Quantitative Polymerase Chain React

Quantitative Polymerase Chain Reaction
Intron-exon spanning SP-A primers were used in the quantitative
PCR amplification reactions with the following design:
5′-AAGCCACACTCCACGACTTTAGA-3′ and 5′-GCCCATTGCTGGAGAAGACCT-
3′ (Integrated DNA Technology Inc., Coralville,
Iowa, United States). Commercially available _-actin primers
for the amplification of the housekeeping gene were used:
5-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3 and 5′-CTTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-
3 (Promega, Madison, Wisconsin,
United States). In a quantitative PCR detection system (My
iQ Thermal Cycler; Bio-Rad), 96-well reaction plateswere used
to perform real-time, quantitative PCR with the sample wells
containing the following: 25 μL 2_ Supermix with SYBR green (a
fluorescent double-stranded DNA-binding reportermolecule), 1
μL each of SP-A primer (100 ng/μL) or _-actin primers (100 pmol/
μL) for controlwells, a 1-μL sample complementary DNA, and 22
μL of nuclease-free water. After an initial activation step at 95°C
for 3minutes, amplificationwas performed across 45 cycles with
the following parameters: denaturation for 30 seconds at 95°C,
annealing for 20 seconds at 58°C, and elongation for 30 seconds
at 72°C. Digital capture of SYBR green fluorescence was performed
during the annealing phase for threshold cycle assessment.
The threshold cycle valueswere automatically stored in an
output file, and these were analyzed to determine relative
starting messenger RNA (mRNA) concentrations according to
the 2-__threshold cycle method16 using a proprietary macro
(Bio-Rad)with Excel 2003 XT (Microsoft Corp., Redmond,Washington,
United States). A melt-curve analysis confirmed specimen
uniformity and estimated product size in each samplewell
in the 96-well plate. The following protocol was programmed
into the My iQ Thermal Cycler (Bio-Rad) to produce the melt
curves for each samplewell after amplification using SYBR green
as the reporter: 1 minute at 95°C, 1 minute at 55°C, and
10 seconds at 55°C for 80 cycles. Finally, to verify PCR product
sequence, random samples were prepared and sequenced by
the Vanderbilt University (Nashville, Tennessee, United States)
DNA sequencing core laboratory. Data were compared with the
human genome via BLAST downloadable software (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเชิงปริมาณIntron exon ด้วยไพรเมอร์ SP-A ถูกใช้ในการเชิงปริมาณเกิดปฏิกิริยา PCR ขยาย ด้วยการออกแบบต่อไปนี้:5′-AAGCCACACTCCACGACTTTAGA-3′ และ 5′-GCCCATTGCTGGAGAAGACCT -3′ (รวมดีเอ็นเอเทคโนโลยี Inc., Coralvilleไอโอวา สหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์จำหน่าย_แอกตินสำหรับการขยายยีนแม่บ้านถูกใช้:5-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3 และ 5′-CTTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG -3 (Promega เมดิสัน วิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) ในเชิงปริมาณ PCR ตรวจหาระบบ (ของฉันไอคิว Cycler ความร้อน Bio-Rad), ปฏิกิริยาดี 96 plateswere ใช้การทำ PCR แบบเรียลไทม์ เชิงปริมาณกับหลุมตัวอย่างที่ประกอบด้วยต่อไปนี้: 25 μL 2_ Supermix กับ SYBR สีเขียว (aฟลูออเรสเซนต์คู่ควั่นผูกดีเอ็นเอ reportermolecule), 1ΜL ละรองพื้น SP-A (100 ฉบับ μL) หรือไพรเมอร์_แอกติน (100 pmol /ΜL) สำหรับ controlwells, 1-μL ของตัวอย่างเสริมดีเอ็นเอ และ 22ΜL น้ำฟรี nuclease หลังจากขั้นตอนการเปิดใช้งานเริ่มที่ 95° Cประมาณ 3 นาที amplificationwas ได้ในรอบ 45 ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: denaturation 