To estimate total BoMinD levels in

To estimate total BoMinD levels in transgenic cauliflower plants,total soluble protein (TSP) was extracted from the leaves of WTA. thaliana, tobacco and cauliflower and also from the transgenic cauliflower leaves by snap freezing in liquid nitrogen and crushing them with a conical grinder in 400 l of ice cold protein extraction buffer (60 mM Tris–HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM EDTA, 30 mM mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF). After centrifugation for 15 min at 10,000 × g at 4◦C, the supernatant was recovered and TSP wasquantified by using the Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, USA). Proteins were denatured by heating at 95◦C for 5 min and then loaded onto a 12% (w/v) SDS-PAGE. Proteins separated by SDS-PAGE, were transferred onto a nitrocellulose membrane using an iBlotTM Gel Transfer System (Invitrogen). Membranes were blocked for 1 h in blocking solution [1× TBST pH 7.4, 4% (w/v) dried skim milk powder]. The primary antibody wash was performed with the rabbit polyclonal anti-MinD antibody (1:5000) (Nakanishi et al., 2009) for 1 h, followed by 1 h incubation with anti-rabbit IgG FcHRP Conjugate (Promega). The blot was rinsed twice in TBST for 5 min in between each step and at the end before adding the detection sub-strate, which contained luminol, iodophenol and H2O2(Sigma).Blots were then exposed to Amersham HyperfilmTMECL film for 5 min and then developed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประเมินรวม BoMinD ระดับในกะหล่ำจำลองพืช โปรตีนละลายน้ำรวม (TSP) ถูกแยกจากใบของดับเบิลยูทีเอ thaliana ยาสูบและกะหล่ำดอกและ จากใบกะหล่ำจำลองโดยสแนปแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และบด ด้วยเครื่องบดทรงกรวยใน 400 ลิตรของน้ำแข็งเย็นโปรตีนสกัดบัฟเฟอร์ (60 มม.ทริสเรทติ้ง – HCl pH 8.0, 500 มม. NaCl, EDTA, mercaptoethanol 30 มม. 10 มม. 0.1 mM PMSF) ยัง กู้ supernatant หลังจากการหมุนเหวี่ยง 15 นาทีที่ 10,000 × g ที่ 4◦C และ wasquantified ช้อนชา โดยใช้ทดสอบโปรตีน Rad ไบโอ (Bio-ล้อ สหรัฐอเมริกา) โปรตีนถูกเอทิลแอลกอฮอล์ โดยเครื่องทำความร้อนที่ 95◦C 5 นาที และโหลดลง 12% (w/v) SDS-หน้า โปรตีนโดย SDS-หน้า ถูกถ่ายโอนลงบนไนโตรเซลลูโลสเยื่อหุ้มเซลล์โดยใช้การ iBlotTM ระบบโอนเจล (Invitrogen) เยื่อหุ้มถูกบล็อกสำหรับ h 1 ในบล็อกแก้ปัญหา [1 × TBST pH 7.4 นมพร่องมันเนย 4% (w/v) แห้งผง] ล้างแอนติบอดีหลักดำเนินการกับกระต่ายโพลีแอนติใจต้านแอนติบอดี (1:5000) (เอะ et al. 2009) สำหรับ h 1 ตาม ด้วยกกไข่ประมาณ 1 ชม.กับป้องกันกระต่าย IgG FcHRP สังยุค (Promega) น้าถูกล้างสองครั้งใน TBST 5 นาที ระหว่างแต่ละขั้นตอน และ ในตอนท้ายก่อนที่จะเพิ่มการตรวจสอบย่อย-strate ที่ประกอบด้วยลูมินอล iodophenol และ H2O2(Sigma) จัดมาแล้ว สัมผัสกับฟิล์ม Amersham HyperfilmTMECL 5 นาที และพัฒนาแล้ว

