We have developed a dry-reagent dip

We have developed a dry-reagent dipstick test for simultaneous visual detection of two alleles in single nucleotide polymorphisms (SNPs). The strip comprises two test zones and a control zone. Oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles are used as reporters. PCR-amplified DNA that spans the interrogated sequence is subjected to primer extension (PEXT) reactions using allele-specific primers. Digoxigenin-dUTP and biotin-dUTP are incorporated in the extended fragments. The primers contain an oligo(dA) segment at the 5′ end. The PEXT products are applied to the sample area of the strip, which is then immersed in the appropriate buffer. As the buffer migrates along the strip by capillary action, the extension products of the two alleles are captured at the test zones from immobilized anti-digoxigenin and streptavidin, whereas the oligo(dA) segment of the primers hybridizes with oligo(dT) strands attached to gold nanoparticles, thus generating characteristic red lines. The excess nanoparticles are captured from immobilized oligo(dA) strands at the control zone of the strip. The test was applied to the genotyping of two SNPs of the Toll-like receptor 4 gene (Asp299Gly and Thr399Ile), one SNP of CYP2C19 gene (CYP2C19*3) and one SNP of the TPMT gene (TPMT*2). Contrary to most genotyping methods, the dipstick test does not require costly specialized equipment for detection of PEXT products. The PCR product is pipetted directly into the PEXT reaction mixture without prior purification. The high sensitivity of the strip allows completion of PEXT reaction in three cycles only (7 min). The visual detection of both alleles is complete in 15 min.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราได้พัฒนา dipstick แห้งรีเอเจนต์ทดสอบพร้อมตรวจภาพ 2 alleles ในนิวคลีโอไทด์เดี่ยว polymorphisms (SNPs) เดอะสตริปประกอบด้วยสองทดสอบโซนและโซนการควบคุม Oligonucleotide functionalized ทองคำขนาดนาโนเมตรซึ่งจะใช้เป็นผู้สื่อข่าว ขยาย PCR ดีเอ็นเอที่เกิดลำดับ interrogated เป็นต้องรองพื้นส่วนขยาย (PEXT) ปฏิกิริยาใช้ไพรเมอร์เฉพาะ allele Digoxigenin-dUTP และ dUTP ไบโอตินรวมในการแยกส่วนขยาย ไพรเมอร์ที่ประกอบด้วยส่วน oligo(dA) ที่สุด 5′ มีใช้ผลิตภัณฑ์ PEXT พื้นที่ตัวอย่างคืน ที่เป็นไปแล้วในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม เป็นบัฟเฟอร์ย้ายตามแถบ โดยแรงยก ผลิตภัณฑ์ขยายของ alleles สองถูกจับที่เขตทดสอบจากเอนไซม์ต่อต้าน-digoxigenin และ streptavidin ในขณะที่ส่วน oligo(dA) ของไพรเมอร์ที่ hybridizes กับ oligo(dT) strands กับเก็บกักทอง สร้างบรรทัดสีแดงลักษณะดัง เก็บกักส่วนเกินถูกจับจาก strands เอนไซม์ oligo(dA) ในเขตควบคุมของแถบ การทดสอบที่ถูกประยุกต์ใช้ genotyping ของ SNPs ที่สองของการโทรเช่นตัวรับ 4 ยีน (Asp299Gly และ Thr399Ile), หนึ่ง SNP CYP2C19 ยีน (CYP2C19 * 3) และ SNP หนึ่งของยีน TPMT (TPMT * 2) ขัดกับส่วนใหญ่วิธี genotyping ทดสอบ dipstick ไม่ต้องอุปกรณ์ค่าใช้จ่ายพิเศษตรวจ PEXT ผลิตภัณฑ์ ผลิตภัณฑ์ PCR เป็น pipetted ลงผสมปฏิกิริยา PEXT ไม่ฟอกก่อน ความไวสูงของแถบช่วยให้ความสมบูรณ์ของปฏิกิริยา PEXT ในเฉพาะรอบสามเท่านั้น (7 นาที) ตรวจสอบภาพของ alleles ทั้งเสร็จใน 15 นาที

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราได้มีการพัฒนาทดสอบแห้งสาร dipstick สำหรับการตรวจสอบภาพพร้อมกันของสองอัลลีลในหลากหลายเดี่ยวเบื่อหน่าย (SNPs) แถบประกอบด้วยสองโซนโซนการทดสอบและการควบคุม oligonucleotide-ฟังก์ชันอนุภาคนาโนทองคำที่ใช้เป็นผู้สื่อข่าว DNA PCR-ขยายที่ครอบคลุมลำดับสอบปากคำอยู่ภายใต้ไพรเมอร์ส่วนขยาย (PEXT) ปฏิกิริยาโดยใช้ไพรเมอร์อัลลีลที่เฉพาะเจาะจง digoxigenin-dUTP และไบโอติน-dUTP จะรวมอยู่ในชิ้นส่วนขยาย ไพรเมอร์ประกอบด้วย Oligo (dA) ส่วนที่ปลาย 5 ' ผลิตภัณฑ์ PEXT จะนำไปใช้ในพื้นที่ตัวอย่างของแถบซึ่งเป็นที่แช่แล้วในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ในฐานะที่เป็นบัฟเฟอร์ย้ายพร้อมแถบโดยการกระทำของเส้นเลือดฝอยที่ผลิตภัณฑ์ส่วนขยายของทั้งสองอัลลีลถูกจับที่โซนทดสอบจากตรึงต่อต้าน digoxigenin และ streptavidin ขณะที่ Oligo (dA) ส่วนของไพรเมอร์ hybridizes กับ Oligo (dT) เส้นที่แนบมา เพื่ออนุภาคนาโนทองคำจึงสร้างเส้นสีแดงลักษณะ อนุภาคนาโนที่เกินจะถูกจับจากการตรึง Oligo (dA) เส้นที่เขตการควบคุมของแถบ การทดสอบถูกนำไปใช้ genotyping ของทั้งสอง SNPs ของรับโทรเช่น 4 ยีน (Asp299Gly และ Thr399Ile) หนึ่ง SNP ของยีน CYP2C19 (CYP2C19 * 3) และ SNP ของยีน TPMT นี้ (TPMT * 2) ตรงกันข้ามกับวิธีการมากที่สุด genotyping ทดสอบ dipstick ที่ไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษสำหรับการตรวจสอบค่าใช้จ่ายของผลิตภัณฑ์ PEXT ผลิตภัณฑ์ PCR ปิเปตโดยตรงในผสมปฏิกิริยา PEXT โดยไม่บริสุทธิ์ก่อน ความไวสูงของแถบช่วยให้ความสำเร็จของการเกิดปฏิกิริยา PEXT ในสามรอบเท่านั้น (7 นาที) การตรวจจับภาพของอัลลีลทั้งสองจะเสร็จสมบูรณ์ใน 15 นาที

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราได้พัฒนาบริการรีเอเจนต์ชนิดทดสอบการตรวจจับภาพพร้อมกันสองอัลลีลยีนพันธุ์เดียว ( snps ) แถบทดสอบ ประกอบด้วย 2 โซน และเขตควบคุม ที่มีอนุภาคทองระดับนาโนเมตร ซึ่งใช้เป็นนักข่าวเพิ่มแถบดีเอ็นเอ ที่ครอบคลุมอยู่ภายใต้การสอบสวนลำดับสี ( pext ) ปฏิกิริยาการใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบเฉพาะ . และได้ติด biotin ได้รวมในการขยายเศษ ไพรเมอร์มีโอลิโก ( ดา ) ส่วนที่ 5 ได้รับจบ ผลิตภัณฑ์ pext จะใช้พื้นที่ตัวอย่างของแถบซึ่งเป็นที่แช่อยู่ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมเป็นบัฟเฟอร์ย้ายตามแถบสำหรับการขยายผลิตภัณฑ์ของทั้งสองอัลลีลจะจับที่ทดสอบโซนจากตรึงติด streptavidin ต่อต้าน และ ส่วน โอลิโก ( ดา ) ส่วนของไพรเมอร์ hybridizes กับโอลิโก ( DT ) เส้นแนบกับอนุภาคทองระดับนาโนเมตร ดังนั้น การสร้างเส้นสีแดงลักษณะที่ถูกจับตรึงอนุภาคส่วนเกินจากโอลิโก ( ดา ) เส้นในการควบคุมโซนของแถบ ในการทดลองได้ใช้กับเขต 2 snps ของโทรเหมือนยีนตัวรับ 4 ( asp299gly และ thr399ile ) หนึ่ง SNP ของยีน cyp2c19 ( cyp2c19 * 3 ) และหนึ่ง SNP ของ tpmt ยีน ( tpmt * 2 ) ตรงกันข้ามเขตมากที่สุด วิธีการส่วนชนิดไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษราคาแพง ทดสอบตรวจสอบผลิตภัณฑ์ pext . ผลิตภัณฑ์ PCR pipetted โดยตรงลงใน pext ปฏิกิริยาผสม โดยมิต้องบริสุทธิ์ ความไวสูงของแถบที่ช่วยให้ความสมบูรณ์ของปฏิกิริยา pext ในรอบสามเท่านั้น ( 7  มิน ) การตรวจหายีนของทั้งภาพ เสร็จใน 15   min .