(1995). After the preamplification

(1995). After the preamplification reaction, the reaction mixture was diluted to 150 μl with double distilled
H2O (dd H2O). The 10 μl PCR selective amplification system contained 1 μl of product from the diluted preamplification
reaction, 25 ng of both selective primers, 0.3 units of Taq DNA polymerase, 0.2 mM of each dNTP, 1.5 mM MgCl2 1X PCR buffer. All amplification reactions were performed in a Touch gene model thermocycler (Techne). Initially, three individuals from three studied strains were chosen to test the variation of 66 primer combinations (data not shown). With these individuals the polymorphism rates and the total number of bands with the 66 primer combinations were evaluated. The most useful primer combinations were considered those having the highest polymorphism rate that also
generate a reasonable number of clearly detectable
total fragments. Using results from the evaluation of
66 primer combinations based on 3 individuals, the ten
most-polymorphic primer combinations, producing
clearly readable bands, were selected for the subsequent
analyses with at least 30 samples.
Gel analysis: An equal volume of loading buffer
(Formamide 10 ml, Xylene cyanol FF 10 mg,
Bromophenol blue 10 mg, 0.5 M EDTA pH 8.0 200 μl)
was added to each sample, and denatured at 95°C for 3
min then placed on ice for 2 min before loading. 4 μl of
samples loaded onto 6% denaturing polyacrylamide gel
matrix (7 M Urea; 19:1 Acrylamide: bis; 1X TBE
buffer). The electrophoresis parameters were set to 75
Watt, 50°C and a run time of 1.5 hours was selected.
Bands detected by the silver staining procedure
(Promega, Technical manual No.023) and gel images
were scanned and saved as jpeg files for scoring and further
analysis. Two typical gels are shown in Figure 1a,b.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( 1995 ) หลังจาก preamplification ปฏิกิริยา , ปฏิกิริยาผสมเจือจางกับ 150 μ L กับคู่กลั่น
H2O ( DD H2O ) 10 μผมเลือกแบบ PCR ระบบที่มีอยู่ 1 μลิตรของผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาเจือจาง preamplification
25 นาโนทั้งเลือกไพรเมอร์ 0.3 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค , 0.2 มม. ของแต่ละ dntp 1.5 มม. MgCl2 ใช้ PCR bufferปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนยีนทั้งหมดในสัมผัสแบบเทอร์โมไซเคล ์ ( techne ) ตอนแรก , สามบุคคลจากสามการศึกษาสายพันธุ์ เลือกที่จะทดสอบการเปลี่ยนแปลงของ 66 ผสมรองพื้น ( ข้อมูลไม่แสดง ) กับเหล่านี้แต่ละบุคคล - อัตราและจำนวนวง 66 ผสมรองพื้นถูกประเมินผสมรองพื้นที่มีประโยชน์มากที่สุด ถือว่าเป็นผู้ที่มีคะแนนสูงสุด ) ที่ยัง
สร้างเหมาะสมจำนวนชัดเจนได้
รวมเศษ การใช้ผลจากการประเมินของ
66 ผสมรองพื้นตาม 3 ตัว , 10
polymorphic ที่สุดผสมรองพื้นผลิต
อ่านได้อย่างชัดเจนและถูกเลือกสำหรับตามมา
วิเคราะห์อย่างน้อย 30 คน การวิเคราะห์ปริมาณเท่ากับ
เจล : โหลดบัฟเฟอร์
( Formamide 10 มิลลิลิตร ไซลีน cyanol FF 10 mg ,
โบรโมฟีนอลบลู 10 mg 0.5 M EDTA pH 8.0 200 μ L )
ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละตัวอย่าง และใช้ที่ 95 องศา C เป็นเวลา 3 นาที แล้ววางไว้บน
น้ำแข็ง 2 นาทีก่อนการโหลด 4 μ l
ตัวอย่างที่โหลดลง 6% ี่ polyacrylamide gel matrix (
7 M ยูเรีย ; 19 : 1 : บิสอะคริลาไมด์ ; 1x ทีบี
บัฟเฟอร์ )วิธีพารามิเตอร์ถูกตั้งค่าที่ 75
วัตต์ 50 °องศาเซลเซียสและใช้เวลา 1.5 ชั่วโมงเลือก แถบตรวจโดยการย้อมสี

( promega เงินขั้นตอนคู่มือ no.023 ทางเทคนิค ) และเจลรูป
ถูกสแกนและบันทึกเป็นไฟล์ JPEG สำหรับคะแนนและการวิเคราะห์ต่อไป

แบบสองเจลจะแสดงในรูปที่ 8 พ.