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในการประมาณระดับ BoMinD ทั้งหมดในพืชดัดแปรพันธุกรรมกะหล่ำทั้งหมดที่ละลายน้ำได้โปรตีน (TSP) เป็นสารสกัดจากใบของ WTA thaliana ยาสูบและกะหล่ำดอกและจากกะหล่ำดัดแปรพันธุกรรมออกจากสแน็ปแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและบดด้วยเครื่องบดรูปกรวยใน 400? L ของบัฟเฟอร์เย็นสกัดโปรตีน (60 mM Tris-HCl ค่า pH 8.0 ที่ 500 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์ 10 มิลลิ EDTA, 30 มิลลิเมตร? mercaptoethanol 0.1 มิลลิ PMSF) หลังจากการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 15 นาทีที่ 10,000 ×กรัมที่4◦Cใสหายและ TSP wasquantified โดยใช้ Bio-Rad โปรตีน Assay (Bio-Rad, สหรัฐอเมริกา) โปรตีนถูกเอทิลแอลกอฮอล์ด้วยความร้อนที่95◦Cเป็นเวลา 5 นาทีแล้วโหลดลง 12% (w / v) ระบบ SDS-PAGE โปรตีนที่แยกออกจากกันโดยวิธี SDS-PAGE ถูกโอนไปยังเมมเบรน nitrocellulose โดยใช้ระบบการโอน iBlotTM เจล (Invitrogen) เยื่อถูกบล็อกเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในการแก้ปัญหา [1 × TBST ค่า pH 7.4, 4% (w / v) หางแห้งนมผง] ปิดกั้น ล้างแอนติบอดีหลักได้ดำเนินการกับแอนติบอดีต่อต้านกระต่ายโพลีใจ (1: 5000) (. นากานิชิ et al, 2009) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงตามด้วยการบ่ม 1 ชั่วโมงกับการป้องกันกระต่าย IgG FcHRP Conjugate (Promega) เปื้อนได้รับการล้างครั้งที่สองใน TBST เป็นเวลา 5 นาทีในระหว่างแต่ละขั้นตอนและในตอนท้ายก่อนที่จะเพิ่มการตรวจสอบย่อย strate ซึ่งประกอบด้วยลูมินอล, iodophenol และ H2O2 (ซิกม่า) .Blots ได้สัมผัสแล้วกับฟิล์ม Amersham HyperfilmTMECL เป็นเวลา 5 นาทีแล้ว พัฒนา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อประเมินระดับ bomind ทั้งหมดในพืชกะหล่ำดอกพันธุ์รวม ( TSP ) ปริมาณโปรตีนที่สกัดได้จากใบของ WTA . thaliana ยาสูบ และดอกกะหล่ำ และ จากต้นใบกะหล่ำดอกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวโดย Snap และบดด้วยเครื่องบดรูปกรวยใน 400 ล. เย็นการสกัดโปรตีนบัฟเฟอร์ ( 60 มม. นอกจากนี้ –กรดไฮโดรคลอริก pH 8.0 , 500 mM NaCl 10 mM EDTA , 30 มม. mercaptoethanol 0.1 mM PMSF ) หลังการปั่นเหวี่ยงสำหรับ 15 นาทีที่ 10 × g 4 ◦ C , น่านถูกกู้คืนและช้อนชา wasquantified โดยใช้ไบโอโปรตีน assay ( สหรัฐอเมริกาไบแรดแรด ) โปรตีนถูกใช้โดยความร้อนที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น◦โหลดลง 12 % ( w / v ) เอนไซม์ . โปรตีน แยกถูก ถูกโอนไปยังไนโตรเซลลูโลสเมมเบรนใช้เจล iblottm ระบบการโอน ( Invitrogen ) เยื่อที่ถูกบล็อกเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในบล็อกโซลูชั่น [ 1 × tbst pH 7.4 4% ( w / v ) แห้งหาง ] ผงนม ล้างแอนติบอดีหลักแสดงกับกระต่ายใช้แอนติบอดีต่อต้านในใจ ( 1:5000 ) ( นากา et al . , 2009 ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วย 1 ชั่วโมง บ่มเพาะกับ fchrp ป้องกันกระต่าย IgG ) ( promega ) blot ถูกล้างสองครั้งใน tbst เป็นเวลา 5 นาทีระหว่างแต่ละขั้นตอนและในตอนท้ายก่อนที่จะเพิ่มการตรวจสอบซับสเตรท ซึ่งประกอบด้วย ฆ้องมอญ iodophenol H2O2 , และ ( Sigma ) blots แล้วตากที่ hyperfilmtmecl ภาพยนตร์เป็นเวลา 5 นาที และพัฒนาแล้ว