30 วินาทีที่อุณหภูมิ 95° Cหลอมที่ 58° C และความยืด 30 วินาที 20 วินาทีที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส ดำเนินการถ่ายภาพดิจิตอลเรืองแสงสีเขียว SYBRระหว่างขั้นตอนการหลอมสำหรับขีดจำกัดรอบการประเมินValueswere รอบขีดจำกัดการจัดเก็บโดยอัตโนมัติในการแฟ้มผลลัพธ์ และเหล่านี้ถูกวิเคราะห์เพื่อกำหนดความสัมพันธ์เริ่มต้นความเข้มข้นของ messenger RNA (mRNA) ตามmethod16 2 __threshold รอบโดยใช้แมโครเป็นกรรมสิทธิ์(ไบโอ-Rad) กับ Excel 2003 XT (Microsoft Corp., Redmond วอชิงตันสหรัฐอเมริกา) ตัวอย่างการวิเคราะห์โค้งละลายยืนยันสม่ำเสมอและขนาดของสินค้าโดยประมาณในแต่ละ samplewellในแผ่น 96-ดี ตั้งโปรแกรมโพรโทคอต่อไปนี้เข้าไอคิวของฉันร้อน Cycler (Bio Rad) ให้ละลายเส้นโค้งสำหรับแต่ละ samplewell หลังจากขยายใช้ SYBR สีเขียวเป็นผู้รายงาน: 1 นาทีที่ 95° C, 1 นาทีที่ 55° C และ10 วินาทีที่ 55° C 80 รอบ ในที่สุด การตรวจสอบผลิตภัณฑ์ PCRลำดับ สุ่มตัวอย่างเตรียม และเรียงลำดับตามมหาวิทยาลัยเวนเดอร์บิลธ์ (นาชวิลล์ เทนเนสซี สหรัฐอเมริกา)ห้องปฏิบัติการหลักของลำดับดีเอ็นเอ ข้อมูลเปรียบเทียบกับการมมนุษย์ระเบิดดาวน์โหลดซอฟต์แวร์ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปริมาณ Polymerase Chain Reaction
Intron-เอกซ์ซอนซึ่งประกอบไปด้วยไพรเมอร์ SP-ถูกนำมาใช้ในเชิงปริมาณ
PCR ปฏิกิริยาขยายด้วยการออกแบบที่ต่อไปนี้:
5'-AAGCCACACTCCACGACTTTAGA-3 'และ 5'-GCCCATTGCTGGAGAAGACCT-
3' (แบบบูรณาการดีเอ็นเอเทคโนโลยี, อิงค์ บริษัท คอรัลวิลล์,
ไอโอวา , สหรัฐ). ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ไพรเมอร์ _-โปรตีน
สำหรับการขยายของยีนการดูแลห้องพักที่ถูกนำมาใช้:
5 TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT 3 และ 5'-CTTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-
3 (Promega, Madison, Wisconsin,
สหรัฐอเมริกา) ในเชิงปริมาณระบบ PCR ตรวจจับ (ของฉัน
iQ Thermal Cycler; Bio-Rad) 96 หลุมปฏิกิริยา plateswere ใช้
ในการดำเนินการแบบ real-time เชิงปริมาณ PCR กับหลุมตัวอย่าง
ที่มีต่อไปนี้: 25 ไมโครลิตร 2_ SUPERMIX กับสีเขียว SYBR (ก
เรืองแสงคู่ -stranded ดีเอ็นเอผูกพัน reportermolecule) 1
ไมโครลิตรแต่ละ SP-ไพรเมอร์ (100 ng / ไมโครลิตร) หรือไพรเมอร์ _-โปรตีน (100 pmol /
ไมโครลิตร) สำหรับ controlwells, 1 ไมโครลิตรตัวอย่างดีเอ็นเอที่สมบูรณ์และ 22
ไมโครลิตรของ nuclease- น้ำฟรี หลังจากขั้นตอนการเปิดใช้งานเริ่มต้นที่ 95 ° C
สำหรับ 3minutes, amplificationwas ดำเนินการทั่วทั้ง 45 รอบกับ
พารามิเตอร์ต่อไปนี้: denaturation เวลา 30 วินาทีที่ 95 ° C,
การอบ 20 วินาทีที่ 58 องศาเซลเซียสและการยืดตัวเป็นเวลา 30 วินาที
ที่ 72 ° C จับภาพดิจิตอลของ SYBR เรืองแสงสีเขียวที่ได้ดำเนินการ
ในระหว่างขั้นตอนการอบสำหรับการประเมินวัฏจักรเกณฑ์.
วงจรเกณฑ์ valueswere เก็บไว้โดยอัตโนมัติใน
ไฟล์ที่ส่งออกและเหล่านี้ถูกนำมาวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบญาติ
RNA เริ่มต้น messenger (mRNA) ความเข้มข้นตาม
วงจร method16 2 -__ เกณฑ์ ใช้แมโครที่เป็นกรรมสิทธิ์
(Bio-Rad) กับ Excel 2003 XT (ไมโครซอฟท์คอร์ปเรดมอนด์วอชิงตัน
สหรัฐอเมริกา) การวิเคราะห์ละลายเส้นโค้งได้รับการยืนยันตัวอย่าง
สม่ำเสมอและขนาดสินค้าโดยประมาณในแต่ละ samplewell
ในแผ่น 96 หลุม โปรโตคอลต่อไปนี้เป็นโปรแกรม
ลงใน My iQ Thermal Cycler (Bio-Rad) ในการผลิตละลาย
เส้นโค้งสำหรับแต่ละ samplewell หลังจากการขยายการใช้สีเขียว SYBR
เป็นนักข่าว: 1 นาทีที่ 95 ° C, 1 นาทีที่ 55 ° C และ
10 วินาที ที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 80 รอบ สุดท้ายในการตรวจสอบสินค้า PCR
ลำดับตัวอย่างที่สุ่มได้รับการเตรียมความพร้อมและลำดับขั้นตอนโดย
มหาวิทยาลัย Vanderbilt (แนชวิลล์เทนเนสซีสหรัฐอเมริกา)
ห้องปฏิบัติการลำดับดีเอ็นเอหลัก ข้อมูลที่ได้มาเมื่อเทียบกับ
จีโนมมนุษย์ผ่านทางซอฟต์แวร์ดาวน์โหลด BLAST (http: //
www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen