11486 The publication costs of this

11486 The publication costs of this article were defrayed in part by page charge payment. This article must therefore be hereby marked "advertisement" in accordance with 18 U.S.C. §1734 solely to indicate this fact.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 11487 (pH 5.0) and 2 volumes of ethanol. Precipitated nucleic acids were pelleted and poly(A)+ RNA was selected by oligo(dT) chromatography (20). Total RNA from nuclear fractions was extracted with guanidinium isothiocyanate/acid phenol (18). Total RNA from nuclear fractions or poly(A)+ RNA from postnuclear fractions was analyzed by Northern hybridization with probes for detection of BDV RNAs or cyclophilin mRNA. Probes. 32P-labeled probes for Northern hybridizations were prepared by random-hexanucleotide priming of plasmid cDNAs (21). 32P-labeled RNA probes were prepared from a plasmid cDNA template according to protocols from Promega. Plasmids used were pAF4, encoding the 24-kDa protein of BDV (8), and p1B15, encoding rat cyclophilin (22). Northern Hybridization.-For viral particle analysis, samples were RNA from particles released by 10i Oligo/TL cells or 10 pug of RNA from normal or BDV-infected rat brain and normal or BDV-infected Oligo/TL cells. For RNA nucleocytoplasmic transport analysis, samples were total RNA from nuclear fractions or poly(A)+ RNA from postnuclear fractions. RNAs were size-fractionated on 2.2 M formaldehyde/1.0% agarose gels and transferred to nylon membranes (MSI). Membranes were hybridized with 32P-labeled DNA probes or 32P-labeled RNA probes at 650C in 6x SSC (lx SSC is 0.15 M sodium chloride/0.015 M sodium citrate)/5 x Denhardt's solution (lx Denhardt's solution is 0.02% polyvinylpyrrolidone/0.02% Ficoll/0.02% bovine serum albumin)/10 mM EDTA/0.5% SDS/salmon sperm DNA at 100 Ag/ml/yeast tRNA at 100 ,ug/ml for 18 hr and then washed in 0.2x SSC/0.2% SDS at 650C for 30 min before autoradiography. Membranes hybridized with RNA probes were exposed to RNase A at 100 ,ug/ml/10 mM Tris HCl, pH 7.4/1 mM EDTA/0.3 M NaCl at 370C for 30 min to reduce background hybridization to rRNAs. RNA standards (GIBCO/BRL) were used to determine approximate size of RNAs. RESULTS Virus Particle Preparation. Reports that elevated salt concentrations caused enhanced translation of viral RNAs (23) led to treatment of BDV-infected cells with hypertonic media. This resulted in the unexpected finding that hypertonicity induced the release of BDV from infected cells (12). Various cell lines and salt conditions were studied. Highest yields of released virus were obtained by treating a BDV-infected human oligodendrocyte cell line (Oligo/TL) with 250 mM MgCl2 (data not shown). By this method, 5 x 108 infectious particles (focus-forming units) were released from 2 x 108 Oligo/TL cells (Table 1). Mild detergent (0.002% Zwittergent), applied to remove excess lipid from the clarified samples, resulted in a transient 1-2 logarithm reduction in virus titer. Independent of detergent treatment, a 1 logarithm decrease in titer occurred after the first high-speed centrifugation of released virus (data not shown). Treatment of released virus preparations with nucleases did not affect virus titer (Table 1). BDV Particles Contain a Negative-Polarity 8.5-kb RNA. Northern hybridization experiments revealed that the 8.5-kb BDV RNA was protected from nucleases during particle preparation (Fig. 1A). A double-stranded probe representing the ORF for the 24-kDa protein of BDV detected several BDV-specific RNAs (8.5, 3.5, 2.1, and 0.8 kb) in extracts from infected cells. In contrast, only the 8.5-kb RNA was detected in the virus particle extract. The polarity of the 8.5-kb RNA derived from virus particle preparations was investigated in hybridization experiments using singlestranded RNA probes either antisense or same sense to the mRNA encoding the 24-kDa protein of BDV (Fig. 1B). Whereas the antisense RNA probe detected the small BDV Table 1. Virus particle preparation Virus yield, ffu x 107 Step Treatment Total* max, mmn 1 Overlay washed cell layer 57.0 84.0, 12.0 (2 x 108 cells) with Tris-Mg2so buffer; incubate 1.5 hr, 3rC; collect supernatant and spin 5 min, 2500 x g, RT 2 Adjust supernatant to 0.002% 2.3 6.6, 0.24t Zwittergent; incubate 1 hr, RT 3 Spin 1 hr,100,000 X g, 206C; 2.7 4.0, 1.5 resuspend pellet in Tris-Mg,25 buffer 4 Add DNase, RNase (50 pg/ml 2.5 4.2, 1.3 each); incubate 1 hr, 37TC 5 Spin 1 hr, 100,W0 X g, 4C; 4.3 7.3, 1.5 resuspend pellet in Tris-Mgu5 buffer ffu, Focus-forming units; max, maximum; min, minimum; RT, room temperature. *Mean of eight preparations. tValues after Zwittergent treatment vary, but similar yields were obtained in all experiments after removal of detergent by centrifugation in step 3. RNAs (150 years ago, BDV, the agent that causes this disease, remains unclassified. As the virus eluded classical methods for purification, formal proofof an infectious basis for Borna disease and preliminary characterization ofthe agent was accomplished only recently through use of molecular approaches (6, 8, 9, 11, 24). Because strandspecific hybridization to BDV RNAs obtained from infected rat brain or infected tissue culture cells indicated that the 8.5-kb RNA was opposite in polarity to the smaller RNAs, we proposed that BDV was likely to be a negative-strand RNA virus (8, 9). This hypothesis has been controversial. Others reported equivalent amounts ofpositive- and negative-polarity RNAs in extracts from infected rat brain and argued against the negative-strand virus model (6, 11). To determine viral genome polarity it was essential first to refine a method for isolation ofviral particles. This has been achieved. Though we cannot exclude the formal possibility that there are additional, undetected positive-polarity genomic RNAs in the particles, Northern hybridization experiments described here support the negative-strand RNA virus model. The advent of a method for isolation of infectious BDV prompted us to attempt direct visualization of particles by electron microscopy. We have identified 42-nm, spherical, enveloped particles in virus release preparations (W.I.L. and C. Ribak, unpublished work). Although such particles are not present in preparations from uninfected cells and are consistent with the biology of the BDV system (a putative 8.5-kb genome; sensitivity to detergents), these particles have not yet been labeled using antibodies from infected animals. Thus, their significance remains uncertain. We have suggested that BDV may have a nuclear phase for transcription and replication (9, 10) because of two observations: (i) the 24-kDa and 38/40-kDa proteins of BDV are present in the nucleus of infected cells (refs. 24 and 25; C. G. Hatalski and W.I.L., unpublished work) and (ii) Northern and in situ hybridization experiments showed that, whereas the smaller BDV RNAs are present in the nucleus and the cytoplasm, the 8.5-kb RNA is confined to the nucleus (9, 10). The nucleocytoplasmic transport studies described demonstrate that BDV transcription occurs in the cell nucleus. Influenza virus is the only animal RNA virus known to replicate and transcribe in the cell nucleus (26, 27). Though it is a negative-strand RNA virus, it is segmented. There is presently no evidence that BDV is segmented. Further, BDV sequence analysis has shown similarities only to nonsegmented, negative-strand RNA viruses (28). Taken together these data indicate that BDV may represent a previously undefined class of animal RNA virus. We thank Kathryn Carbone for the generous gift of a BDV-infected C6 cell line and Liv Bode, Marylou V. Solbrig, John Holland, and Donald Summers for helpful discussions. Support for this work was provided by National Institutes of Health Grants NS-29425 (T.B., A.L., and W.I.L.) and NS-12428 (J.C.T.), University of California Taskforce on AIDS Grant R91I047 (T.B. and W.I.L.), Bundesministerium fur Forschung und Technologie Grant BMFT-07017660 (H.L.), and Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant LU142-1 (H.L.). W.I.L. is a recipient of a Young Investigator Award from National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression and a Pew Scholars Award from the Pew Charitable Trusts. 1. Ludwig, H., Bode, L. & Gosztonyi, G. (1988) Borna Disease: A Persistent Virus Infection of the Central Nervous System (Karger, Basel). 2. Amsterdam, J. D., Winokur, A., Dyson, W., Herzog, S., Gonzalez, F., Rott, R. & Koprowski, H. (1985) Arch. Gen. Psychiatry 42, 1093-1096. 3. Rott, R., Herzog, S., Fleischer, B., Winokur, A., Amsterdam, J., Dyson, W. & Koprowski, H. (1985) Science 228, 755-756. 4. Bechter, K., Herzog, S., Fleischer, B., Schuttler, R. & Rott, R. (1987) Nervenarzt 58, 617-624. 5. Bode, L., Riegel, S., Ludwig, H., Amsterdam, J. D., Lange, W. & Koprowski, H. (1988) Lancet H, 689. 6. VandeWoude, S., Richt, J. A., Zink, M. C., Rott, R., Narayan, O. & Clements, J. E. (1990) Science 250, 1276-1281. 7. Bode, L., Riegel, S., Lange, W. & Ludwig, H. (1992) J. Med. Virol. 36, 30-315. 8. Lipkin, W. I., Travis, G. H., Carbone, K. M. & Wilson, M. C. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4184 4188. 9. de la Torre, J. C., Carbone, K. M. & Lipkin, W. I. (1990) Virology 179, 853-856. 10. Carbone, K. M., Moench, T. R. & Lipkin, W. I. (1991) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 50, 205-214. 11. Richt, J. A., VandeWoude, S., Zink, M. C., Narayan, 0. & Clements, J. E. (1991) J. Gen. Virol. 72, 2251-2255. 12. Pauli, G. & Ludwig, H. (1985) Virus Res. 2, 29-33. 13. Zwick, W., Seifried, 0. & Witte, J. (1929) Arch. Wiss. Prakt. Tierheilkd. 59, 511-545. 14. Hirano, N., Kao, M. & Ludwig, H. (1983) J. Gen. Virol. 64, 1521-1530. -ATP 0 15 40 40 N CN C N C N C

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

11486 ต้นทุนงานพิมพ์ของบทความนี้มี defrayed บางส่วน โดยชำระเงินค่าธรรมเนียมหน้า บทความนี้ต้องดังนั้นจึงขอทำเครื่องหมาย "โฆษณา" ตาม §1734 U.S.C. 18 เพื่อบ่งชี้นี้ fact.Proc. Natl. Acad. Sci. สหรัฐอเมริกา 89 (1992) 11487 (pH 5.0) และเอทานอลจำนวน 2 กรดนิวคลีอิกตะกอนได้ pelleted และ poly(A) + อาร์เอ็นเอมีเลือก โดย oligo(dT) chromatography (20) อาร์เอ็นเอรวมจากนิวเคลียร์บางส่วนถูกสกัด ด้วย guanidinium isothiocyanate/กรด วาง (18) อาร์เอ็นเอรวมเศษนิวเคลียร์หรือ poly(A) + อาร์เอ็นเอจากเศษ postnuclear ถูกวิเคราะห์ โดยเหนือ hybridization กับคลิปปากตะเข้ตรวจ BDV RNAs หรือ cyclophilin mRNA คลิปปากตะเข้ ป้าย 32P คลิปปากตะเข้สำหรับ hybridizations ภาคเหนือได้จัดทำ โดยสุ่ม hexanucleotide ด้วยของ plasmid cDNAs (21) ป้าย 32P อาร์เอ็นเอคลิปปากตะเข้ถูกเตรียมจากแม่ cDNA plasmid ตามโปรโตคอลจาก Promega Plasmids ใช้ pAF4 โปรตีน 24 kDa BDV (8), และ p1B15, cyclophilin ราษฎร์ (22) การเข้ารหัสการเข้ารหัสได้ เหนือ Hybridization. -สำหรับการวิเคราะห์อนุภาคไวรัส ตัวอย่างได้อาร์เอ็นเอจากอนุภาคออก โดย 10i Oligo/TL หรือ 10 ยังมีอาร์เอ็นเอจากหนูปกติ หรือติด เชื้อ BDV สมอง และเซลล์ปกติ หรือติด เชื้อ BDV เซลล์ Oligo/TL อาร์เอ็นเอ nucleocytoplasmic ขนส่งวิเคราะห์ ตัวอย่างได้อาร์เอ็นเอรวมเศษนิวเคลียร์หรือ poly(A) + อาร์เอ็นเอจากเศษ postnuclear RNAs ได้แบ่งขนาดบน agarose 2.2 M formaldehyde/1.0% เจ และโอนย้ายไปที่เยื่อหุ้มไนลอน (MSI) เยื่อหุ้มได้ผสมพันธุ์กับ probes 32P ชื่อดีเอ็นเอ หรืออาร์เอ็นเอป้าย 32P probes ที่ 650C ใน 6 x SSC (lx SSC คือ 0.15 M โซเดียม คลอไรด์/0.015 M โซเดียมซิเตรต) / 5 x Denhardt โซลูชัน (lx Denhardt โซลูชันคือ 0.02% polyvinylpyrrolidone/0.02% Ficoll/0.02% วัว serum albumin) / 10 มม. EDTA/0.5% ดีเอ็นเอของสเปิร์ม SDS/ปลา แซลมอนที่ tRNA Ag/ml/ยีสต์ 100 100 ยู จี/ml 18 ชั่วโมงแล้ว ล้างใน 0.2 x SSC/0.2% SDS ที่ 650 C สำหรับ 30 นาทีก่อน autoradiography มีคลิปปากตะเข้อาร์เอ็นเอเป็นสารที่สัมผัสกับ RNase A ที่ 100 ยู จี/ml/10 มม.ทริสเรทติ้ง HCl ค่า pH 7.4/1 mM EDTA/0.3 M NaCl ที่ 370C ใน 30 นาทีลดพื้นหลัง hybridization เพื่อ rRNAs อาร์เอ็นเอมาตรฐาน (GIBCO BRL) ถูกใช้เพื่อกำหนดขนาดโดยประมาณของ RNAs การเตรียมอนุภาคไวรัสผลลัพธ์ รายงานที่ยกระดับความเข้มข้นเกลือที่เกิดจากการปรับปรุงแปล RNAs ไวรัส (23) นำไปสู่การรักษาเซลล์ที่ติดเชื้อ BDV กับสื่อ hypertonic ทำให้การค้นหาคาดว่า hypertonicity เกิดจากการปล่อย BDV จากเซลล์ติดเชื้อ (12) บรรทัดของเซลล์ต่าง ๆ และได้ศึกษาเงื่อนไขเกลือ อัตราผลตอบแทนสูงสุดของไวรัสออกได้รับ โดยการรักษาติดเชื้อ BDV oligodendrocyte มนุษย์เซลล์ส่วน (Oligo/TL) 250 มม. MgCl2 (ข้อมูลไม่แสดง) โดยวิธีนี้ 5 x 108 ติดเชื้ออนุภาค (หน่วยที่มาขึ้นรูป) ถูกปล่อยออกมาจากเซลล์ Oligo/TL 2 x 108 (ตาราง 1) ผงซักฟอกอ่อน ๆ (0.002% Zwittergent), ใช้เพื่อเอาไขมันส่วนเกินออกจากตัวอย่างมากระหว่าง ผลในแบบฉับพลันลดไวรัส titer ลอการิทึม 1-2 อิสระของการรักษาผงซักฟอก ลดลง 1 ลอการิทึม titer ที่เกิดขึ้นหลังจาก centrifugation ความเร็วสูงครั้งแรกของไวรัสออก (ข้อมูลไม่แสดง) รักษาไวรัสออกเตรียมกับ nucleases ไม่มีผลต่อไวรัส titer (ตาราง 1) อนุภาค BDV ประกอบด้วยอาร์เอ็นเอ 8.5 kb เป็นขั้วลบ ทดลอง hybridization ภาคเหนือเปิดเผยว่า อาร์เอ็นเอ BDV 8.5-kb ได้รับการป้องกันจาก nucleases ระหว่างเตรียมอนุภาค (Fig. 1A) การควั่นสองโพรบแทน ORF สำหรับโปรตีน 24 kDa ของ BDV RNAs BDV เฉพาะต่าง ๆ ที่ตรวจพบ (8.5, 3.5, 2.1 และ 0.8 kb) ในสารสกัดจากเซลล์ที่ติดเชื้อ ในทางตรงกันข้าม เฉพาะในอาร์เอ็นเอ 8.5 kb พบในสารสกัดจากอนุภาคของไวรัส ขั้วของอาร์เอ็นเอ 8.5 kb มาเตรียมอนุภาคไวรัสถูกสอบสวนใน hybridization ทดลอง ใช้อาร์เอ็นเอ singlestranded probes antisense หรือเดียวกันรู้สึกถึง mRNA ที่เข้ารหัสโปรตีน 24 kDa ของ BDV (Fig. 1B) ในขณะที่โพรบอาร์เอ็นเอ antisense พบเล็ก BDV ตาราง 1 การเตรียมอนุภาคไวรัสไวรัสผลตอบแทน ffu x 107 รวมรักษาขั้นตอน * สูงสุด mmn 1 วางทับชั้นหินเซลล์ 57.0 84.0, 12.0 (2 x 108 เซลล์) ด้วยบัฟเฟอร์ตรี Mg2so ฟัก 1.5 ชั่วโมง 3rC supernatant และหมุน 5 นาที 2500 x g, RT 2 ปรับ supernatant 0.002% 2.3 6.6, 0.24t Zwittergent ฟัก 1 ชั่วโมง RT 3 หมุน 1 ชั่วโมง 100, 000 X g, 206C 2.7 4.0, 1.5 resuspend เม็ดในทริสเรทติ้งมก. 25 กันชน 4 เพิ่ม DNase, RNase (50 pg/ml 2.5 4.2, 1.3 แต่ละ), ฟัก 1 ชั่วโมง 37TC 5 หมุน 1 ชั่วโมง 100, W0 X g, 4C 4.3 7.3, 1.5 resuspend เม็ดในตรี Mgu5 บัฟเฟอร์ ffu หน่วยขึ้นมา สูงสุด สูงสุด ต่ำสุด ต่ำสุด RT อุณหภูมิห้อง * ความหมายของแปดเตรียม tValues หลังจากรักษา Zwittergent แตกต่างกัน แต่อัตราผลตอบแทนคล้ายได้รับในการทดลองทั้งหมดหลังจากลบผงซักฟอก โดย centrifugation ในขั้นตอนที่ 3 RNAs (150 ปีที่ผ่านมา BDV ตัวแทนที่ทำให้เกิดโรคนี้ จะไม่ได้แยกประเภท เป็นวิธีคลาสสิกสำหรับฟอก proofof อย่างเป็นทางการเป็นโรคติดเชื้อโรค Borna eluded ไวรัส และคุณสมบัติเบื้องต้นของตัวแทนที่ได้ เฉพาะผ่านล่าสุดใช้ของแนวทางโมเลกุล (6, 8, 9, 11, 24) เนื่องจาก strandspecific hybridization กับ BDV RNAs รับจากสมองหนูที่ติดเชื้อ หรือเซลล์เนื้อเยื่อติดเชื้อแสดงว่า อาร์เอ็นเอ 8.5 kb ถูกข้ามในขั้วเพื่อ RNAs เล็ก เราเสนอว่า BDV มีแนวโน้มที่จะเป็นค่าลบเดอะอาร์เอ็นเอไวรัส (8, 9) สมมติฐานนี้ได้ถูกแย้ง อื่น ๆ รายงานจำนวนเทียบเท่า ofpositive - และลบขั้ว RNAs ในสารสกัดจากสมองหนูที่ติดเชื้อ และโต้เถียงกับแบบสแตรนด์ลบไวรัส (6, 11) การกำหนดขั้วกลุ่มไวรัส มันเป็นสิ่งจำเป็นอันดับแรกเพื่อกำหนดวิธีการในการแยกอนุภาค ofviral นี้ได้เกิดขึ้นแล้ว แม้ว่าเราไม่สามารถแยกออกว่า มีเพิ่มเติม วเวอร์ขั้วบวก genomic RNAs ในอนุภาคสามารถเป็นทาง ทดลอง hybridization เหนือต่อสนับสนุนแบบสแตรนด์ลบอาร์เอ็นเอไวรัส มายวิธีการแยกของ BDV ติดเชื้อให้เราพยายามแสดงภาพประกอบเพลงโดยตรงของอนุภาค โดยอิเล็กตรอน microscopy เราได้ระบุอนุภาค 42 nm ทรงกลม ขัดในเตรียมปล่อยไวรัส (W.I.L. และ C. Ribak ยกเลิกประกาศทำงาน) ถึงแม้ว่าอนุภาคดังกล่าวไม่มีอยู่ในเตรียมจากเซลล์เชื้อ และสอดคล้องกับวิชาชีววิทยาระบบ BDV (จีโนม 8.5 kb putative ความไวให้ผงซักฟอก), อนุภาคเหล่านี้ได้ไม่ยังถูกป้ายใช้แอนตี้จากสัตว์ที่ติดเชื้อ ดังนั้น ความสำคัญของพวกเขายังคงไม่แน่นอน เราได้แนะนำว่า BDV อาจมีระยะนิวเคลียร์ transcription และจำลองแบบ (9, 10) เนื่องจาก มีข้อสังเกต 2: (i) โปรตีน 24 kDa และ 38/40-kDa ของ BDV อยู่ในนิวเคลียสของเซลล์ติดเชื้อ (refs. 24 และ 25 C. Hatalski กรัมและ W.I.L. ยกเลิกประกาศทำงาน) และ (ii) ภาคเหนือ และใน situ hybridization ทดลองแสดงให้เห็นว่า ขณะ RNAs BDV ขนาดเล็กในนิวเคลียสและไซโทพลาซึมอยู่ อาร์เอ็นเอ 8.5 kb จะถูกคุมขังกับนิวเคลียส (9, 10) ศึกษาขนส่ง nucleocytoplasmic ที่อธิบายสาธิตว่า BDV transcription เกิดขึ้นในนิวเคลียสเซลล์ ไวรัสไข้หวัดใหญ่เป็นสัตว์เฉพาะในไวรัสอาร์เอ็นเอจะจำลอง และจำลองในนิวเคลียสเซลล์ (26, 27) แม้ว่าจะเป็นการลบเดอะอาร์เอ็นเอไวรัส มันจะถูกแบ่งเป็นช่วง ปัจจุบันมีหลักฐานไม่ว่า BDV จะถูกแบ่งเป็นช่วง เพิ่มเติม BDV วิเคราะห์ได้แสดงความคล้ายคลึงเท่ากับ nonsegmented สแตร นด์ลบอาร์เอ็นเอไวรัส (28) ปวงข้อมูลเหล่านี้ระบุว่า BDV อาจหมายถึงคลาสที่ไม่ได้กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ของสัตว์อาร์เอ็นเอไวรัส เราขอขอบคุณแคทริน Carbone สำหรับของขวัญกว้างบรรทัดเซลล์ติดเชื้อ BDV C6 และ Bode ลีฟ Marylou V. Solbrig จอห์นฮอลแลนด์ และโดนัลด์ฤดูสำหรับการสนทนาที่ดี งานนี้ได้รับชาติสถาบันของสุขภาพมอบ NS-29425 (T.B., A.L. และ W.I.L.) และ NS 12428 (J.C.T.), มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย Taskforce ใน R91I047 ให้ช่วยสนับสนุน (T.B. และ W.I.L.), Bundesministerium ขนแดน Forschung Technologie 07017660 BMFT เงินช่วยเหลือ (H.L.), และ Deutsche Forschungsgemeinschaft LU142 เงินช่วยเหลือ 1 (H.L.) W.I.L. ได้รับรางวัลเป็นนักสืบหนุ่มจากพันธมิตรแห่งชาติเพื่อการวิจัยโรคจิตเภท และโรคซึมเศร้าและเป็นรางวัลนักปราชญ์พิวจากพิวกุศลบรรดาของฝากได้ 1. ลุดวิกแห่ง H. เป็นลาง L. & Gosztonyi กรัม (1988) Borna โรค: เชื้อไวรัสแบบถาวรของระบบประสาทส่วนกลาง (Karger บาเซิล) 2. อัมสเตอร์ดัม J. D., Winokur, A., Dyson ปริมาณ Herzog, s ได้ Gonzalez, F. ร็อท R. & Koprowski, H. (1985) Arch. ทั่วไปจิตเวช 42, 1093-1096 3. ร็อท R., Herzog, s ได้ Fleischer, B., Winokur, A. อัมสเตอร์ดัม J., Dyson ปริมาณและ Koprowski, H. (1985) วิทยาศาสตร์ 228, 755 756 4. Bechter คุณ Herzog, s ได้ Fleischer, B., Schuttler, R. และร็อท R. Nervenarzt (1987) 58, 617-624 5. เป็นลาง L., Riegel, S. ลุดวิกแห่ง H. อัมสเตอร์ดัม J. D. แลนจ์ ปริมาณและ Koprowski, H. (1988) สา H, 689 6. VandeWoude, S., Richt, J. A., Zink, M. C. ร็อท R. นารายัณ โอ และ Clements, J. E. (1990) วิทยาศาสตร์ 250, 1276-1281 7. เป็นลาง L., Riegel, S. แลนจ์ ตะวันตกและ Virol ประ J. H. (1992) ลุดวิกแห่ง 36, 30-315 8. Lipkin, W. I. ทราวิส G. H., Carbone คุณ M. และ Wilson, M. C. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4184 4188 9. เดอลาทอร์เรคา J. C., Carbone คุณ M. และ Lipkin ชเป็น I. ฝั่งตะวันตก (1990) 179, 853-856 10. Carbone คุณ M., Moench, R. ต.และ Lipkin, Neuropathol J. I. ฝั่งตะวันตก (1991) Exp. Neurol. 50, 205-214 11. Richt, J. A., VandeWoude, S., Zink, M. C. นารา ยัณ 0 & Clements, Virol ทั่วไป J. J. E. (1991) 72, 2251-2255 12. Pauli, G. และลุดวิกแห่ง ทรัพยากรไวรัส H. (1985) 2, 29-33 13. Zwick ปริมาณ Seifried, 0 & Witte, Arch. Wiss J. (1929) Prakt Tierheilkd 59, 511-545 14. โน่ N. เก่า M. และลุดวิกแห่ง Virol ทั่วไป J. H. (1983) 64, 1521-1530 -ATP 0 15 40 40 N CN C N C N C

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

11,486 ค่าใช้จ่ายในการตีพิมพ์บทความนี้ถูก defrayed ในส่วนของการชำระค่าใช้จ่ายหน้า บทความนี้จึงต้องมีการทำเครื่องหมายขอ "โฆษณา" ให้สอดคล้องกับ 18 USC §1734 แต่เพียงผู้เดียวเพื่อบ่งชี้ fact.Proc นี้ Natl Acad วิทย์ สหรัฐอเมริกา 89 (1992) 11,487 (pH 5.0) และ 2 ปริมาณเอทานอล กรดนิวคลีอิกตกตะกอนถูกเม็ดและโพลี (A) + อาร์เอ็นเอได้รับเลือกจาก Oligo (dT) ร (20) RNA รวมเศษส่วนนิวเคลียร์ถูกสกัดด้วย Guanidinium isothiocyanate / กรดฟีนอล (18) RNA รวมเศษส่วนนิวเคลียร์หรือโพลี (A) + RNA จากเศษส่วน postnuclear ได้รับการวิเคราะห์โดยการผสมข้ามพันธุ์กับภาคเหนือของ probes สำหรับการตรวจหา RNAs BDV หรือ mRNA cyclophilin พร็อบ probes 32P ติดฉลากสำหรับ hybridizations ภาคเหนือได้รับการจัดทำขึ้นโดยรองพื้นแบบสุ่ม hexanucleotide cDNAs ของพลาสมิด (21) 32P ป้​​าย probes อาร์เอ็นเอที่เตรียมจากแม่แบบพลาสมิดดีเอ็นเอตามโปรโตคอลจาก Promega พลาสมิดที่ใช้ ได้แก่ pAF4, การเข้ารหัสโปรตีน 24 kDa ของ BDV (8) และ p1B15 เข้ารหัสหนู cyclophilin (22) ภาคเหนือ Hybridization. -สำหรับการวิเคราะห์อนุภาคไวรัสตัวอย่างเป็น RNA จากอนุภาคที่ปล่อยออกมาจาก 10i Oligo / เซลล์ TL หรือ 10 ปั๊กของอาร์เอ็นเอจากปกติหรือสมองของหนู BDV-ที่ติดเชื้อและปกติหรือ BDV-ติดเชื้อเซลล์ Oligo / TL สำหรับอาร์เอ็นเอวิเคราะห์ขนส่ง nucleocytoplasmic, ตัวอย่างเป็น RNA ทั้งหมดจากเศษส่วนนิวเคลียร์หรือโพลี (A) + RNA จากเศษส่วน postnuclear RNAs ถูกขนาด fractionated ใน 2.2 ล้านฟอร์มาล​​ดีไฮด์ / 1.0% agarose เจลและโอนไปยังเยื่อไนลอน (MSI) เยื่อถูกไฮบริดที่มี 32P ติดฉลากดีเอ็นเอโพรบหรือ 32P ป้​​าย probes RNA ที่ 650C ใน 6x SSC (LX SSC เป็น 0.15 M โซเดียมคลอไรด์ / 0.015 M โซเดียมซิเตรท) / 5 x Denhardt โซลูชั่น (LX แก้ปัญหา Denhardt เป็น 0.02% polyvinylpyrrolidone / 0.02% Ficoll / 0.02% ซีรั่มอัลบูมิวัว) / 10 มิลลิ EDTA / 0.5% SDS / ดีเอ็นเอของอสุจิปลาแซลมอนที่ 100 Ag / ml / ยีสต์ tRNA ที่ 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรเป็นเวลา 18 ชั่วโมงแล้วล้างใน 0.2 เท่า SSC / 0.2% SDS ที่ 650C เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะเอ๊ก เยื่อไฮบริดที่มีฟิวส์ RNA ได้สัมผัสกับ RNase ที่ 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร / 10 มม Tris HCl ค่า pH 7.4 / 1 มิลลิ EDTA / 0.3 M NaCl ที่ 370C เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อลดการผสมข้ามพันธุ์พื้นหลังเพื่อ rRNAs มาตรฐานอาร์เอ็นเอ (Gibco / BRL) ถูกนำมาใช้ในการกำหนดขนาดโดยประมาณของ RNAs ผลการเตรียมอนุภาคไวรัส รายงานว่าความเข้มข้นของเกลือสูงที่เกิดจากการแปลที่เพิ่มขึ้นของ RNAs ไวรัส (23) นำไปสู่​​การรักษาของเซลล์ BDV-ติดเชื้อกับสื่อ hypertonic นี้ส่งผลในการค้นพบที่ไม่คาดคิดว่า hypertonicity เหนี่ยวนำให้เกิดการปล่อยของ BDV จากเซลล์ที่ติดเชื้อ (12) เซลล์ต่างๆและเงื่อนไขเกลือมีการศึกษา อัตราผลตอบแทนที่สูงที่สุดของไวรัสที่ได้รับการปล่อยตัวออกมาโดยการรักษา BDV-ติดเชื้อโอลิโกเดนโดรไซต์เซลล์ของมนุษย์ (Oligo / TL) 250 มิลลิ MgCl2 (ไม่ได้แสดงข้อมูล) โดยวิธีการนี​​้ 5 x 108 อนุภาคติดเชื้อ (หน่วยมุ่งขึ้นรูป) ได้รับการปล่อยตัวจาก 2 x 108 Oligo / เซลล์ TL (ตารางที่ 1) ผงซักฟอกอ่อน (0.002% Zwittergent) ในการกำจัดไขมันส่วนเกินออกจากตัวอย่างชี้แจงผลในการชั่วคราวลดลง 1-2 ลอการิทึมใน titer ไวรัส อิสระของการรักษาผงซักฟอกลดลงลอการิทึม 1 ใน titer เกิดขึ้นหลังจากการหมุนเหวี่ยงความเร็วสูงครั้งแรกของไวรัสปล่อยออกมา (ไม่ได้แสดงข้อมูล) การรักษาปล่อยออกมาเตรียมไวรัส nucleases ไม่ได้ส่งผลกระทบต่อ titer ไวรัส (ตารางที่ 1) BDV อนุภาคบรรจุลบขั้ว-RNA 8.5 กิโล การทดลองผสมข้ามพันธุ์ภาคเหนือเปิดเผยว่า 8.5 กิโล BDV อาร์เอ็นเอได้รับการคุ้มครองจาก nucleases ในระหว่างการเตรียมอนุภาค (รูป. 1A) สอบสวนเกลียวคู่เป็นตัวแทน ORF สำหรับโปรตีน 24 kDa ของ BDV ตรวจพบหลาย RNAs BDV-เฉพาะ (8.5, 3.5, 2.1 และ 0.8 กิโล) ในสารสกัดจากเซลล์ที่ติดเชื้อ ในทางตรงกันข้ามเพียง RNA 8.5 กิโลถูกตรวจพบในสารสกัดจากอนุภาคไวรัส ขั้วของ RNA 8.5 กิโลที่ได้มาจากการเตรียมอนุภาคไวรัสถูกตรวจสอบในการทดลองผสมข้ามพันธุ์โดยใช้ยานสำรวจ RNA singlestranded ทั้ง antisense หรือความรู้สึกเดียวกันกับ mRNA เข้ารหัสโปรตีน 24 kDa ของ BDV (รูป. 1B) ในขณะที่การสอบสวน RNA antisense ตรวจพบตาราง BDV ขนาดเล็ก 1. การเตรียมอนุภาคไวรัสผลผลิตไวรัส FFU x 107 ขั้นตอนการรักษารวม * สูงสุด MMN 1 ทับซ้อนล้างชั้นเซลล์ 57.0 84.0 12.0 (2 x 108 เซลล์) ที่มีบัฟเฟอร์ Tris-Mg2so; ฟัก 1.5 ชั่​​วโมง 3rC; เก็บสารละลายและหมุน 5 นาที, 2500 XG, RT 2 ปรับใส 0.002% 2.3 6.6 0.24t Zwittergent; ฟัก 1 ชั่วโมง, RT 3 ปั่น 1 ชั่วโมง, 100,000 X กรัม 206C; 2.7 4.0 1.5 เม็ดแขวนลอยใน Tris-Mg, 25 บัฟเฟอร์ 4 เพิ่ม DNase, RNase (50 PG / ml 2.5 4.2 1.3 แต่ละคน); ฟัก 1 ชั่วโมง, 5 37TC ปั่น 1 ชั่วโมง, 100, W0 X กรัม 4C; 4.3 7.3 1.5 เม็ดแขวนลอยใน FFU บัฟเฟอร์ Tris-Mgu5 โฟกัสขึ้นรูปหน่วย; สูงสุดสูงสุด; นาทีขั้นต่ำ RT, อุณหภูมิห้อง * หมายถึงแปดเตรียม tValues​​ หลังการรักษา Zwittergent แตกต่างกัน แต่ผลตอบแทนที่คล้ายกันที่ได้รับในการทดลองทั้งหมดหลังจากการกำจัดผงซักฟอกโดยการหมุนเหวี่ยงในขั้นตอนที่ 3 RNAs (150 ปีที่ผ่านมา BDV ตัวแทนที่เป็นสาเหตุของโรคนี้ยังคงไม่เป็นความลับ. ในฐานะที่เป็นไวรัส eluded วิธีคลาสสิกสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ อย่างเป็นทางการ proofof พื้นฐานสำหรับโรคติดเชื้อ Borna และลักษณะเบื้องต้น ofthe ตัวแทนก็ประสบความสำเร็จเมื่อเร็ว ๆ นี้ผ่านการใช้วิธีโมเลกุล (6, 8, 9, 11, 24). เพราะการผสมข้ามพันธุ์ strandspecific เพื่อ RNAs BDV ที่ได้รับจากสมองของหนูที่ติดเชื้อหรือการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ เซลล์ชี้ให้เห็นว่าอาร์เอ็นเอ 8.5 กิโลเป็นสิ่งที่ตรงกันข้ามในขั้วที่จะ RNAs ขนาดเล็กที่เราเสนอว่า BDV มีแนวโน้มที่จะเป็น RNA ไวรัสลบสาระ (8, 9). สมมติฐานนี้ได้รับการโต้เถียง. อื่น ๆ การรายงานจำนวนเงินเทียบเท่า ofpositive- และ RNAs ลบกระแสไฟฟ้าในสารสกัดจากสมองของหนูที่ติดเชื้อและแย้งกับไวรัสลบสาระรูปแบบ (6, 11). การตรวจสอบขั้วจีโนมของไวรัสมันเป็นสิ่งสำคัญแรกที่จะปรับแต่งวิธีการแยก ofviral อนุภาค นี้ได้รับการประสบความสำเร็จ ถึงแม้ว่าเราจะไม่สามารถแยกความเป็นไปได้อย่างเป็นทางการว่ามีเพิ่มเติม RNAs จีโนมบวกขั้วตรวจไม่พบในอนุภาคทดลองผสมข้ามพันธุ์ภาคเหนืออธิบายไว้ที่นี่สนับสนุน RNA ลบสาระแบบไวรัส การถือกำเนิดของวิธีการแยกเชื้อ BDV แจ้งให้เราพยายามสร้างภาพโดยตรงของอนุภาคโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน เราได้ระบุ 42 นาโนเมตรทรงกลมห่อหุ้มอนุภาคในการเตรียมการปล่อยไวรัส (WIL และ C Ribak การทำงานที่ไม่ได้เผยแพร่) แม้ว่าอนุภาคดังกล่าวไม่ได้อยู่ในการเตรียมจากเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อและมีความสอดคล้องกับชีววิทยาของระบบ BDV (สมมุติจีโนม 8.5 กิโลไวต่อผงซักฟอก) อนุภาคเหล่านี้ยังไม่ได้รับการติดฉลากโดยใช้แอนติบอดีจากสัตว์ที่ติดเชื้อ ดังนั้นความสำคัญของพวกเขายังคงมีความไม่แน่นอน เราได้แสดงให้เห็นว่า BDV อาจจะมีขั้นตอนการนิวเคลียร์สำหรับการถอดความและการจำลองแบบ (9, 10) เพราะสองข้อสังเกต: (i) 24 กิโลดาลตันและ 38 / โปรตีน 40 kDa ของ BDV ที่มีอยู่ในนิวเคลียสของเซลล์ที่ติดเชื้อ (refs . ที่ 24 และ 25; CG Hatalski และ WIL การทำงานที่ไม่ได้เผยแพร่) และ (ii) ภาคเหนือและในแหล่งกำเนิดการทดลองผสมข้ามพันธุ์พบว่าในขณะที่ RNAs BDV ขนาดเล็กที่มีอยู่ในนิวเคลียสและ cytoplasm, RNA 8.5 กิโลถูกกักขังอยู่ในนิวเคลียส (9, 10) การศึกษาการขนส่ง nucleocytoplasmic อธิบายแสดงให้เห็นว่าการถอดความ BDV เกิดขึ้นในนิวเคลียสของเซลล์ เชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่เป็น RNA ไวรัสสัตว์เท่านั้นที่รู้จักกันที่จะทำซ้ำและคัดลอกในนิวเคลียสเซลล์ (26, 27) แม้ว่าจะเป็น RNA ไวรัสลบสาระก็เป็นหมวดหมู่ ปัจจุบันมีหลักฐานที่แสดงว่าเป็นหมวดหมู่ BDV ไม่มี นอกจากนี้การวิเคราะห์ลำดับ BDV ได้แสดงให้เห็นความคล้ายคลึงกันเท่านั้นที่จะ nonsegmented ไวรัส RNA ลบสาระ (28) ที่ร่วมกันข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า BDV อาจจะเป็นชั้นที่ไม่ได้กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ของไวรัส RNA สัตว์ เราขอขอบคุณแคทรีน Carbone หาของขวัญที่ใจดีของ BDV-ติดเชื้อสายพันธุ์ของเซลล์ C6 และ Liv ลางบอกเหตุ Marylou V. Solbrig, จอห์นฮอลแลนด์และโดนัลด์ในช่วงฤดู​​ร้อนสำหรับการอภิปรายที่เป็นประโยชน์ การสนับสนุนสำหรับงานนี้ได้รับจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติรับเงินอุดหนุนจาก NS-29425 (TB, AL และ WIL) และ NS-12428 (JCT) มหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนียหน่วยเฉพาะกิจเกี่ยวกับโรคเอดส์ให้ R91I047 (TB และ WIL) Bundesministerium ขน Forschung และเทคโนโลยี แกรนท์ BMFT-07017660 (HL) และสหพันธ์สาธารณรัฐ LU142-1 แกรนท์ (HL) WIL เป็นผู้รับรางวัลวิจัยหนุ่มจากชาติพันธมิตรเพื่อการวิจัยโรคจิตเภทและภาวะซึมเศร้าและรางวัลนักวิชาการจาก Pew Pew ไว้ใจ 1. ลุดวิกเอชลางบอกเหตุ L. & Gosztonyi, G. (1988) Borna โรคติดเชื้อไวรัสถาวรของระบบประสาทส่วนกลาง (Karger, บาเซิล) 2. อัมสเตอร์ดัม, JD, วิโนคูร์, A. , ไดสันวชิร Herzog, S. อนซาเลซ, เอฟ, Rott, R. & Koprowski เอช (1985) Arch พลจิตเวช 42, 1093-1096 3. R​​ott หม่อมราชวงศ์ Herzog, S. , Fleischer บีวิโนคูร์, A. , อัมสเตอร์ดัม, เจไดสันดับเบิลยูและ Koprowski เอช (1985) วิทยาศาสตร์ 228, 755-756 4. Bechter, เค Herzog, S. , Fleischer บีSchüttler, R. & Rott, R. (1987) Nervenarzt 58, 617-624 5. ลางบอกเหตุลิตร Riegel, S. , ลุดวิกเอช, อัมสเตอร์ดัม, JD, มีเหตุมีผลและดับบลิว Koprowski เอช (1988) มีดหมอ H, 689 6. VandeWoude, S. , Richt, JA, Zink , MC, Rott หม่อมราชวงศ์ Narayan ทุมและเคลเมนท์, JE (1990) วิทยาศาสตร์ 250, 1276-1281 7. ลางบอกเหตุลิตร Riegel, S. , มีเหตุมีผลและลุดวิกดับบลิวเอช (1992) เจ Med Virol 36, 30-315 8. Lipkin, WI, เทรวิส GH, Carbone, KM & วิลสัน, MC (1990) พร Natl Acad วิทย์ สหรัฐอเมริกา 87, 4184 4188. 9. เดอลาตอร์เร่ JC, Carbone, KM & Lipkin, WI (1990) ไวรัสวิทยา 179, 853-856 10. Carbone, KM, Moench, TR & Lipkin, WI (1991) เจ Neuropathol ประสบการณ์ Neurol 50, 205-214 11. Richt, JA, VandeWoude, S. , Zink, MC, Narayan, 0 & เคลเมนท์, JE (1991) เจพล Virol 72, 2251-2255 12. เปาลี G. & ลุดวิกเอช (1985) ไวรัส Res 2, 29-33 13. ซวิค, W. , Seifried, 0 & วิตต์, เจ (1929) Arch Wiss Prakt Tierheilkd 59, 511-545 14. Hirano, N. , Kao, M. & ลุดวิกเอช (1983) เจพล Virol 64, 1521-1530 -ATP 0 15 40 40 N CN CNCNC

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

11486 สิ่งพิมพ์ค่าใช้จ่ายของบทความนี้ในส่วนของค่าธรรมเนียมการชำระเงิน defrayed หน้า บทความนี้จึงต้องขอเครื่องหมาย " โฆษณา " สอดคล้องกับ 18 U.S.C . § 1652 แต่เพียงผู้เดียวเพื่อบ่งชี้ fact.proc นี้ NATL . ราช . สภาวะโลกร้อน 89 สหรัฐอเมริกา ( 2535 ) 11487 ( pH 5.0 ) และ 2 ปริมาณเอทานอล ตกตะกอนกรดนิวคลีอิกเป็นเม็ดและพอลิ ( ) ซึ่งถูกเลือกโดยโอลิโก ( DT ) โครม ( 20 )อาร์เอ็นเอรวมจากเศษส่วนนิวเคลียร์สารไอโซไธโอไซยาเนต guanidinium / กรดฟีนอล ( 18 ) อาร์เอ็นเอรวมจากเศษส่วนนิวเคลียร์หรือ poly ( A ) ซึ่งได้จาก postnuclear เศษส่วนโดยใช้ภาคเหนือทำโพรบตรวจจับ RNAs bdv หรือ cyclophilin mRNA . เครื่องมือตรวจสอบ 32p ป้ายติดตาม hybridizations ภาคเหนือเตรียมโดยการสุ่ม hexanucleotide รองพื้นของพลาสมิด cdnas ( 21 )32p ติดป้าย RNA probes ถูกเตรียมจากแม่แบบดีเอ็นเอพลาสมิดตามโปรโตคอลจาก promega . เพื่อใช้เป็น paf4 , 24 kDa โปรตีน bdv การเข้ารหัส ( 8 ) และ p1b15 หนู cyclophilin การเข้ารหัส ( 22 ) ภาคเหนือ ( - สำหรับการวิเคราะห์อนุภาคไวรัสจำนวน RNA จากอนุภาคที่ออกโดย 10i โอลิโก / TL เซลล์หรือ 10 ปั๊กของ RNA จากปกติหรือ bdv ติดเชื้อสมองหนู และปกติหรือ bdv ติดเชื้อโอลิโก / TL เซลล์ เพื่อดู nucleocytoplasmic การขนส่งการวิเคราะห์ตัวอย่างอาร์เอ็นเอรวมจากเศษส่วนนิวเคลียร์หรือ poly ( A ) ซึ่งได้จาก postnuclear เศษส่วน คือขนาด 2.2 เมตรพบ RNAs ในฟอร์มาลดีไฮด์ / 10 % ( เจลและโอนไปยังเยื่อไนลอน ( MSI ) เยื่อแผ่นแบบโพร 32p ติดป้ายว่า DNA probes หรือ 32p ติดป้าย RNA probes ที่ 650c ใน 6x SSC ( LX SSC เป็น 0.15 เมตร / 3 M โซเดียมคลอไรด์โซเดียมซิเตรต ) / 5 x denhardt โซลูชั่น ( LX denhardt โซลูชั่น 0.02% พอลิวินิลไพร์โรลิโดน / 0.02 % ficoll / 0.02 % โปรตีนอัลบูมินและเซรั่ม 10 mM EDTA / 0 ) .5 % SDS / แซลมอน DNA สเปิร์มที่ 100 AG / ml / ยีสต์การเมารถที่ 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรเป็นเวลา 18 ชั่วโมงแล้วล้างใน 0.2x SSC / 0.2 % SDS ที่ 650c 30 นาที ก่อนที่เก้าอี้รับแขก . เยื่อหุ้มด้วยดีเอ็นเอ RNA probes เปิดรับเลสที่ 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร / HCl หรือ 10 มม. , pH 7.4/1 mM EDTA / 0.3 โมลาร์ที่ 370c 30 นาที เพื่อลดการทำพื้นหลัง rrnas .มาตรฐาน RNA ( gibco / BRL ) ถูกใช้เพื่อกำหนดขนาดโดยประมาณของ RNAs . ผลการเตรียมอนุภาคไวรัส . รายงานว่า ความเข้มข้นเกลือสูง ทำให้การแปลที่เพิ่มขึ้นของไวรัส RNAs ( 23 ) ทำให้การรักษาเซลล์ที่ติดเชื้อ bdv กับไฮเปอร์โทนิกของสื่อ นี้ส่งผลในการค้นหาที่ไม่คาดคิด hypertonicity รุ่น bdv จากเซลล์ที่ติดเชื้อ ( 12 )เซลล์ต่างๆและเงื่อนไขเกลือได้ ผลผลิตสูงสุดของตัวไวรัสได้ โดยการรักษาติดเชื้อมนุษย์เซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์ bdv เส้นเล็ก / TL 250 มม. ) ชุด ( ข้อมูลไม่แสดง ) ด้วยวิธีนี้ , 5 x 108 ติดเชื้ออนุภาค ( เน้นสร้างหน่วย ) ได้รับการปล่อยตัวจาก 2 x 108 โอลิโก / TL เซลล์ ( ตารางที่ 1 ) ผงซักฟอก ( 0.002 % zwittergent )ใช้กำจัดไขมันส่วนเกินจากการชี้แจงตัวอย่าง มีผลในการลดระดับ 1-2 ลอการิทึมแบบไวรัส อิสระของการรักษาผงซักฟอก 1 ฟังก์ชันลอการิทึมลดลงในระดับที่เกิดขึ้นหลังแรกความเร็วสูงปั่นของตัวไวรัส ( ข้อมูลไม่แสดง ) การปล่อยไวรัส ด้วยการเตรียม nucleases ไม่มีผลต่อไตเตอร์ไวรัส ( ตารางที่ 1 )bdv อนุภาคประกอบด้วยลบขั้ว 8.5-kb RNA จากการทดลองพบว่า ภาคเหนือ ( 8.5-kb bdv RNA ถูกป้องกันจาก nucleases ในระหว่างการเตรียมอนุภาค ( รูปที่ 1A ) คู่ตีเกลียวสอบสวนแทน ORF สำหรับ 24 kDa โปรตีน bdv พบ RNAs เฉพาะ bdv หลาย ( 8.5 , 3.5 , 2.1 และ 0.8 KB ) สารสกัดจากเซลล์ที่ติดเชื้อ ในทางตรงกันข้ามเพียง 85-kb rna ไวรัสที่ตรวจพบในอนุภาคสารสกัด ขั้วของ 8.5-kb RNA ที่ได้จากการเตรียมอนุภาคไวรัสที่พบในการทดลองใช้สาร singlestranded RNA probes เหมือนกันความรู้สึกเดียวกันกับยีน antisense หรือ 24 kDa โปรตีน bdv การเข้ารหัส ( รูปที่ 1A ) antisense RNA probe และตรวจพบขนาดเล็ก bdv ตาราง 1 . การเตรียมอนุภาคไวรัสไวรัสผลผลิตFFU x 107 ขั้นตอนการรักษาทั้งหมด * แม็กซ์ MMN 1 ทับซักชั้นเซลล์ที่ 57.0 84.0 12.0 ( 2 x 108 เซลล์ ) ด้วย tris-mg2so บัฟเฟอร์ ; ฟักไข่ 1.5 ชั่วโมง 3rc รวบรวมและนำปั่น 5 นาที 2500 x g , RT 2 ปรับสูงถึงร้อยละ 0.002 2.3 6.6 , 0.24t zwittergent ; พัก 1 ชั่วโมง ร์ที 3 ปั่น 1 ชั่วโมง 100000 x G , 206c ; 2.7 4.0 1.5 เม็ด ทั้งนี้ resuspend มิลลิกรัม , 25 บัฟเฟอร์ 4 เพิ่มตรวจหา ADNase เลส ( 50 , pg / ml 2.5 4.2 , 13 แต่ละ ) ; พัก 1 ชั่วโมง 37tc 5 ปั่น 1 ชม. 100 , W0 x g , 4c ; 4.3 7.3 1.5 resuspend เม็ด tris-mgu5 บัฟเฟอร์ FFU , โฟกัสเป็นหน่วย แม็กซ์ สูงสุด ; มินสุด ; RT , ที่อุณหภูมิห้อง * ค่าเฉลี่ยของแปดและการเตรียมงาน tvalues หลังจาก zwittergent การรักษาแตกต่างกันไป แต่ให้ผลคล้ายกันได้ในการทดลองหลังจากการกำจัดผงซักฟอกโดยการเหวี่ยงแยกในขั้นตอนที่ 3 RNAs ( 150 ปีที่ผ่านมา bdv , ,เป็นตัวแทนที่ทำให้เกิดโรคนี้ยังไม่มีประเภท . เป็นไวรัส eluded วิธีการคลาสสิกสำหรับการอย่างเป็นทางการ proofof ะติดเชื้อโรคและคุณสมบัติของเจ้าหน้าที่ บอร์นาเบื้องต้นได้ เพิ่งผ่านการใช้แนวทางเชิงโมเลกุล ( 6 , 8 , 9 , 11 , 24 )เพราะ strandspecific hybridization สำหรับ bdv RNAs ที่ได้รับจากสมองหนูที่ติดเชื้อหรือเซลล์เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ พบว่า 8.5-kb RNA เป็นขั้วตรงข้ามในการ RNAs ขนาดเล็ก เราเสนอว่า bdv มีแนวโน้มที่จะถูกลบ strand RNA ไวรัส ( 8 , 9 ) สมมติฐานนี้ได้ถูกแย้งคนอื่นๆ รายงานปริมาณ ofpositive เทียบเท่า - และลบขั้ว RNAs ในสารสกัดจากสมองหนูที่ติดเชื้อและโต้เถียงกับไวรัสลบแบบเส้น ( 6 , 11 ) การตรวจสอบไวรัสจีโนมขั้วมันเป็นครั้งแรกเพื่อปรับแต่งวิธีการแยก ofviral อนุภาค นี้ ได้รับความ แม้ว่าเราไม่สามารถแยกความเป็นไปได้ที่เป็นทางการมีเพิ่มเติมตรวจสอบขั้วบวกจีโนม RNAs ในอนุภาคของสารทดลองที่อธิบายที่นี่สนับสนุนรูปแบบเส้นอาร์เอ็นเอไวรัสลบ การมาถึงของวิธีการสำหรับการแยกมูลฝอย bdv แจ้งเราพยายามสร้างภาพโดยตรงของอนุภาคด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน เราได้ระบุ 42 นาโนเมตรทรงกลมห่อหุ้มอนุภาคในการเตรียมปล่อยไวรัส ( w.i.l. และคริบักประกาศ , ทำงาน ) ถึงแม้ว่าอนุภาคดังกล่าวไม่มีอยู่ในการเตรียมการมาก่อน จากเซลล์ และมีความสอดคล้องกับชีววิทยาของระบบ bdv ( ซึ่ง 8.5-kb จีโนม ; ไวต่อผงซักฟอก ) อนุภาคเหล่านี้ยังไม่ได้ถูกระบุว่าใช้แอนติบอดีจากสัตว์ที่ติดเชื้อ ดังนั้น ความสำคัญของพวกเขายังคงไม่แน่ใจเราได้พบว่ามีเฟส bdv นิวเคลียร์เพื่อการถอดความและการจำลองแบบ ( 9 , 10 ) เพราะสองสังเกต : ( i ) 24 kDa และ 38 / 40 kDa และโปรตีนของ bdv ที่มีอยู่ในนิวเคลียสของเซลล์ที่ติดเชื้อ ( อ้างอิง 24 และ 25 ; c . G . hatalski w.i.l. และพิมพ์งาน ) , และ ( ii ) ภาคเหนือใน situ hybridization และการทดลองพบว่าส่วนที่เล็กกว่าปัจจุบัน bdv RNAs ในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม , 8.5-kb RNA ถูกกักขังอยู่ในนิวเคลียส ( 9 , 10 ) การขนส่ง nucleocytoplasmic การศึกษาอธิบายแสดงให้เห็นว่า bdv ถอดความเกิดขึ้นในเซลล์นิวเคลียส ไวรัสไข้หวัดใหญ่เป็นเพียงสัตว์ RNA ไวรัสที่รู้จักกันมากและคัดลอกในเซลล์ นิวเคลียส ( 26 , 27 ) แม้ว่าจะลบเส้นอาร์เอ็นเอไวรัสมันเป็นแบ่ง . มีปัจจุบันไม่มีหลักฐานว่า bdv เป็นแบ่ง . นอกจากนี้การวิเคราะห์ลำดับ bdv ได้แสดงความคล้ายคลึงกันเพียง nonsegmented ลบเส้นอาร์เอ็นเอไวรัส ( 28 ) ที่ถ่ายด้วยกันข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า bdv อาจหมายถึงคลาส undefined ก่อนหน้านี้ไวรัส RNA ของสัตว์ เราขอขอบคุณแคท Carbone สำหรับของขวัญใจกว้างของ bdv ติดเชื้อ C6 เซลล์เส้นและลิฟ ลาง marylou , Vsolbrig จอห์น ฮอลแลนด์ และ โดนัลด์ ฤดูร้อนสำหรับการสนทนาที่เป็นประโยชน์ งานนี้สนับสนุนโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติ มอบ ns-29425 ( ทีบี a.l. , และ w.i.l. ) และ ns-12428 ( j.c.t. ) มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียในสายงานให้ r91i047 ( วัณโรค โรคเอดส์ และ w.i.l. ) bundesministerium ขนที่สองเพื่อศึกษาวิวัฒนาการทางความคิดเกี่ยวกับเทคโนโลยีและให้ bmft-07017660 ( h.l. )นายแกรนท์และ forschungsgemeinschaft lu142-1 ( h.l. ) w.i.l. เป็นผู้รับของหนุ่มสาวนักได้รับรางวัลจากชาติพันธมิตรเพื่อการวิจัยโรคจิตเภท โรคซึมเศร้า และนักวิชาการปิ้วปิ้วรางวัลจากมูลนิธิไว้ใจ 1 . ลุดวิก เอช ลาง& gosztonyi , L , G . ( 1988 ) โรคบอร์นา : การติดเชื้อไวรัสแบบถาวรของระบบประสาทส่วนกลาง ( คาร์เกอร์ , Basel ) 2 . อัมสเตอร์ดัม , J . D . ,วิโนเคอร์ , A . , Dyson , W . Herzog , เอส , กอนซาเลซ , F . R . โรจน์ , , & koprowski , H . ( 1985 ) โค้ง และจิตเวช 42 , 1093-1096 . 3 . ร็อท , R Herzog , เอส เฟลชเชอร์ บี วิโนเคอร์ , A . , อัมสเตอร์ดัม , เจ , Dyson , W . & koprowski , H . ( 2528 ) . 228 , 755-756 . 4 . เบชเตอร์ เค. Herzog , เอส เฟลชเชอร์ บี schuttler , R &ร็อท , R ( 1987 ) nervenarzt 58 , 617-624 . 5 . ลาง L . s , Riegel , ลุดวิก , H . , อัมสเตอร์ดัม , J . D . ,& koprowski แลง , W , H . ( 1988 ) มีดหมอ H , 689 . 6 . vandewoude เอส richt เจเอ ซิงค์ เอ็ม. ซี. ร็อท , R Narayan , &คลีโอ เจ. อี. ( 1990 ) วิทยาศาสตร์ 250 , 1276-1281 . 7 . ลาง L . s , Riegel , แลง , W . &ลุดวิก , H . ( 2535 ) . Med . virol . 36 , 30-315 . 8 . Lipkin , W . . ทราวิส จี. เอช. เค. เอ็ม คาร์โบน , , &วิลสัน เอ็ม. ซี. ( 1990 ) proc . NATL . ราช . สภาวะโลกร้อน สหรัฐอเมริกา 87 4184 4001 . 9 . เดอ ลา ทอร์เร เจ. ซี. Carbone Kเมตร & Lipkin , W . I ( 1990 ) ไวรัสวิทยา 179 , 853-856 . 10 . คาร์บอน เค ม. 9 ต. ร. & Lipkin , W . . . ( 2534 ) . neuropathol . EXP neurol . 50 , 205-214 . 11 . richt เจ เอ vandewoude , เอส , ซิงค์ , เอ็มซี. Narayan , 0 . &คลี , J . E . ( 2534 ) . พล.อ. virol . 72 , 2251-2255 . 12 . เพาลี จี &ลุดวิก , H . ( 1985 ) ไวรัสคงเหลือ 2 , 29-33 . 13 . seifried สวิก , W . , , 0 &วิตต์ , J . ( 1929 ) โค้ง วิ ์ . prakt .tierheilkd . 59 , 511-545 . 14 . จีน , เอ็น , เกา , ม. &ลุดวิก , H . ( 2526 ) . พล.อ. virol . 64 , 1521-1530 . - เอทีพี 0 15 40 40 n CN C N C N C