Materials and methodsBacterial stra

Materials and methods
Bacterial strains
Th e tested bacterial strains used in this study
were isolated aseptically from an Artemia culture
recovered from Tunisian hypersaline environments
(saltworks of Sfax, 34°43ʹN, 10°44ʹE; saltworks of
Sahline, 35°45ʹN, 10°42ʹE). Water samples (1 mL of
Artemia culture) were enriched for 24 h at 37 °C in
nutrient broth sea water (NBSW) (salinity 34‰, pH
7.99), smeared on a nutrient agar plate, and incubated
at 37 °C. Th e colonies that appeared were passaged on
nutrient agar plates. Gram- and catalase-positive rods
were retained. Th ese were identifi ed using standard
morphological and physiological characteristics and
the API 50 CHB and Api 20 E systems (BioMérieux,
Marcy-l’Etoile, France). Results were read using an
automated microbiological mini-API (BioMérieux).
Virulent V. alginolyticus (IFL) isolated from infected
fi sh, previously described by Ben Kahla-Nakbi et al.
(12), was used in the infectivity experiments. Bacillus
strains were preserved at −80 °C and were routinely
checked for purity during this investigation prior to
use. Th ere were 3 other reference pathogenic bacterial
strains used for the antimicrobial activity assay:
V. parahaemolyticus ATCC17802, V. alginolyticus
ATCC17749, and V. alginolyticus (IFL) (12).
Antimicrobial activity using well diff usion agar
assay (WDAA) and adherence assay
Potential probiotic strains were tested for their
antagonistic activity using the well diff usion agar
assay (WDAA) (4) against 3 target strains: V.
parahaemolyticus ATCC17802, V. alginolyticus
ATCC17749, and V. alginolyticus (IFL) (12).
Pathogenic bacterial strains were grown in 10 mL
of nutrient broth and cultured for 24 h on nutrient
agar at 30 °C. Th e colonies from pure culture were
suspended in 10 mL of physiological medium and
well mixed for 5 min, and 1 mL of this was spread
over the Mueller-Hinton agar (MHA) plates and
incubated for 30 min at 37 °C. Previously isolated
Bacillus strains were incubated in marine broth (24
h, 30 °C) and incorporated into pour plates. Wells
were cut into the agar and fi lled with 100 μL of the
marine broth isolate. Th e presence of antimicrobial
metabolites produced by the isolate inhibited
the growth of the pathogen, producing a zone of
inhibition around the well (4).
Th e adhesion ability of Bacillus strains grown in
Trypticase soy broth (TSB, Bio-Rad, France) was
determined using a semiquantitative adherence assay
on 96-well tissue culture plates (Nunc, Roskilde,
Denmark), as described previously (13,14). Briefl y,
following overnight incubation at 37 °C, the optical
density at 595 nm (OD595) of the bacteria was
measured. An overnight culture grown in TSB at
37 °C was diluted to 1:100 in TSB with 2% (w/v)
glucose. A total of 200 μL of these cell suspensions
were transferred to a U-bottomed 96-well microtiter
plate (Nunc). Each strain was tested in triplicate. Th e
plates were incubated aerobically at 37 °C for 24 h.
