We selected candidate for experimen

We selected candidate for experimental test using the principle that mutant should bind the receptor roughly as well as wild type for the better-binding 〖His〗^° tautomer (corresponding to cell-surface conditions) and substantially more poorly than wild type for 〖His〗^+ (corresponding to endosomal condition). Once the difference between binding 〖His〗^° and 〖His〗^+ is more than a few kcal/mol , there is no adventage to making it larger because it would be greater than the cost of deprotonating 〖His〗^+ in the
unbound state and binding as 〖His〗^° . Using these guidelines, D110H and D113H mutant were made and purified for experimental characterization.
Experimental receptor-binding properties of wild type and mutants. Because there are no native
histindine residues in wild-type GCSF at the binding interface of interest, the wild type serves as an appropriate control in that it should show minimal sensitivity to binding affinity at endosomal pH relative to extracellular pH. To test whether our biochemical property targets were met, we carried out
equilibrium binding experiment for wild type and each of the Asp → His mtant at pH7.4 and pH5.5 (Table 1 and Fig. 1D-F). Both surface plasmon resonance and cell experiments demonstrate that there is no substantial difference in binding affinity between the mutant and wild-type ligand at pH7.4,
consistent with our molecular modeling perdictions. At the same time, the cell experiment demonstrste
that the histidine mutants exhibit a substantial decrease in binding affinity at pH5.5 relative to pH7.4
whereas wild-type binding remain largely insensitive to pH; this is also consistent with our computational modeling predictions. Because the mutants bind to GCSFR with substantially lower affinity than wild type under conditions representative of the endosomal pompartments, we could then predict a cell-level result of increased ligand lifetime in the medium for the histidine analogs relative to native GCSF due to enhanced recycling.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราเลือกเพื่อทดสอบทดลองโดยใช้หลักว่า mutant ควรผูกตัวรับประมาณเป็นชนิดป่าใน 〖His〗 ผลผูกพันดี
tautomer ° (ที่สอดคล้องกับสภาพพื้นผิวเซลล์) และงานที่มากขึ้นกว่าชนิดป่าใน 〖His〗
(ที่สอดคล้องกับเงื่อนไข endosomal) เมื่อความแตกต่างระหว่างผูก 〖His〗
°และ 〖His〗
มีมากกว่าไม่กี่กิโลแคลอรี่/โมล มี adventage ไม่ทำมันใหญ่ เพราะมันจะมากกว่าต้นทุนของ deprotonating 〖His〗
ใน
ถูกรัฐและรวมเป็น 〖His〗
° ใช้แนวทางเหล่านี้ mutant D110H และ D113H ได้ทำ และบริสุทธิ์สำหรับทดลองจำแนก
ทดลองตัวรับผูกคุณสมบัติของชนิดป่าและสายพันธุ์ เพราะมีพื้นไม่
histindine ตกในป่าชนิด GCSF ที่อินเทอร์เฟซรวมน่าสนใจ ชนิดป่าทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมที่เหมาะสมที่มันควรแสดงความไวน้อยที่สุดเพื่อเชื่อมความสัมพันธ์ที่ pH endosomal เทียบ extracellular pH ด้วย เพื่อทดสอบว่าตรงตามเป้าหมายคุณสมบัติชีวเคมีของเรา เราทำ
ทดลองชนิดของป่าและของ Asp ผูกสมดุล→ mtant ของเขาที่ pH74 และ pH5.5 (ตารางที่ 1 และ Fig. 1D-F) ทั้งพื้นผิวการสั่นพ้อง plasmon และเซลล์ทดลองแสดงให้เห็นว่า มีความแตกต่างไม่พบในการผูกความสัมพันธ์ระหว่าง mutant และลิแกนด์ชนิดป่าที่ pH7.4,
สอดคล้องกับโมเดลโมเลกุล perdictions ของเรา ในเวลาเดียวกัน เซลล์ทดลอง demonstrste
ที่สายพันธุ์ histidine แสดงลดลงพบผูกความสัมพันธ์ที่ pH55 สัมพันธ์ pH7.4
ขณะผูกชนิดป่ายังคงซ้อนส่วนใหญ่ให้ค่า pH นี้ก็สอดคล้องกับการคาดคะเนการคำนวณโมเดลของเรา เนื่องจากสายพันธุ์ผูกกับ GCSFR มีความเกี่ยวข้องมากต่ำกว่าป่าชนิดภายใต้เงื่อนไขตัวแทนของ endosomal pompartments แล้วเราสามารถทำนายผลระดับเซลล์ของลิแกนด์เพิ่มชีวิตในสื่อสำหรับ analogs histidine สัมพันธ์ GCSF พื้นเมืองเนื่องจากการรีไซเคิลเพิ่มขึ้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราเลือกผู้สมัครสำหรับการทดสอบการทดลองโดยใช้หลักการที่ว่ากลายพันธุ์ควรผูกรับประมาณรวมทั้งชนิดป่าที่ดีขึ้นปก〖เขา〗 ^ ° tautomer (ตรงกับสภาพของเซลล์ผิว) และยิ่งไม่ดีกว่าชนิดป่า〖ของเขา 〗 ^ + (ตรงกับสภาพ endosomal) เมื่อความแตกต่างระหว่างผลผูกพัน〖เขา〗 ^ °และ〖เขา〗 ^ + เป็นมากกว่า kcal / mol ไม่กี่ไม่มีดีต่อทำให้มันใหญ่เพราะมันจะสูงกว่าต้นทุนของ deprotonating 〖เขา〗 ^ + ใน
รัฐไม่ได้ผูกไว้และมีผลผูกพันเป็น〖เขา〗 ^ ° โดยใช้แนวทางเหล่านี้ D110H และ D113H กลายพันธุ์ที่ถูกสร้างขึ้นและทำให้บริสุทธิ์สำหรับลักษณะการทดลอง
คุณสมบัติรับผูกพันทดลองของประเภทป่าและการกลายพันธุ์ เพราะไม่มีพื้นเมือง
ตกค้าง histindine ในป่าชนิด GCSF ที่อินเตอร์เฟซที่มีผลผูกพันที่น่าสนใจชนิดป่าทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมที่เหมาะสมในการที่จะควรจะแสดงความไวน้อยที่สุดเพื่อความใกล้ชิดผูกพันที่ pH endosomal เทียบกับค่าความเป็นกรด extracellular เพื่อทดสอบว่าเป้าหมายสถานที่ให้บริการทางชีวเคมีของเราได้พบเราดำเนินการ
สมดุลการทดลองมีผลผูกพันสำหรับประเภทป่าและแต่ละงูเห่า→ mtant ของเขาที่ pH7.4 ด้วย pH5.5 (ตารางที่ 1 และรูปที่. 1D-F) ทั้งเสียงและเซลล์ผิว PLASMON ทดลองแสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างมากในความใกล้ชิดผูกพันระหว่างมนุษย์กลายพันธุ์และสัตว์ป่าชนิดแกนด์ที่ pH7.4,
สอดคล้องกับ perdictions โมเลกุลแบบของเรา ในเวลาเดียวกันการทดลองเซลล์ demonstrste
ที่กลายพันธุ์ฮิสติดีนแสดงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในความใกล้ชิดผูกพันที่ pH5.5 เทียบกับ pH7.4
ขณะที่ป่าประเภทที่มีผลผูกพันยังคงไม่มีความรู้สึกส่วนใหญ่จะมีค่า pH; นี้ยังสอดคล้องกับการคาดการณ์การสร้างแบบจำลองการคำนวณของเรา เพราะสายพันธุ์ที่ผูกกับ GCSFR มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญต่ำกว่าชนิดป่าภายใต้เงื่อนไขที่เป็นตัวแทนของ pompartments endosomal เราก็สามารถทำนายผลเซลล์ระดับของชีวิตแกนด์ที่เพิ่มขึ้นในสื่อกลางในการ analogs ฮิสติดีนเมื่อเทียบกับ GCSF พื้นเมืองอันเนื่องมาจากการรีไซเคิลเพิ่มขึ้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราเลือกผู้สมัครให้ทดลอง ทดสอบโดยใช้หลักการที่กลายพันธุ์มัดตัวรับ ประมาณเป็นป่าประเภท ดีกว่าผูก〖ของเขา〗
/ เทาโทเมอร์ ( สอดคล้องกับสภาพพื้นผิวเซลล์ ) และมากเพิ่มเติมไม่ดีกว่าชนิดป่า〖ของเขา〗
( สอดคล้องกับเงื่อนไข endosomal ) เมื่อความแตกต่างระหว่างการจับ〖ของเขา〗โดย〖ของเขา〗

และเป็นมากกว่าไม่กี่ kcal / mol , มีข้อดีที่จะทำให้มันใหญ่ เพราะมันจะมากกว่าต้นทุนของ deprotonating 〖ของเขา〗

หลุดในรัฐ และผูกเป็น〖ของเขา〗
/ . การใช้แนวทางเหล่านี้ d110h d113h กลายพันธุ์และทำบริสุทธิ์เพื่อทดลองศึกษา .
ทดลองตัวรับผูกคุณสมบัติของชนิดป่าและกลายพันธุ์ เพราะไม่มีพื้นเมือง
histindine ตกค้างในผลิต gcsf ที่อินเตอร์เฟซผูกพันของดอกเบี้ย ประเภทป่าเป็นการควบคุมที่เหมาะสมก็ควรแสดงความไวน้อยที่สุดที่จะผูกความสัมพันธ์ที่ endosomal Ph ญาติและ pH เพื่อทดสอบว่าเป้าหมายของเราคุณสมบัติทางชีวเคมีที่ได้พบ เราทำการทดลองเชื่อมป่า
สมดุลชนิดและแต่ละของ ASP mtant → keyboard - key - name ในการสกัด .4 ph5.5 ( ตารางที่ 1 และรูปที่ 1d-f ) ทั้งพื้นผิวและเสียงสะท้อน PLASMON เซลล์ การทดลองแสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมากในความใกล้ชิดผูกพันระหว่างพันธุ์ของลิแกนด์ที่ ph7.4
perdictions , สอดคล้องกับแบบจำลองโมเลกุลของเรา ใน เวลาเดียวกัน เซลล์ทดลอง demonstrste
ว่าฮิสติดีนกลายพันธุ์แสดงลดลงอย่างมากในการจับจำเพาะที่ 5 .5 เมื่อเทียบกับ ph7.4
ในขณะที่ส่วนใหญ่ของผูกพันยังคงไม่รู้สึกถึงพีเอช ; นี้ยังสอดคล้องกับการคาดการณ์ของแบบจำลองคอมพิวเตอร์ของเรา เพราะพันธ์ผูก gcsfr ความสัมพันธ์มากกว่าประเภทป่า ภายใต้เงื่อนไขของตัวแทน endosomal pompartments ,เราสามารถทำนายระดับเซลล์ผลลัพธ์ของระบบชีวิตเพิ่มขึ้นในระดับปานกลางสำหรับีนซึ่งสัมพันธ์กับ gcsf พื้นเมืองเนื่องจากการเพิ่มขึ้น