอฟต์แวร์ 7500 v2.0.3 (Biosystems ใช้สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCRเงื่อนไขมีดังนี้: 95 ◦C สำหรับ 3 นาที รอบ 40 ของ 95 ◦C สำหรับ30 s, ◦C 57 สำหรับ 30 s และ ◦C 68 ใน 1 นาที สัญญาณ fluorescenceได้รับระหว่าง elongation ที่ 68 ◦C ทุกวงจร แต่ละคู่ของไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยใช้สีรองพื้น Express 3.0 ซอฟต์แวร์ (ประยุกต์Biosystems สหรัฐอเมริกา) ตรวจตามโปรแกรมระเบิดในในฐานข้อมูล SGN และ NCBI เพื่อลำดับ genomic มะเขือเทศให้แน่ใจว่า ไพรเมอร์ที่ขยายเซกเมนต์ cDNA ที่ไม่ซ้ำกัน และต้องลำดับรองพื้นจะแสดงในตารางที่ 1 Specificity ของปฏิกิริยาที่ถูกตรวจสอบ โดยการหลอมวิเคราะห์เส้นโค้ง ญาติระดับ mRNA ของยีน Rubisco ในอาร์เอ็นเอที่แยกต่างหากจากที่ต่าง ๆตัวอย่างที่ quantified กับมาตรฐานภายในactins RT qPCR ถูกดำเนินกับระยะที่สาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 การสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมดและการวิเคราะห์ RT-qPCR
ทั้งหมด RNA ถูกสกัดโดยใช้ RNAprep พืชบริสุทธิ์รวม
สกัดอาร์เอ็นเอชุด (Tiangen, ปักกิ่ง, จีน) ตามที่ผู้ผลิตของ
คำแนะนำ การปนเปื้อนดีเอ็นเอที่เป็นไปได้ถูก
ตัดออกโดยการเพิ่ม RNase ฟรี DNase I. ความสมบูรณ์ของ RNA
ถูกตรวจพบโดยเจล agarose 0.8% electrophoresis
ตัวอย่าง RNA ถูกคัดลอกลงสลับ cDNAs ใน
ช่วงสั้น ๆ 5? L RNA ผสมกับ 5? L dNTP (2.5 มิลลิเมตร) 1? L Oligo
ง (T) 15 ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 65 ◦C ผสมทำให้ถูก
ทำให้เย็นทันทีที่วางไว้ใน 5? MLV-M 5 × L
บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 1? L
โคลน ribonuclease ยับยั้ง 1? L M-MLV transcriptase กลับ
ddH2O และ RNase ฟรีเพื่อปริมาณสุดท้ายของ 25? L, ผสมเบา ๆ
แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์ที่
70 ◦C 15 นาที ผลิตภัณฑ์ cDNA ถูกเก็บไว้ที่
-20 ◦C
แบบ Real-time PCR วิเคราะห์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยเชน [27]
ในช่วงสั้น ๆ ตัวอย่าง cDNA ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบและผสม
กับ 200 นิวตันเมตรแต่ละสีรองพื้นและสีเขียว SYBR PCR จริง ปริญญาโทผสม
(Tiangen, ปักกิ่ง, จีน) สำหรับเรียลไทม์วิเคราะห์ PCR โดยใช้ ABI 7500
ระบบ Real Time PCR และซอฟท์แว 7500 v2.0.3 (Applied Biosystems,
USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR
เงื่อนไขดังต่อไปนี้: 95 ◦Cเป็นเวลา 3 นาที; 40 รอบ 95 ◦Cสำหรับ
30 วินาที, 57 ◦Cเป็นเวลา 30 วินาที, และ 68 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที สัญญาณการเรืองแสงได้
ในระหว่างที่ได้รับการยืดตัวที่ 68 ◦Cของทุกวงจร แต่ละคู่
ของไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ศึกษาด่วน 3.0 ซอฟแวร์ (Applied
Biosystems, USA) ได้รับการตรวจสอบขึ้นอยู่กับโปรแกรมการระเบิดใน
มะเขือเทศลำดับจีโนมที่มีอยู่ใน SGN และ NCBI ฐานข้อมูลเพื่อ
ให้แน่ใจว่าไพรเมอร์ขยายกลุ่มยีนที่เป็นเอกลักษณ์และต้องการ
ศึกษาเป็นลำดับ ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 ความจำเพาะของ
ปฏิกิริยาได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์เส้นโค้งการละลาย เทียบ
ระดับ mRNA สำหรับแต่ละยีน Rubisco ในอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากหลาย ๆ
ตัวอย่างวัดที่เกี่ยวกับมาตรฐานภายใน
actins RT-qPCR ได้ดำเนินการกับสามซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . การสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมดทุกคน
qpcr รวมการวิเคราะห์ RNA ถูกสกัดโดยใช้พืชบริสุทธิ์ rnaprep รวม
rna การสกัด Kit ( tiangen , ปักกิ่ง , จีน ) ตามคำแนะนำของ
ผู้ผลิต การปนเปื้อน DNA เป็นไปได้คือ
คัดออกโดยเพิ่มเลสฟรีตรวจหา ADNase . ความสมบูรณ์ของยีนที่ตรวจพบโดย 0.8% (

เจลจำนวน reversely ถ่ายทอดยีนใน cdnas . ในช่วงสั้น ๆ 
5 L . ผสมกับ 5  ผม dntp ( 2.5 มม. ) และ 1  ฉันโอลิโก
d ( t ) 15 ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 65 องศาเซลเซียส ส่งผลให้◦ส่วนผสม
เย็นทันทีวางไว้ใน 5  ผม m-mlv 5 ×
L
 ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ 1 ตัวไรโบนิวคลีเซึ่ง 1  ผม m-mlv reverse transcriptase และฟรี ddh2o , เลส
เป็นเล่มสุดท้ายของ 25  L
ผสมเบา ๆและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง◦ปฏิกิริยาสมบูรณ์ที่
70 ◦ C เป็นเวลา 15 นาที ผลิตภัณฑ์ วิธีเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C .

−◦เวลาจริงและการวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้โดยเชน [ 27 ] .
ในช่วงสั้น ๆ , วิธีกลุ่มตัวอย่างที่ใช้เป็นแม่แบบ และผสม
ด้วย 200 nm ของแต่ละสี ) และสีเขียว SYBR จริง Master Mix
( tiangen , ปักกิ่ง , จีน ) สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้ ABI 7500
ระบบเรียลไทม์ พีซี ร์และซอฟต์แวร์ 7500 v2.0.3 ( Applied Biosystems
, USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เงื่อนไข PCR
ดังนี้ 95 ◦ C เป็นเวลา 3 นาที ; 40 รอบ 95 ◦ C
30 , 57 ◦เป็นเวลา 30 วินาที และ 1 นาที 68 ◦ C เรืองแสงได้ในระหว่างการส่งสัญญาณ
68 ◦ C ของทุกๆรอบ แต่ละคู่ไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยใช้ไพรเมอร์ด่วน
3ซอฟต์แวร์ประยุกต์ (
0 ซึ่ง สหรัฐอเมริกา ) คือการตรวจสอบตามโปรแกรมในลำดับจีโนมมะเขือเทศระเบิด
ใช้ SGN และฐานข้อมูล ncbi

มั่นใจว่าไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำกันและขยายส่วนยีนที่ต้องการ
รองพื้นลำดับอยู่ในตารางที่ 1 ความจำเพาะของ
ปฏิกิริยาถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้ง ญาติ
ระดับ mRNA ของยีนในแต่ละ rubisco RNA ที่แยกได้จากต่างๆ
จำนวนวัด ไหว้พระภายในมาตรฐาน
actins . RT qpcr จำนวน 3 ซ้ำ