Th e cultures were removed, and the microtiter wells
were washed twice with phosphate-buff ered saline
(PBS) (7 mmol/L Na2HPO4, 3 mmol/L NaH2PO4,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการสายพันธุ์เชื้อแบคทีเรียTh อีทดสอบสายพันธุ์แบคทีเรียที่ใช้ในการศึกษานี้ถูกแยกจากวัฒนธรรมการ Artemia asepticallyจาก Tunisian hypersaline สภาพแวดล้อมการกู้คืน(Sfax, 34 ° 43ʹN, 10 ° 44ʹE saltworks; saltworks ของSahline, 35 ° 45ʹN, 10 ° 42ʹE) น้ำตัวอย่าง (1 mL ของวัฒนธรรม Artemia) ถูกอุดมไปใน 24 ชมที่ 37 ° C ในธาตุอาหารซุปน้ำทะเล (NBSW) (34‰ เค็ม pH7.99), ป้ายบนแผ่นธาตุอาหาร agar และ incubatedที่ 37 องศาเซลเซียส มี passaged Th อีอาณานิคมที่ปรากฏบนแผ่น agar ธาตุอาหาร กรัม - และ catalase-บวกก้านถูกรักษาไว้ ความเร็ว Th ได้ identifi ed ใช้มาตรฐานลักษณะสัณฐาน และสรีรวิทยา และระบบ API 50 CHB และ Api 20 อี (BioMérieuxMarcy-l'Etoile ฝรั่งเศส) ผลลัพธ์ถูกอ่านโดยใช้การอัตโนมัติทางจุลชีววิทยามินิ-API (BioMérieux)Virulent V. alginolyticus (IFL) แยกต่างหากจากการติดเชื้อfi sh อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Ben Kahla Nakbi et al(12), ใช้ในการทดลอง infectivity คัดสายพันธุ์เก็บรักษาไว้ที่ −80 ° C และมีเป็นประจำตรวจสอบความบริสุทธิ์ในระหว่างการตรวจสอบนี้ก่อนใช้ ครั้งโบราณมีราคาอ้างอิงอื่น ๆ 3 แบคทีเรีย pathogenicใช้สำหรับการทดสอบกิจกรรมจุลินทรีย์สายพันธุ์:V. parahaemolyticus ATCC17802, V. alginolyticusATCC17749 และ V. alginolyticus (IFL) (12)กิจกรรมจุลินทรีย์ที่ใช้เช่น diff usion agarวิเคราะห์ (WDAA) และการวิเคราะห์ต่าง ๆโปรไบโอติกส์สายพันธุ์ที่มีศักยภาพสำหรับทดสอบของพวกเขากิจกรรมต่อต้านใช้ agar usion diff ดีวิเคราะห์ (WDAA) (4) กับสายพันธุ์เป้าหมาย 3: Vparahaemolyticus ATCC17802, V. alginolyticusATCC17749 และ V. alginolyticus (IFL) (12)สายพันธุ์แบคทีเรีย pathogenic ถูกปลูกใน 10 mLธาตุอาหารซุป และอ่างสำหรับ 24 h ในสารagar ที่ 30 องศาเซลเซียส Th อีอาณานิคมจากวัฒนธรรมบริสุทธิ์ได้หยุดชั่วคราวใน 10 mL ของกลางสรีรวิทยา และผสมกันใน 5 นาที และ 1 mL นี้ถูกเผยแพร่กว่าแผ่น Mueller Hinton agar (MHA) และincubated ใน 30 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส ก่อนหน้านี้ แยกต่างหากสายพันธุ์คัดได้ incubated ในซุปทะเล (24h, 30 ° C) และเป็นแผ่นเท บ่อที่ตัดเป็น lled agar และไร้สายกับ μL 100 ของการซุปทะเลแยก Th อีอยู่ของจุลินทรีย์ผลิต โดยการแยกห้าม metabolitesการเติบโตของการศึกษา โซนของผลิตยับยั้งรอบดี (4)ความยึดติด e Th คัดสายพันธุ์ที่ปลูกในมีซุปถั่วเหลือง Trypticase (TSB, Bio Rad ฝรั่งเศส)กำหนดโดยใช้การวิเคราะห์ต่าง ๆ semiquantitativeบนแผ่นเยื่อดี 96 (Nunc, Roskildeเดนมาร์ก), ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (13,14) Briefl yบ่มต่อไปนี้ค้างคืนที่ 37 ° C การแสงความหนาแน่นที่ 595 nm (OD595) ของแบคทีเรียมีวัด วัฒนธรรมการค้างคืนใน TSB ที่ปลูก37 ° C ถูกทำให้เจือจางเพื่อ 1: 100 ใน TSB 2% (w/v)กลูโคส จำนวน 200 μL ของเซลล์บริการได้โอนย้ายไป 96 ดี microtiter ยนที่ Uแผ่น (Nunc) ต้องใช้แต่ละได้รับการทดสอบใน triplicate อี Thแผ่นมี incubated aerobically ที่ 37 ° C ใน 24 ชมอี Th ออกวัฒนธรรม และบ่อ microtiterถูกล้าง ด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตหนัง ered ครั้ง(PBS) (7 mmol/L Na2HPO4, 3 mmol/L NaH2PO4

