Materials and MethodsSample collect

Materials and Methods
Sample collection and isolation of bacteria

10 distantly located rice fields from each of the five districts namely, Ajamgarh, Chandauli, Ghazipur, Jaunpur and Varanasi of Eastern Uttar Pradesh (UP), India, were selected for this study. In general, rice variety Mansoori and Malviya dhan-36 were cultivated in these fields. Sampling was done at flowering stage in the month of November, 2007. The rhizospheric soil samples were collected from each field by uprooting the rice plants (four plants from each corner and one from the middle of each field) followed by transferring the soil adhered to roots in sterile polythene bags. After proper mixing, 10 g soil of each field was transferred to a 250 ml Erlenmeyer flask containing 90 ml sterile distilled water and shaken (120 rpm) for 30 min. Serial dilutions (up to 10-5 ) were made and 0.1 ml aliquots were spread on to JNFb- solid agar plates (Dobereiner, 1995) which contained (in g/L); malic acid (5.0), K2HPO4 (0.6), KH2PO4 (1.8), MgSO4.7H2O (0.2), NaCl (0.1), Na2MO4.2H2O (0.002), Fe-EDTA (4 ml 1.4%) and KOH (4.5), pH was adjusted to 5.8. All the plates were incubated at 37°C in an incubator. After 4 to 5 days of incubation, distinct bacterial colonies appearing on the plates were selected and maintained for several generations in the aforementioned medium to confirm the diazotrophic nature of various isolates. Distinct morphotypes of bacteria were screened on the basis of colony color, pigment formation, elevation, shape and size. For testing the formation of a pellicle, various isolates were grown in semi-solid medium (0.15% agar-agar) without shaking.


Estimation of nitrogenase activity

Nitrogenase activity was measured by acetylene reduction assay as per the method of Stewart et al. (1967). Equal amount of inoculum from each isolate was added in 3-ml semi-solid (0.15% agar-agar w/v) JNFb– medium in a 7-ml vacutainer tube (Becton-Dickinson, Rutherford, NJ, USA) and grown for 96 h at 30°C. Acetylene was injected in each tube by a hypodermic syringe to attain 10% final concentration and the tubes were incubated at 30°C without shaking. At the desired time interval, 0.2-ml gas phase was withdrawn and the ethylene formed was analyzed in a 5700 Nucon Gas Chromatograph (Nucon Engineers Ltd., New Delhi) fitted with Porapak R column and flame ionization detector. N2 was used as the carrier gas.


Indole-3-acetic acid (IAA) production

The production of indole acetic acid (IAA) was determined as per the method of Gordon and Weber (1951) using pure IAA as standard. Briefly, 1.5 ml of culture grown in JNFb- medium supplemented with tryptophan (100 µg/ml) for 72 h was centrifuged at 12,000 rpm for 5 min and in the resulting supernatant (1 ml), 2 ml FeCl3-HClO4 reagent was added. Absorbance of pink color was measured at 530 nm after 25 min in a Milton Roy 1201 UV-Vis Spectrophotometer (Milton Roy Company, USA).


Phosphate solubilisation

Test for phosphate solubilization was made following the method of Goldstein (1986). The appearance of clearing zone around bacterial colonies after 96 h of growth at 30°C was used as indicator for positive P solubilization. Plates inoculated with heat-killed cells served as control. Quantitative estimation of P was made as per the method described by Jha and Kumar (2007).


Siderophore assay

Test for the production of siderophore was made according to the method of Neilands (1981). Accordingly, chrome azurol S (CAS) agar plates containing: 1 mM chrome azurol S, FeCl3.6H2O (1 mM final concentration) made in 10 mM HCl, and N, N-cetyl trimethyl ammonium bromide (2 mM) (CTAB) was prepared. Spot inoculation of test culture was made on CAS-agar plates and incubated at 30°C for 72 h. Yellow to orange halo zone appearing around the colonies was recorded as positive test for siderophore production.


16S rDNA amplification and sequencing

Genomic DNA was extracted employing DNEasy extraction kit (Qiagen, Germany) according to the instructions of manufacturer. 16S rDNA gene (1.5 kb) was amplified using universal primer in a final volume of 50 µl. The PCR reaction mix included; 1.5 U of Taq DNA polymerase (Bangalore Genei, India), 1 X PCR assay buffer with 1.5 mM MgCl2, 50 pmol of each forward and reverse primers (Integrated DNA Technologies, USA), 125 µM of each dNTPs (Bangalore Genei, India) and 50 ng template DNA. The sequence of primer used was 8f 5’-AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3’ and 1495r 5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’ where Y = C or T and M = A or C. Thermal cycle was set as: initial denaturation at 94°C for 3 min, 35 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 58°C and 2 min at 72°C followed by final extension at 72°C for 5 min and storage at 4°C. Partial 16S rRNA fragment of V2-V3 region (400 bp) was amplified by the primer set; Fd 5’-ACT GGC GGA CGG GTC AGT AA-3’ and rev. 5’-CGT ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’. Thermal cycle was set as: an initial denaturation at 95°C for 3 min followed by 30 cycles of 95°C for 1 min, 50°C for 1 min, 72°C for 1 min 10 s, and final extension at 72°C for 5 min.
Sequencing of 16S rDNA was done with forward primer from both the ends by the di-deoxy chain termination method in an automated DNA sequencer (ABI Prism; Model 3100, Applied Biosystems, USA). 16S rDNA sequence was compared to the GenBank database using the algorithm BLASTN program to identify the most similar 16S rDNA (Altschul et al., 1997). The most similar sequences were further aligned by CLUSTAL (version 2.0.10).Phylogenetic tree was inferred by the neighbor-joining method using MEGA version 4.0 at 1000 bootstrap (Tamura et al., 2007).


Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA)

16S rDNA (1.5 kb) amplified by PCR was purified and subjected to restriction digestion by AluI and RsaI according to the instructions of manufacturer (New England Biolabs, UK). Restriction digestion was done in a final volume of 25 µl containing 1 X restriction enzyme buffer, 0.30 µl (3.0 U) restriction enzyme and 15 µl PCR products. After mixing, samples were incubated for 6 h in a water-bath preset at 37°C. Reaction was terminated by heat inactivation of restriction enzymes at 70°C for 20 min .The samples were analyzed by agarose gel (3%) electrophoresis and monitored on gel documentation unit (BioRad Laboratories, USA).


Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

16S rDNA (200 bp) was amplified with the forward primer containing GC clamp at 5’ end (f352T: 5’- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG TGG C- 3’ and 519r: 5’-ACC GCG GCT GCT GGC AC- 3’) in 25 μl of reaction mixture containing; 1XPCR buffer, 2.5 mM MgCl2 (Bangalore Genei, India), 100 ng of the template DNA, 25.0 pmol each of the forward and reverse primers, 250 μM each of dNTPs, and 1 U of Taq DNA polymerase (Bangalore Genei, India). The touchdown PCR program was performed with thermal cycle set as; initial denaturation at 95°C for 5 min, followed by 6 cycles of 95°C for 1 min, 65°C for 1 min, and 72°C for 1 min, in which the annealing temperature was reduced by 0.5°C/cycle from the preceding cycle, and then 24 cycles of 95°C. Perpendicular DGGE was performed with “The Decode Universal Mutation Detection System” (BioRad Laboratories, USA). A uniform gradient gel of 0 to 100% denaturant was prepared which was changed several times so as to optimize suitable concentration (30 to 70% denaturant showed the best result).


Results
With a view to isolate N2-fixing bacteria, selective medium (medium devoid of inorganic combined nitrogen sources) was used which resulted in the isolation of 321 diazotrophic isolates from 50 rhizospheric soil samples of five districts of Eastern Uttar Pradesh (Table 1). How-ever, routine examination revealed that several isolates were common in each district, such isolates were excluded and finally 114 isolates exhibiting distinct morphotypes in terms of colony morphology including size, colour, elevation, mucilage formation, and harbou-ring certain plant growth promoting activities were selected. With a view to find out most probable number (MPN), serial dilution technique was employed which showed population density in the range of 3.34 × 106 to 1.33 × 107 CFU g-1 of rhizospheric soil of all the five districts.
Growth in JNFb- semi-solid medium (0.15% agar-agar) showed the formation of pellicle by majority of the isolates. The colour of pellicles varied from whitish to creamy to yellowish and marked differences in the location of pellicles were observed (1 to 2 mm below the surface of the medium in some isolates and 4 to 12 mm in others) in different isolates. Preliminary screening of plant growth promoting (PGP) characters namely, IAA and siderophore production, and P solubilization suggested the presence of one or two or all the three aforementioned characters in different isolates (Table 1).
Assay of nitrogenase activity revealed significant differences in acetylene reduction activity by all the isolates. Out of the 114 isolates, the highest rate of nitrogenase activity was noted in V1S7 (1.72 µmol C2H4 mg-1 protein h-1) followed by G1S3 (1.65 µmol C2H4 mg-1protein h-1), the lowest rate (0.23 µmol C2H4 mg-1 protein h-1) was detected in JP5S6. Test of IAA production by cultures grown in JNFb- medium supplemented with 100 µg ml-1 tryptophan showed positive result in 84 (73.68%) isolates (Table 1). Quantitative estimation of IAA showed the highest production by the isolate J2S5 (353.0 µg IAA mg-1 protein), the lowest content was noted in G4S10 (10.10 µg IAA mg-1 protein). However, none of the isolates were capable to produce IAA in the absence of tryptophan in the medium. Test of P solubilization activity showed positive result in 28 (24.56%) isolates (Table 1). Further analysis revealed that the isolate AJ 2-3 had the highest level of P solubilization activity (321.0 μg mg-1 protein) followed by AJ 1-4 (280.50 μg mg-1 protein), the lowest value (38.50 μg mg-1 prote

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ
ตัวอย่างเก็บรวบรวมและแยกแบคทีเรีย

10 ห้อง distantly ข้าวจากเขต 5 ได้แก่ Ajamgarh, Chandauli, Ghazipur, Jaunpur และพาราณสีของตะวันออกอุตตระประเทศ (ขึ้น), อินเดีย ถูกเลือกสำหรับการศึกษานี้ ทั่วไป ข้าวหลากหลาย Mansoori และในทองค์ภาทัค dhan 36 ถูกเพาะปลูกในเขตข้อมูลเหล่านี้ สุ่มตัวอย่างที่ทำในระยะดอกในเดือนพฤศจิกายน 2007 ตัวอย่างดิน rhizospheric ได้รวบรวมจากแต่ละเขตข้อมูล โดย uprooting ข้าว พืช (พืชสี่มุมแต่ละมุมและจากตรงกลางของแต่ละเขต) ตาม ด้วยการถ่ายโอนดินปฏิบัติตามรากในถุง polythene กอซ หลังจากผสมเหมาะสม ดิน 10 กรัมของแต่ละเขตข้อมูลถูกถ่ายโอนไปหนาว Erlenmeyer 250 ml ประกอบด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ 90 มล.และหวั่นไหว (120 รอบต่อนาที) สำหรับ dilutions ประจำ 30 นาที (ขึ้นอยู่กับ 10-5) ได้ทำ และ 0.1 ml aliquots ถูกแพร่กระจายไป JNFb แข็ง agar แผ่น (Dobereiner, 1995) ซึ่ง (ใน g/L); กรด malic (5.0), K2HPO4 (0.6), KH2PO4 (1.8), MgSO4.7H2O (0.2), NaCl (0.1) Na2MO4.2H2O (0.002), Fe-EDTA (4 ml 1.4%) และเกาะ (4.5), มีปรับค่า pH 5.8 แผ่นทั้งหมดถูก incubated ที่ 37° C ในการบ่มเพาะวิสาหกิจ หลังจากวันที่ 4-5 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ อาณานิคมแบคทีเรียทั้งหมดที่ปรากฏบนแผ่นถูกเลือก และรักษาสำหรับรุ่นในสื่อดังกล่าวเพื่อยืนยันลักษณะ diazotrophic ของแยกต่าง ๆ Morphotypes แตกต่างกันของแบคทีเรียได้ฉายตามโคโลนีสี ผงกำเนิด ยกระดับ รูปร่าง และขนาด สำหรับการทดสอบการก่อตัวของ pellicle แยกต่าง ๆ ได้เติบโตในสื่อกึ่งแข็ง (agar-agar 0.15%) ไม่สั่น


ประเมินกิจกรรม nitrogenase

กิจกรรม Nitrogenase ถูกวัด โดยวิเคราะห์ลดกับอะเซทิลีนตามวิธีของสจ๊วต et al. (1967) จำนวนเท่าของ inoculum จากแยกแต่ละเพิ่มใน 3 ml กึ่งแข็ง (0.15% agar-agar w/v) JNFb– ในหลอด vacutainer 7ml (สัน Becton รูเทอร์ฟอร์ด NJ สหรัฐอเมริกา) และโต h 96 ที่ 30 องศาเซลเซียส มีฉีดในแต่ละหลอดกับอะเซทิลีน โดยเข็มฉีดยาจะบรรลุความเข้มข้นสุดท้าย 10% และหลอดถูก incubated ที่ 30° C โดยไม่สั่น ในช่วงเวลาที่ต้อง 0ระยะก๊าซ 2 ml ถูกเพิกถอน และเอทิลีนที่เกิดขึ้นถูกวิเคราะห์ในการ 5700 Nucon แก๊ส Chromatograph (Nucon วิศวกร จำกัด นิวเดลี) กับ Porapak R คอลัมน์และเปลวไฟจับ ionization ใช้ N2 เป็นก๊าซผู้ขนส่ง


อินโดล-3-อะซิติก (IAA) กรดผลิต

การผลิตของอินโดลกรดอะซิติก (IAA) ที่ถูกกำหนดตามวิธีการกอร์ดอนและแบ่งแยก (1951) ใช้ IAA บริสุทธิ์เป็นมาตรฐาน สั้น ๆ 1.5 ml ของวัฒนธรรมที่เติบโตใน JNFb-สื่อเสริม ด้วยทริปโตเฟน (100 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง/มล) สำหรับ 72 h ถูก centrifuged ที่ 12000 รอบต่อนาที 5 นาที และ ใน supernatant ผลลัพธ์ (1 ml), 2 ml FeCl3 HClO4 รีเอเจนต์ถูกเพิ่ม มีที่วัด absorbance ของสีชมพู 530 nm หลังนาที 25 ในเป็นรอยมิลตัน 1201 UV-Vis เครื่องทดสอบกรดด่าง (บริษัทรอยมิลตัน สหรัฐอเมริกา)


solubilisation ฟอสเฟต

ทดสอบสำหรับฟอสเฟต solubilization ทำตามวิธีของ Goldstein (1986) ลักษณะที่ปรากฏของล้างโซนทั่วอาณานิคมแบคทีเรียหลัง h 96 เจริญเติบโตที่ 30° C ถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้สำหรับบวก P solubilization แผ่น inoculated ความร้อนฆ่าเซลล์เป็นตัวควบคุม ทำตามวิธีที่อธิบาย โดย Jha และ Kumar (2007) การประเมินเชิงปริมาณของ P.


วิเคราะห์ Siderophore

ทดสอบสำหรับการผลิตของ siderophore ทำตามวิธีของ Neilands (1981) ตาม โครเมี่ยมแผ่น agar azurol S (CAS) ประกอบด้วย: 1 mM โครเมี่ยม azurol S, FeCl36H2O (1 mM ความเข้มข้นสุดท้าย) ทำใน HCl 10 มม. และ N, N-cetyl trimethyl แอมโมเนียโบรไมด์ (2 mM) (CTAB) ที่เตรียม Inoculation จุดทดสอบวัฒนธรรมทำแผ่น CAS-agar และ incubated ที่ 30° C สำหรับ h. 72 สีเหลืองส้ม halo โซนปรากฏทั่วอาณานิคมถูกบันทึกเป็นการทดสอบในเชิงบวกสำหรับผลิต siderophore


16S rDNA ขยายและลำดับ

Genomic DNA ถูกสกัดใช้ DNEasy แยกชุด (Qiagen เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยีน 16S rDNA (1.5 kb) ถูกขยายโดยใช้รองพื้นสากลในปริมาตรสุดท้ายของ 50 µl ผสมปฏิกิริยา PCR รวม 1.5 U ของ Taq DNA พอลิเมอเรส (Genei บังกาลอร์ อินเดีย) 1 X PCR assay บัฟเฟอร์ มี MgCl2, 1.5 มม. pmol 50 ของแต่ละไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ (DNA เทคโนโลยี สหรัฐอเมริกา), 125 µM ของแต่ละ dNTPs (Genei บังกาลอร์ อินเดีย) และ 50 แม่ ng ดีเอ็นเอ ลำดับการใช้พื้น 8f 5'AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3 และ 1495r 5'-CTA CGG CTA CCT TGT มาตรวัด GA-3 ที่ Y = C หรือ T และ M = A หรือวงจรความร้อน C. ถูกตั้งค่าเป็น: denaturation เริ่มต้นที่ 94° C สำหรับ 3 นาที 35 รอบ 1 นาทีที่ 94° C 1 นาที ที่ 58° C และ 2 นาทีที่ 72° C ตาม ด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72° C สำหรับ 5 นาทีและเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส บางส่วน 16S rRNA ส่วนภาค V2 V3 (400 bp) ถูกขยาย ด้วยชุดรองพื้น Fd 5' บัญญัติ GGC GGA CGG GTC AGT AA-3 'และรายได้ 5'-CGT ATT บัญชี GCG GCT GCT GG-3' วงจรความร้อนถูกตั้งค่าเป็น: denaturation เป็นเริ่มต้นที่ 95° C สำหรับตามรอบ 30 95 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 50 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 3 นาที 72° C s 1 นาที 10 และส่วนขยายสุดท้ายที่ 72° C สำหรับ 5 นาที
ลำดับเบสของ 16S rDNA ถูกทำกับพื้นไปข้างหน้าจากปลายทั้งสอง โดยวิธีการจ้างเชน di deoxy ในมี sequencer ดีเอ็นเออัตโนมัติ (ABI ปริซึม รุ่น 3100, Biosystems ใช้ สหรัฐอเมริกา) ลำดับ 16S rDNA ถูกเปรียบเทียบกับ GenBank ฐานข้อมูลโดยใช้โปรแกรม BLASTN อัลกอริทึมเพื่อระบุสุดคล้าย 16S rDNA (Altschul et al., 1997) ลำดับที่คล้ายคลึงกันมากที่สุดถูกจัด โดย CLUSTAL (รุ่น 2.0.10) เพิ่มเติมทรี phylogenetic ถูกสรุป โดยวิธีการรวมเพื่อนบ้านใช้ร็อครุ่น 4.0 ที่ 1000 เริ่มต้นระบบ (Tamura et al., 2007)


ขยาย ribosomal ดีเอ็นเอจำกัดวิเคราะห์ (ARDRA)

16S rDNA (15 kb) ขยาย โดย PCR มีข้อจำกัดที่บริสุทธิ์ และการย่อยอาหาร โดย AluI และ RsaI ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (นิวอิงแลนด์ Biolabs, UK) จำกัดย่อยอาหารเสร็จในปริมาตรสุดท้ายของ 25 µl ประกอบด้วยบัฟเฟอร์จำกัดเอนไซม์ X 1 เอนไซม์จำกัด µl (3.0 U) 0.30 และผลิตภัณฑ์ PCR µl 15 หลังจากการผสม ตัวอย่างที่ incubated สำหรับ 6 h ในน้ำน้ำกำหนดไว้ที่ 37 องศาเซลเซียส ปฏิกิริยาถูกยกเลิก โดยยกเลิกการเรียกความร้อนเอนไซม์จำกัดที่ 70° C สำหรับ 20 นาทีตัวอย่างวิเคราะห์ โดย agarose electrophoresis เจล (3%) และตรวจสอบในหน่วยเอกสารเจล (ปฏิบัติ BioRad สหรัฐอเมริกา)


Denaturing electrophoresis เจลไล่ระดับสี (DGGE)

16S rDNA (200 bp) ถูกขยายกับพื้นไปข้างหน้าประกอบด้วยแคลมป์ GC ที่ปลาย 5' (f352T: 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC มาตรวัด GGG TGG C-3 และ 519r: 5' บัญชี GCG GCT GCT GGC AC-3) ใน μl 25 ของปฏิกิริยาผสมประกอบด้วย 1XPCR บัฟเฟอร์ 2.5 มม. MgCl2 (Genei บังกาลอร์ อินเดีย), การ 100 ng ของดีเอ็นเอต้นแบบ ไพร เมอร์ 25.0 pmol ละไปข้างหน้า และย้อนหลัง 250 μM แต่ละของ dNTPs และ 1 U Taq DNA พอลิเมอเรส (Genei บังกาลอร์ อินเดีย) โปรแกรม PCR เหรียญทำ ด้วยวงจรความร้อนตั้งเป็น denaturation เริ่มต้นที่ 95° C สำหรับ 5 นาที ตาม ด้วยรอบ 6 95 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 65° C สำหรับ 1 นาที และ 72 องศาเซลเซียสใน 1 นาที ที่อุณหภูมิหลอมถูกลดลง 0.5° C/รอบ จากรอบข้าง และ 24 แล้ววงจรของ 95 องศาเซลเซียส เส้น DGGE ที่ดำเนินการกับ "เดอะถอดรหัสสากลกลายพันธุ์ระบบตรวจจับ" (BioRad ปฏิบัติ สหรัฐอเมริกา) เจไล่ระดับสีรูป denaturant 0-100% เตรียมไว้ซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงหลายครั้งเพื่อปรับความเข้มข้นที่เหมาะสม (30-70% denaturant แสดงผลได้ดีที่สุด)


ผล
มุมมองแยก N2 แก้ไขเชื้อแบคทีเรีย เลือกสื่อ (สื่อไร้แหล่งไนโตรเจนอนินทรีย์รวม) ถูกใช้ซึ่งส่งผลให้เกิดการแยกของ 321 diazotrophic แยกจากตัวอย่างดิน rhizospheric 50 เขต 5 ของภาคตะวันออกรัฐอุตตรประเทศ (ตาราง 1) วิธีเคย ตรวจประจำเปิดเผยว่า แยกได้หลายอยู่ทั่วไปแต่ละเขต เช่นแยกถูกแยกออก และในที่สุด 114 แยกอย่างมีระดับ morphotypes แตกต่างกันในด้านสัณฐานวิทยาของโคโลนีรวมทั้งขนาด สี ยกระดับ mucilage กำเนิด และ แหวน harbou เจริญเติบโตพืชบางอย่างส่งเสริมกิจกรรมเลือก มุมมองหาเลขมากที่สุดน่าเป็น (บริษัทเอ็มพีเอ็น), เทคนิคการเจือจางประจำถูกจ้างงานซึ่งแสดงให้เห็นความหนาแน่นของประชากรในช่วง 3.34 × 106-133 × 107 CFU g-1 ของดิน rhizospheric ของทั้งหมด 5 ย่าน
เจริญเติบโตใน JNFb-semi-solid (agar-agar 0.15%) แสดงให้เห็นว่าการก่อตัวของ pellicle โดยส่วนใหญ่แยก สีของ pellicles แตกต่างจากสีขาวกับครีมจะเหลือง และทำเครื่องหมายความแตกต่างในตำแหน่งที่ตั้งของ pellicles สุภัค (1-2 มิลลิเมตรใต้ผิวปานกลางในบางแยกและ mm 4-12 ในผู้อื่น) แยกแตกต่างกัน คัดกรองเบื้องต้นส่งเสริม (PGP) อักขระได้แก่ IAA และผลิต siderophore เจริญเติบโตของพืช และ P solubilization แนะนำอยู่หนึ่ง หรือสอง หรือทั้งหมดสามดังกล่าวอักขระในการแตกแยก (ตารางที่ 1) .
วิเคราะห์กิจกรรม nitrogenase เปิดเผยความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมลดกับอะเซทิลีน โดยทั้งหมดแยก จาก 114 แยก อัตราสูงสุดของกิจกรรม nitrogenase ถูกบันทึกไว้ใน V1S7 (1.72 µmol C2H4 มิลลิกรัม 1 โปรตีน h-1) ตาม ด้วย G1S3 (165 µmol C2H4 มิลลิกรัม-1protein h-1), อัตราต่ำสุด (0.23 µmol C2H4 1 มิลลิกรัมโปรตีน h-1) พบใน JP5S6 ทดสอบของ IAA ผลิตวัฒนธรรมปลูก JNFb-สื่อเสริม ด้วย 100 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง ml 1 ทริปโตเฟนแสดงผลบวกใน 84 (73.68%) แยก (ตารางที่ 1) การประเมินเชิงปริมาณของ IAA พบสูงสุดผลิต โดยการแยก J2S5 (ไมโครกรัมเป็นเครื่อง 353.0 IAA 1 มิลลิกรัมโปรตีน), เนื้อหาสุดถูกบันทึกไว้ใน G4S10 (10.10 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง IAA 1 มิลลิกรัมโปรตีน) อย่างไรก็ตาม ไม่มีแยกได้สามารถผลิต IAA ของทริปโตเฟนในสื่อ ทดสอบกิจกรรม solubilization P พบผลบวกใน 28 (24.56%) แยก (ตารางที่ 1) วิเคราะห์เพิ่มเติมเปิดเผยว่า AJ แยก 2-3 มีกิจกรรม solubilization P (321 ระดับสูงสุด0 μg 1 มิลลิกรัมโปรตีน) ตาม ด้วย AJ 1-4 (280.50 μg 1 มิลลิกรัมโปรตีน), ค่าต่ำสุด (38.50 μg 1 มิลลิกรัมพรต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการเก็บตัวอย่างและการแยกเชื้อแบคทีเรีย

10 นำลิ่วอยู่ทุ่งนา จากแต่ละห้าอำเภอ คือ ajamgarh chandauli ghazipur , , , และภาคตะวันออก jaunpur พาราณสีอุตตร ( UP ) , อินเดีย , การวิจัยครั้งนี้ ทั่วไป และข้าวพันธุ์ mansoori malviya dhan-36 ปลูกในเขตข้อมูลเหล่านี้สุ่มตัวอย่างระยะออกดอกในเดือน พฤศจิกายน 2007 ตัวอย่างดินที่เก็บจากแต่ละเขต โดย rhizospheric ต้นข้าวข้าวพืช ( พืชที่สี่จากแต่ละมุมหนึ่งจากกลางของแต่ละเขต ) ตามด้วยการถ่ายโอนดินตามรากในถุง polythene เป็นหมัน หลังจากที่เหมาะสมการผสม10 กรัมของดินแต่ละเขตคือโอนไป 250 ml . ขวดบรรจุ 90 ml เออร์เลนเมเยอร์น้ำกลั่นปลอดเชื้อและสะเทือน ( 120 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที ซีเรียลเจือจาง ( ถึง 10-5 ) เป็น 0.1 มิลลิลิตรเฉยๆได้แพร่กระจายไป jnfb - แผ่นวุ้นแข็ง ( โดเบอร์เนอร์ , 1995 ) ซึ่งประกอบด้วย ( กรัม / ลิตร ) ; กรดมาลิก ( 5.0 ) , k2hpo4 ( 0.6 ) , kh2po4 ( 1.8 ) , mgso4.7h2o ( 0.2 ) , เกลือ ( 0.1 ) na2mo4.2h2o ( 0.002 )เหล็ก EDTA ( 4 + 1.4% ) และเกาะ ( 4.5 ) , pH ปรับดีขึ้น . จานทั้งหมดถูกบ่มที่ 37 ° C ในตู้อบ หลังจาก 5 วันของการบ่มที่แตกต่างกัน , โคโลนีแบคทีเรียที่ปรากฏบนแผ่นถูกเลือกและรักษาหลายรุ่นในระดับดังกล่าวเพื่อยืนยันลักษณะ diazotrophic ต่างๆของเชื้อที่แตกต่างกัน morphotypes ของแบคทีเรียจากบนพื้นฐานของกลุ่มสี , การก่อตัว ความสูง สี ขนาด รูปร่าง สำหรับการทดสอบการก่อตัวของเยื่อต่าง ๆ สายพันธุ์ปลูกในอาหารกึ่งแข็ง ( 0.15% วุ้น ) โดยไม่สั่น


ประมาณไนโตรจีเนส

กิจกรรมกิจกรรมไนโตรจีเนส ซึ่งการใช้อะเซทิลีนตามวิธีของสจ๊วต et al . ( 1967 )จํานวนเท่าของปริมาณที่ได้จากแต่ละแยกถูกเพิ่มเข้ามาใน 3-ml กึ่งแข็ง ( 0.15% วุ้น w / v ) jnfb –กลางใน 7-ml vacutainer หลอด ( เบคตอนดิกคินสัน Rutherford , NJ , USA ) และโต 96 H ที่ 30 องศา อะเซทิลีนถูกฉีดในแต่ละหลอด โดยใช้เข็มฉีดยาเพื่อบรรลุความเข้มข้น 10 % สุดท้าย และหลอดที่อุณหภูมิ 30 องศา C โดยไม่สั่น ตามช่วงเวลา , 0 .ระยะก๊าซ 2-ml ถูกถอนและเอทิลีนที่เกิดขึ้น วิเคราะห์ในแก๊สโครมาโตกราฟ nucon 5700 ( nucon วิศวกร Ltd . , นิวเดลี ) ติดตั้งกับเสา porapak R และเครื่องตรวจจับไอออนไนซ์เปลวไฟ 2 ใช้เป็นแก๊สตัวพา


กรดกระเพาะ ( IAA ) การผลิต

การผลิตกรดอินโดล ( IAA ) ถูกกำหนดตามวิธีการของกอร์ดอนและเวเบอร์ ( 1951 ) ใช้เพียว IAA เป็นมาตรฐาน สั้น ๆ , 1.5 ml ของวัฒนธรรมที่ปลูกใน jnfb - MS ทริปโตเฟน ( 100 µ g / ml ) 72 H คือระดับที่ 12 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที และให้นำ ( 1 มล. ) , 2 ml fecl3-hclo4 รีเอเจนต์ถูกเพิ่มเข้ามาการดูดกลืนแสงของสีชมพูถูกวัดที่ 530 nm หลังจาก 25 นาทีในมิลตันรอย 1201 UV VIS Spectrophotometer ( บริษัท ประเทศสหรัฐอเมริกามิลตันรอย ) .




ตรวจสอบฟอสเฟตฟอสเฟต solubilisation ขณะทำตามวิธีของโกลด์สตีน ( 1986 ) การปรากฏตัวของเชื้อแบคทีเรียล้างโซนรอบอาณานิคมหลัง 96 H ของการเจริญเติบโตที่ 30 ° C ที่ใช้เป็นดัชนีบวก P ขณะใส่แผ่นความร้อนฆ่าเซลล์ทำหน้าที่ควบคุม การประมาณค่าเชิงปริมาณของ P ได้ตามวิธีที่อธิบายไว้โดยผู้ และ คูมาร์ ( 2550 ) .




) ชุดทดสอบการผลิตไซเดอโรฟอร์ได้ตามวิธีการของ neilands ( 1981 ) ตาม , Chrome azurol S ( CAS ) อาหารจานที่มี : 1 มม. azurol โครเมี่ยม , FeCl3 .6h2o ( 1 มิลลิเมตรความเข้มข้นสุดท้าย ) ในนอร์มัล , 10 mm และ N , n-cetyl ไตรแอมโมเนียมโบรไมด์ ( 2 มม. ) ( ctab ) ที่เตรียมไว้ จุดเชื้อวัฒนธรรมการทดสอบทำใน CAS วุ้นแผ่น และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 72 ชั่วโมง สีเหลืองส้ม ปรากฏรอบ ๆรัศมีเขตอาณานิคมถูกบันทึกไว้เป็นทดสอบบวกสำหรับผลิตไซเดอโรฟอร์




( และการหาลำดับเบส 16S rDNAจีโนมดีเอ็นเอใช้ชุดสกัด dneasy ( QIAGEN , เยอรมนี ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยีน 16S rDNA ( 1.5 กิโล ) คือการขยายการใช้สากลรองพื้นในปริมาณ 50 ลิตร ซึ่งสุดท้ายµปฏิกิริยาผสมรวม ; 1.5 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( บังกาลอร์ genei อินเดีย ) , 1 x PCR assay บัฟเฟอร์กับชุด 1.5 มม.50 pmol แต่ละไปข้างหน้าและย้อนกลับ ( เทคโนโลยีดีเอ็นเอไพรเมอร์แบบอเมริกา ) , 125 µ M ของแต่ละ dntps ( บังกาลอร์ genei อินเดีย ) และ 50 ของแม่แบบดีเอ็นเอ ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้ 8f 5 ' - aga gtt TGA ติม tgg CTC ag-3 ' และ 1495r 5 ' - CTA CGG CTA CCT TGT TAC ga-3 ' Y = C หรือ T และ M = A หรือ C ความร้อนวงจรถูกตั้งค่าเป็นเริ่มต้นที่ 94 ° C : ( เวลา 3 นาที 35 รอบใน 1 นาที ที่ 94 ° C1 นาทีที่ 58 องศา C และ 2 นาทีที่ 72 ° C ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาทีและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา ส่วนเบสของเบส 16S rRNA v2-v3 ภูมิภาค ( 400 BP ) ถูกขยายโดยไพรเมอร์ชุด FD 5 ' - ทำ ggc ก๊ะ CGG GTC agt aa-3 ' และบาทหลวง 5 ' - CGT ATT บัญชี gcg GCT GCT gg-3 ' วงจรความร้อนถูกตั้งค่าเป็นเริ่มต้นที่ 95 องศา C ( 3 นาทีตามด้วย 30 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 1 นาที , 50 ° C เป็นเวลา 1 นาที72 ° C เป็นเวลา 1 นาที 10 วินาที และเบอร์สุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที
ลำดับของ 16S rDNA เสร็จแล้วส่งต่อรองพื้นจากปลายทั้งสอง โดย ดิ ดีอ ซีโซ่สิ้นสุดวิธี DNA sequencer แบบอัตโนมัติ ( ABI ปริซึม ; รุ่น 3100 ประยุกต์ Biosystems สหรัฐอเมริกา ) ลำดับ 16S rDNA ขนาดเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลโดยใช้โปรแกรมขั้นตอนวิธี blastn ระบุ 16S rDNA คล้ายกันมากที่สุด ( แอลเชิล et al . ,1997 ) ลำดับต่อไปที่คล้ายกันมากที่สุด คือ ชิด โดย clustal ( รุ่น 2.0.10 ) phylogenetic ต้นไม้ถูกสรุปโดยเพื่อนบ้านร่วมโดยใช้ร็อคเวอร์ชั่น 4.0 ที่ 1000 บู ( ทามูระ et al . , 2007 )


การวิเคราะห์ดีเอ็นเอของไรโบโซมจำกัด ( ardra )

16S rDNA ( 15 KB ) โดยขยายเชื้อบริสุทธิ์ และต้องจำกัดอาหารและจะ rsai ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ( อังกฤษ biolabs , UK ) การย่อยอาหารจำกัด ได้ปริมาณสุดท้าย 25 µ L มี 1 x เอนไซม์ บัฟเฟอร์ , 0.30 µ L ( 3.0 U ) เอนไซม์จำกัด 15 µผมโดยผลิตภัณฑ์ หลังจากการผสมตัวอย่างที่บ่มเป็นเวลา 6 ชั่วโมง อาบ น้ำที่ตั้งไว้ที่ 37 องศา ถูกยกเลิกโดยการยับยั้งปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ความร้อน 70 องศา C เป็นเวลา 20 นาที ตัวอย่าง โดยใช้เจล ( 3% ) ในเอกสารและการตรวจสอบหน่วยเอนไซม์เจล ( ห้องปฏิบัติการ , biorad USA )


เจลี่ ไล่ระดับ ( การทดลอง )

16S rDNA ( 200 BP ) เป็นเบสกับรองพื้นที่มี GC หนีบที่ปลายไปข้างหน้า 5 ' ( f352t : 5 ' - CGC ccg ccg CGC gcg gcg ggc GGG gcg GGG GCA CGG GGG แก๊กทีซีซีแทค GGG tgg C - 3 ' และ 5 ' 519r - บัญชี gcg GCT GCT ggc AC - 3 ' ) ใน 25 μ L ของปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย ; 1xpcr บัฟเฟอร์ 2.5 มม. ชุด ( บังกาลอร์ genei อินเดีย ) , 100 กรัมของแม่แบบดีเอ็นเอ 25.0 pmol แต่ละไปข้างหน้าและย้อนกลับ ไพรเมอร์250 μ M แต่ละ dntps และ 1 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( บังกาลอร์ genei , อินเดีย ) Touchdown PCR คือการโปรแกรมวงจรความร้อนชุด ; เริ่มต้นที่ 95 องศา C ( เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 6 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 1 นาที 65 ° C เป็นเวลา 1 นาที , และ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที ซึ่งอุณหภูมิการอบอ่อนลดลง 0.5 ° C / วงจรจาก ปรับรอบแล้ว 24 รอบ 95 องศาการทดลองกระทำตั้งฉากกับ " ถอดรหัสของระบบตรวจจับสากล " ( ห้องปฏิบัติการ , biorad USA ) เครื่องแบบเดียนเจล 0 ถึง 100% ทำให้ผิดธรรมชาติที่เตรียมไว้ซึ่งถูกเปลี่ยนมือหลายครั้งเพื่อปรับความเข้มข้น ( 30 ถึง 70% ทำให้ผิดธรรมชาติ แสดงผลที่ดีที่สุด ) .



กับมุมมองการแยกแบคทีเรียตรึงไนโตรเจน ,เลือกขนาดกลาง ( medium ไร้สารอนินทรีย์ไนโตรเจนที่ใช้รวมกัน ) ซึ่งมีผลในการแยกของ 321 diazotrophic ที่แยกได้จากตัวอย่างดิน 50 rhizospheric 5 เขตตะวันออกของรัฐอุตตรประเทศ ( ตารางที่ 1 ) วิธีเคย ตรวจตามปกติ พบว่า หลายสายพันธุ์เป็นทั่วไปในแต่ละเขตเช่นไอโซเลทและในที่สุด 114 ไอโซเลทโดยรวม morphotypes แตกต่างกันในแง่ของลักษณะของโคโลนีรวมทั้งขนาด , สี , ความสูง , การสร้างเมือก และส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืช harbou แหวนบางกิจกรรมที่เลือก มีมุมมองที่ดูน่าจะเป็นไปได้มากที่สุด หมายเลข ( MPN ) เทคนิคการใช้อนุกรมซึ่งมีประชากรหนาแน่นในช่วง 3.34 × 106 ต่อ 133 × 107 CFU G-1 ดิน rhizospheric ทั้งหมด 5 เขต
การเจริญเติบโตใน jnfb - กึ่งแข็งปานกลาง ( 0.15% วุ้น ) พบการก่อตัวของเยื่อโดยส่วนใหญ่ของเชื้อสี pellicles เปลี่ยนจากสีขาวเพื่อครีมความแตกต่างสีเหลืองและเครื่องหมายตำแหน่งของ pellicles พบ ( 1 - 2 มม. ด้านล่างพื้นผิวของตัวกลางในบางไอโซเลทและ 4 ถึง 12 มม. อื่นๆ ) ต่างเชื้อ เบื้องต้นการส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืช ( PGP ) อักขระคือ ผลิตไซเดอโรฟอร์และ IAA ,และ P ขณะแนะนำการปรากฏตัวของหนึ่งหรือสองหรือทั้งสามดังกล่าวอักขระต่างสายพันธุ์ ( ตารางที่ 1 ) .
( กิจกรรมไนโตรจีเนส พบว่ามีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมการลดเครดิตทั้งหมดเกิดจากเชื้อ ออกจาก 114 ไอโซเลท , อัตราสูงสุดของกิจกรรมไนโตรจีเนส ถูกระบุไว้ใน v1s7 ( 1.72 µโมล c2h4 mg-1 โปรตีนส่วน ) รองลงมา คือ g1s3 ( 165 µโมล c2h4 mg-1protein ส่วน ) , อัตราต่ำสุด ( 0.23 µโมล c2h4 mg-1 โปรตีนส่วน ) ที่ตรวจพบใน jp5s6 . ทดสอบการผลิต IAA โดยวัฒนธรรมที่ปลูกใน jnfb - เติม 100 กรัม พบผลที่แน่นอนµทริปโตเฟนใน 84 ( 73.68 % ) สายพันธุ์ ( ตารางที่ 1 ) การประมาณค่าเชิงปริมาณของ IAA พบการผลิตสูงสุด โดยแยก j2s5 ( 353.0 IAA mg-1 µกรัมโปรตีน )เนื้อหาน้อยคือ ที่ระบุไว้ใน g4s10 ( 10.10 µ IAA mg-1 กรัมโปรตีน ) แต่ไม่มีของไอโซเลทสามารถผลิต IAA ในการขาดงานของทริปโตเฟนในระดับปานกลาง การทดสอบของ P ขณะกิจกรรมพบผลบวกใน 28 ไอโซเลท ( 24.56 % ) ( ตารางที่ 1 ) พบว่าแยก AJ 2-3 ได้ระดับ P ขณะกิจกรรม ( 321 .0 μกรัมโปรตีน mg-1 ) ตามด้วย AJ 1-4 ( 280.50 μกรัมโปรตีน mg-1 ) ค่าต่ำสุด ( 38.50 μกรัม mg-1 ป้องก