Plasmid constructionGenomic DNA was

Plasmid construction
Genomic DNA was purified from S. coelicolor cells grown in
yeast extract-malt extract (YEME) containing 34% sucrose, 1% glucose
and 0.5% MgCl2 at 30 C as described by Hopwood et al. [10].
The concentration of genomic DNA was measured in a UV spectrophotometer
(at 260 nm). The size of genomic DNA was analyzed on
1% agarose gels. The forward primer (ADA-1: 50-TTTAAGCTTCATATG
ACGAGCCGAAGCACCGAG-30 , where the underline indicates
the added HindIII and NdeI linkers) and the reverse primer (ADA-
2: 50-TTTAGATCTTCAGCCGTCG GATTCCGAAGA-30 , where the
underline indicates the added BglII linker) were designed according
to the putative adenosine deaminase gene sequence from S. coelicolor
(Genebank Accession No. SCO4901). The complete coding region
of the gene was amplified by PCR with ADA-1 and ADA-2
primers, using chromosomal DNA prepared from S. coelicolor as
the template and Taq DNA polymerase. PCR was performed as follows:
initial denaturing at 93 C for 5 min; 30 cycles of denaturation
at 93 C for 1 min, annealing at 68 C for 1 min, and
additional extension at 72 C for 1.5 min, and additional extension
at 72 C for 10 min. The PCR product was gel purified with a PCR
purification kit (Qiagen) and ligated into the pGEM-T vector (Promega).
After transformation into competent E. coli JM109, recombinant
plasmid, pGEM-ada, was purified from positive clones by the
alkali method and sequenced to confirm that no mutations were
introduced by the PCR amplification step. After a double digestion
of pGEM-ada with NdeI and BglII, the 1.2 kb fragment was gel purified
and ligated into pET-15b, which had been previously double
digested with NdeI and BamHI. The ligation mixture was transformed
into E. coli BL21 (DE3) and selected on LB containing
60 lg/ml ampicillin.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Plasmid ก่อสร้าง
Genomic DNA ที่บริสุทธิ์จาก S. coelicolor เซลล์โตใน
ยีสต์สารสกัดจากข้าวมอลต์สกัด (YEME) ประกอบด้วย 34% ซูโครส กลูโคส 1%
0.5% MgCl2 ที่ 30 C ตามที่อธิบายไว้โดย Hopwood et al. [10] และ
เป็นวัดความเข้มข้นของ genomic DNA ในเครื่องทดสอบกรดด่าง UV
(at 260 nm) เป็นวิเคราะห์ขนาดของ genomic DNA บน
1% agarose เจ รองพื้นไปข้างหน้า (ADA-1:50-TTTAAGCTTCATATG
ACGAGCCGAAGCACCGAG-30 ที่ขีดเส้นใต้ระบุ
เพิ่ม HindIII และ NdeI linkers) และพื้นกลับ (ADA-
2:50-TTTAGATCTTCAGCCGTCG GATTCCGAAGA-30 ที่
ขีดบ่งชี้ตัวเชื่อมโยงข้อมูล BglII เพิ่ม) ถูกออกแบบตาม
ลำดับยีน deaminase อะดี putative จาก S. coelicolor
(Genebank Accession No. SCO4901) ภูมิภาคสภาพสมบูรณ์
ของยีนถูกขยาย โดย PCR กับ ADA-1 และ ADA-2
ไพรเมอร์ ใช้ DNA ของโครโมโซมที่เตรียมจาก S. coelicolor เป็น
แม่และ Taq DNA พอลิเมอเรส ทำ PCR ดัง:
denaturing เริ่มต้นที่ 93 C สำหรับ 5 นาที รอบ 30 ของ denaturation
ที่ 93 C ใน 1 นาที การอบเหนียวที่ 68 C ใน 1 นาที และ
ส่วนขยายเพิ่มเติมที่ 72 C สำหรับ 1.5 นาที และส่วนขยายเพิ่มเติม
ที่ 72 C สำหรับ 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกเจบริสุทธิ์กับ PCR
ฟอก kit (Qiagen) และควบเป็นเวกเตอร์ pGEM T (Promega) .
หลังจากการเปลี่ยนแปลงในอำนาจ E. coli JM109 วททช
plasmid เอ pGEM ที่บริสุทธิ์จากโคลนบวกโดย
วิธีอัลคาไล และตามลำดับเพื่อยืนยันว่า การกลายพันธุ์ไม่ถูก
แนะนำตอนขยาย PCR หลังจากย่อยอาหารคู่
ของ pGEM-เอ NdeI และ BglII ส่วน 1.2 kb ถูกเจบริสุทธิ์
และควบเป็นสัตว์เลี้ยง-15b ซึ่งก่อนหน้านี้คู่
เจ่ากับ NdeI และ BamHI ส่วนผสมไข่ถูกแปลง
ใน E. coli BL21 (DE3) ที่เลือกในปอนด์ประกอบด้วย
แอมพิซิลลิน lg/ml 60

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสร้างพลาสมิดดีเอ็นเอบริสุทธิ์จาก S .

coelicolor เซลล์ปลูก malt extract สารสกัดจากยีสต์ ( yeme ) ประกอบด้วย 34% โดย
กลูโคส 1% และ 0.5% ไอโซโทปที่ 30  C ตามที่อธิบายไว้โดยฮ็อปวูด et al . [ 10 ] .
ความเข้มข้นของ genomic DNA ที่ถูกวัดใน UV Spectrophotometer
( 260 nm ) ขนาดของดีเอ็นเอวิเคราะห์บน
1 % เจลโรส . รองพื้นไปข้างหน้า ( ada-1 50-tttaagcttcatatg
:acgagccgaagcaccgag-30 ที่ขีดเส้นใต้หมายถึง
- ndei เพิ่มและ linkers ) และย้อนกลับ ไพรเมอร์ ( เอ -
2 : 50-tttagatcttcagccgtcg gattccgaaga-30 ที่ขีดเส้นใต้หมายถึง bglii โปรแกรมเชื่อมโยงเพิ่ม

) ได้รับการออกแบบตามกับการแสดงออกยีน ลำดับดีอะมิเนสจาก S . coelicolor
( genebank เข้าไม่ sco4901 ) รหัสภูมิภาค
สมบูรณ์ของยีนที่ถูกขยายโดยวิธี PCR กับ ada-1 และ primers ada-2
โดยใช้โครโมโซมดีเอ็นเอจาก S .
coelicolor เป็นแม่แบบ และดีเอ็นเอพอลิเมอเรสได้ดี . โดยแบ่งเป็นดังนี้ :
เริ่มต้นี่ที่ 93  C เป็นเวลา 5 นาที ; 30 รอบ (
 ที่ 93 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที อบอ่อนที่อุณหภูมิ 68  องศาเซลเซียสนาน 1 นาที และส่วนขยายที่ 72 
เพิ่มเติมเป็นเวลา 1.5 นาทีและขยายเพิ่มเติมที่ 72 
C นาน 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR เป็นเจลบริสุทธิ์ ด้วยวิธี PCR
ฟอก Kit ( เพิ่ม ) และผูกเป็น pgem-t เวกเตอร์ ( promega ) .
หลังจากการเปลี่ยนแปลงในความสามารถ E . coli ที่มีรีคอมบิแนนท์พลาสมิด pgem
, เอ บริสุทธิ์จากโคลน บวกด้วยวิธีนี้
ด่างและยืนยันว่าไม่มีการกลายพันธุ์เป็น
แนะนำโดยดีเอ็นเอ การเพิ่มขั้นตอน หลังจาก
การย่อยคู่ของ pgem ADA และกับ ndei bglii , 1.2 กิโลเบสเป็นเจลบริสุทธิ์
และผูกเป็น pet-15b ซึ่งได้รับก่อนหน้านี้คู่
ndei ย่อยด้วย BamHI และ . การผสมส่วนผสมที่เปลี่ยน
Ligation ใน E . coli BL21 ( DE3 ) และเลือกใน LB ที่มี
60 LG / ml ยาเพนนิซิลลิน