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการสายพันธุ์แบคทีเรียTh e-ทดสอบสายพันธุ์แบคทีเรียที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ถูกแยกปลอดเชื้อจากการเพาะเลี้ยงอาร์ทีเมียหายจากสภาพแวดล้อมhypersaline ตูนิเซีย(Saltworks ของ Sfax, 34 ° 43'N 10 ° 44'E; Saltworks ของSahline, 35 ° 45'N 10 ° 42'E ) ตัวอย่างน้ำ (1 มิลลิลิตรของวัฒนธรรมอาร์ทีเมีย) ถูกผสานเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในน้ำซุปสารอาหารทะเล(NBSW) (ความเค็ม 34 ‰ค่า pH 7.99) ป้ายบนแผ่นวุ้นสารอาหารและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส อาณานิคมจ Th ที่ปรากฏถูก passaged บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ Gram- และแท่ง catalase บวกไว้ ทิศ Th เป็นเอ็ด identifi โดยใช้มาตรฐานลักษณะทางสัณฐานวิทยาและสรีรวิทยาและAPI ที่ 50 CHB และ Api 20 ระบบ E (Biomerieux, Marcy-l'Etoile ฝรั่งเศส) ผลลัพธ์ที่ได้อ่านโดยใช้จุลินทรีย์อัตโนมัติมินิ API (bioMerieux). รุนแรง V. alginolyticus (IFL) ที่ติดเชื้อที่แยกได้จากการดวลจุดโทษfi, ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยเบน Kahla-Nakbi et al. (12) ถูกนำมาใช้ในการทดลองการติดเชื้อ Bacillus สายพันธุ์ที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสและถูกประจำการตรวจสอบเพื่อความบริสุทธิ์ในระหว่างการสืบสวนคดีนี้ก่อนที่จะใช้ Th ก่อน 3 เชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคอื่น ๆ ที่อ้างอิงสายพันธุ์ที่ใช้สำหรับการทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพ: โวลต์ parahaemolyticus ATCC17802, V. alginolyticus ATCC17749 และ V. alginolyticus (IFL) (12). กิจกรรมต้านจุลชีพต่างกันโดยใช้วุ้น usion ทดสอบ (WDAA) และการทดสอบการยึดมั่นในสายพันธุ์โปรไบโอติกที่อาจเกิดขึ้นได้มีการทดสอบของพวกเขาสำหรับกิจกรรมปฏิปักษ์ใช้usion ต่างกันวุ้นทดสอบ( WDAA) (4) กับ 3 สายพันธุ์เป้าหมาย: V. parahaemolyticus ATCC17802, V. alginolyticus. ATCC17749 และ V. alginolyticus (IFL) (12) สายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคได้รับการปลูกใน 10 มิลลิลิตรของน้ำซุปและสารอาหารเพาะเลี้ยงเป็นเวลา24 ชั่วโมงในสารอาหารวุ้นวันที่ 30 ° C อาณานิคมจ Th จากเชื้อบริสุทธิ์ที่ถูกระงับใน10 มิลลิลิตรของสื่อทางสรีรวิทยาและผสมกันเป็นเวลา5 นาทีและ 1 มิลลิลิตรนี้ถูกแพร่กระจายในช่วงMueller-Hinton agar (หมา) จานและบ่มเป็นเวลา30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ก่อนหน้านี้ที่แยกสายพันธุ์ Bacillus ถูกบ่มในน้ำซุปทะเล (24 ชั่วโมง 30 ° C) และรวมอยู่ในเทแผ่น เวลส์ถูกตัดลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อและสาย lled 100 ไมโครลิตรของแยกน้ำซุปทะเล การปรากฏตัวของอี Th ของยาต้านจุลชีพสารที่ผลิตโดยแยกยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อโรค, การผลิตโซนของการยับยั้งรอบเดียว (4). จความสามารถในการยึดเกาะ Th สายพันธุ์ Bacillus ปลูกในTrypticase น้ำซุปถั่วเหลือง (TSB, Bio-Rad ฝรั่งเศส) ถูกกำหนดโดยใช้การวิเคราะห์เชิงกึ่งปริมาณการยึดมั่นใน96 หลุมจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (Nunc, กิลด์, เดนมาร์ก) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (13,14) Briefl Y, ต่อไปในชั่วข้ามคืนบ่มที่ 37 ° C, แสงความหนาแน่นที่595 นาโนเมตร (OD595) ของแบคทีเรียที่ถูกวัด วัฒนธรรมค้างคืนที่ปลูกใน TSB ที่อุณหภูมิ37 องศาเซลเซียสถูกเจือจาง 1: 100 ใน TSB มี 2% (w / v) น้ำตาลกลูโคส รวม 200 ไมโครลิตรของสารแขวนลอยเซลล์เหล่านี้ถูกโอนไปยังU-ต่ำสุด 96 หลุมไมโครแผ่น(Nunc) แต่ละสายพันธุ์ได้รับการทดสอบในเพิ่มขึ้นสามเท่า อี Th แผ่นถูกบ่มออกซิเจนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง. วัฒนธรรมจ Th ถูกถอดออกและหลุมไมโครถูกล้างครั้งที่สองที่มีฟอสเฟตหนังered น้ำเกลือ(พีบีเอส) (7 มิลลิโมล / ลิตร Na2HPO4 3 มิลลิโมล / ลิตร NaH2PO4,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ

E TH ทดสอบแบคทีเรียแบคทีเรียที่ใช้ในการศึกษาได้แยกจากอาร์ทีเมีย aseptically

หายจากตูนิเซียวัฒนธรรม hypersaline สภาพแวดล้อม
( saltworks ของป๊อกกี้ , 34 / 43 ʹ N , 10 / 44 ʹ E ; saltworks ของ
Sahline 35 ° 45 ʹ 10 ° 42 ʹ e n ) ตัวอย่างน้ำ 1 มิลลิลิตร เพาะอาร์ทีเมีย
) อุดมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37 ° C ใน nutrient broth
น้ำทะเล ( nbsw ) ( 34 ‰ความเค็ม พีเอช
799 ) , smeared บนจานวุ้นสารอาหารและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา C . th e
อาณานิคมที่ปรากฏอยู่ในแผ่น passaged
NUMB3RS . กรัม - บวกบ่งชี้แท่ง
ถูกเก็บรักษาไว้ th ESE ได้ identifi เอ็ด โดยใช้มาตรฐานทางสัณฐานวิทยาและสรีรวิทยา

และ API 50 chb และ API 20 E ระบบ ( biom é rieux
marcy-l'etoile , ฝรั่งเศส ) ผลลัพธ์ที่ได้อ่านการใช้
อัตโนมัติขนาดเล็กทางจุลชีววิทยา API ( biom และรุนแรง rieux )
V . alginolyticus ( IFL ) ที่แยกได้จากผู้ติดเชื้อ
fi sh , ก่อนหน้านี้อธิบายโดยเบน ดาหลา nakbi et al .
( 12 ) , ถูกใช้ในการติดเชื้อต่างๆ บาซิลลัส
สายพันธุ์ เก็บรักษาไว้ที่ 80 ° C และ บริษัท เวสเทิร์น ถูกตรวจตรวจสอบความบริสุทธิ์ในการสืบสวนนี้

ก่อนจะใช้ th ก่อน 3 อื่น ๆเชื้อโรคแบคทีเรีย
อ้างอิงสายพันธุ์ที่ใช้สำหรับการทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพ :
V . parahaemolyticus atcc17802 atcc17749
, V . alginolyticus , V . alginolyticus ( IFL ) และ ( 12 ) .
ฤทธิ์ต้านจุลชีพที่ใช้คือ diff usion วุ้น
assay ( wdaa ) และการทดสอบศักยภาพโปรไบโอติกสายพันธุ์
ทดสอบพันธุกรรมของพวกเขา
ใช้ดี Diff usion วุ้น
assay ( wdaa ) ( 4 ) กับสายพันธุ์ : V .
3 เป้าหมายร้อยละ atcc17802 atcc17749
, V . alginolyticus , V . alginolyticus ( IFL ) และ ( 12 ) .
เชื้อโรคแบคทีเรียเติบโตใน 10 ml
ของซุปสารอาหารและเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมงใน NUMB3RS
ที่ 30 ° C E TH อาณานิคมจากเชื้อบริสุทธิ์ถูกระงับใน 10 ml ของสรีรวิทยา

ดีปานกลาง และผสมสำหรับ 5 นาที และ 1 มิลลิลิตรนี้แพร่กระจาย
เหนือมุลเลอร์ ฮินตัน ( MHA ) แผ่นและ
บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 ° C แยก
ก่อนหน้านี้ Bacillus สายพันธุ์ เลี้ยงในน้ำซุปทะเล ( 30 ° C 24
, h ) และรวมอยู่ในเทใส่จาน บ่อ
ถูกตัดเป็นวุ้นและ Fi ฆ่า 100 μ l
ซุปทะเลแยก . การปรากฏตัวของสารต้านจุลชีพ th e

ผลิตโดยแยกยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อโรค สร้างโซนของการยับยั้งรอบดี

( 4 )th e การความสามารถของ Bacillus สายพันธุ์ที่ปลูกใน
trypticase ซุปถั่วเหลือง ( TSB ชีวภาพราด , ฝรั่งเศส ) คือ
ตั้งใจใช้บริโภคในการทดสอบบนจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
96 ดี ( ขณะนี้ , Roskilde , เดนมาร์ก ,
) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 13,14 ) ย่อ Y ,
ต่อไปนี้คืนบ่มที่ 37 ° C , Optical
ความหนาแน่นที่ 595 nm ( od595 ) ของแบคทีเรีย
วัดวัฒนธรรมที่ค้างคืนที่ปลูกใน TSB 37 ° C
เจือจาง 100 ใน TSB 2 % ( w / v )
กลูโคส รวม 200 μ L ของสารแขวนลอย
เซลล์เหล่านี้ถูกโอนไปยัง u-bottomed 96 ดีไมโคร
จาน ( ขณะนี้ ) แต่ละสายพันธุ์ถูกทดสอบทั้งสามใบ th e
แผ่นถูกบ่มที่ 37 ° C aerobically 24 H .
E TH วัฒนธรรมที่ถูกเอาออก และหลุมบ่อ
เคยล้างสองครั้งกับ Buff ฟอสเฟตรด เกลือ
( PBS ) ( 7 mmol / L na2hpo4 3 nah2po4 มิลลิโมล / ลิตร ,