Micelle PCR amplificationThe micPCR

Micelle PCR amplification
The micPCR consisted of two PCR rounds of micPCR amplification. This was necessary, because micPCR only yields a limited number of amplicons per template molecule, which is a consequence of the limited reaction volume contained in a single micelle. We estimated that after a micPCR only 1E + 04 amplicon molecules were formed in a single micelle starting with a single genomic DNA fragment carrying a 16S rRNA gene copy. This low number of amplicon molecules is not sufficient for NGS of samples containing low amounts of bacterial DNA, such as nose swabs. However, using a second round of micPCR allowed us to increase the number of amplicon molecules for NGS, as well as allowing the addition of Molecular Identification sequences (MID) and Roche 454 specific A and B sequences. In the first step, micPCR was performed using modified 357F and 926R primers that amplified the V3–V5 regions of 16S rRNA genes and which incorporated universal sequence tails at their 5′ ends. In the second step, a micPCR was again used, but to amplify micPCR amplicons obtained from the first step micPCR. The second step micPCR utilized primers containing complementary sequences to the universal tails and included additional 454 sequencing-specific nucleotides, and specimen-specific MIDs. For both amplification steps, water-in-oil emulsions were prepared using the Micellula DNA Emulsion Kit (Roboklon). The oil phase comprised ~73% Emulsion component 1, ~7% Emulsion component 2, and 20% Emulsion component 3, which was mixed for 5 minutes in a cold room as described by the manufacturer. The aqueous phase was a PCR reaction mix comprising 0.01 mg/ml BSA, 2 μM of each primer, 200 μM dNTP mix, and 2.5 U Taq polymerase with 1× PCR Buffer B (EURx). Template DNA and water were added to give a final volume of 50 μL for each sample. Water-in-oil emulsions were prepared by adding 50 μL of pre-cooled PCR reaction mix to 300 μL of pre-cooled oil phase. The first round of micPCR was carried out using the following cycling conditions: 95 °C for 2 minutes followed by 25 cycles of PCR, with cycling conditions of 15 seconds at 95 °C, 30 seconds at 55 °C, and 60 seconds at 72 °C, and a final extension at 72 °C for 7 minutes. Emulsions were broken by the addition of 1 mL 2-butanol, and 400 μL of Orange-DX buffer (Roboklon) was added to the broken emulsion solution. This solution was centrifuged for phase separation. For the purification of DNA within the water phase, NucliSENS EasyMAG reagents (Biomérieux) were used according to the manufacturer’s instructions. To normalize DNA concentration and reduce the number of template molecules for the second round of amplification, the purified DNA was diluted 1E + 04 or 1E + 02-fold for high and low inputs, respectively, during the first micPCR. The second round of micPCR was performed under the following conditions: initial denaturation at 95 °C for 2 minutes followed by 25 cycles of PCR, with cycling conditions of 15 seconds at 95 °C, 30 seconds at 50 °C and 60 seconds at 72 °C. During the first 10 cycles of PCR, the annealing temperature was increased by 0.5 °C per cycle to an annealing temperature of 55 °C. The PCR was stopped after a final extension at 72 °C for 7 minutes. Again, emulsions were broken using 2-butanol, and DNA was purified using NucliSENS EasyMAG reagents (Biomérieux).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย micelle PCRThe micPCR consisted of two PCR rounds of micPCR amplification. This was necessary, because micPCR only yields a limited number of amplicons per template molecule, which is a consequence of the limited reaction volume contained in a single micelle. We estimated that after a micPCR only 1E + 04 amplicon molecules were formed in a single micelle starting with a single genomic DNA fragment carrying a 16S rRNA gene copy. This low number of amplicon molecules is not sufficient for NGS of samples containing low amounts of bacterial DNA, such as nose swabs. However, using a second round of micPCR allowed us to increase the number of amplicon molecules for NGS, as well as allowing the addition of Molecular Identification sequences (MID) and Roche 454 specific A and B sequences. In the first step, micPCR was performed using modified 357F and 926R primers that amplified the V3–V5 regions of 16S rRNA genes and which incorporated universal sequence tails at their 5′ ends. In the second step, a micPCR was again used, but to amplify micPCR amplicons obtained from the first step micPCR. The second step micPCR utilized primers containing complementary sequences to the universal tails and included additional 454 sequencing-specific nucleotides, and specimen-specific MIDs. For both amplification steps, water-in-oil emulsions were prepared using the Micellula DNA Emulsion Kit (Roboklon). The oil phase comprised ~73% Emulsion component 1, ~7% Emulsion component 2, and 20% Emulsion component 3, which was mixed for 5 minutes in a cold room as described by the manufacturer. The aqueous phase was a PCR reaction mix comprising 0.01 mg/ml BSA, 2 μM of each primer, 200 μM dNTP mix, and 2.5 U Taq polymerase with 1× PCR Buffer B (EURx). Template DNA and water were added to give a final volume of 50 μL for each sample. Water-in-oil emulsions were prepared by adding 50 μL of pre-cooled PCR reaction mix to 300 μL of pre-cooled oil phase. The first round of micPCR was carried out using the following cycling conditions: 95 °C for 2 minutes followed by 25 cycles of PCR, with cycling conditions of 15 seconds at 95 °C, 30 seconds at 55 °C, and 60 seconds at 72 °C, and a final extension at 72 °C for 7 minutes. Emulsions were broken by the addition of 1 mL 2-butanol, and 400 μL of Orange-DX buffer (Roboklon) was added to the broken emulsion solution. This solution was centrifuged for phase separation. For the purification of DNA within the water phase, NucliSENS EasyMAG reagents (Biomérieux) were used according to the manufacturer’s instructions. To normalize DNA concentration and reduce the number of template molecules for the second round of amplification, the purified DNA was diluted 1E + 04 or 1E + 02-fold for high and low inputs, respectively, during the first micPCR. The second round of micPCR was performed under the following conditions: initial denaturation at 95 °C for 2 minutes followed by 25 cycles of PCR, with cycling conditions of 15 seconds at 95 °C, 30 seconds at 50 °C and 60 seconds at 72 °C. During the first 10 cycles of PCR, the annealing temperature was increased by 0.5 °C per cycle to an annealing temperature of 55 °C. The PCR was stopped after a final extension at 72 °C for 7 minutes. Again, emulsions were broken using 2-butanol, and DNA was purified using NucliSENS EasyMAG reagents (Biomérieux).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไมเซลล์ขยาย PCR
micPCR ประกอบด้วยสองรอบ PCR ของการขยาย micPCR นี้เป็นสิ่งจำเป็นเพราะ micPCR อัตราผลตอบแทนเพียงจำนวน จำกัด ของ amplicons ต่อโมเลกุลแม่แบบซึ่งเป็นผลมาจากปริมาณการเกิดปฏิกิริยา จำกัด ที่มีอยู่ในไมเซลล์เดียว เราคาดว่าหลังจาก micPCR เพียง 1E + 04 โมเลกุล amplicon กำลังก่อตัวขึ้นในไมเซลล์เดียวที่เริ่มต้นด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอเดียวแบก 16S rRNA สำเนายีน นี้จำนวนน้อยของโมเลกุล amplicon ไม่เพียงพอสำหรับ NGS ของกลุ่มตัวอย่างที่มีจำนวนต่ำของดีเอ็นเอของแบคทีเรียเช่น swabs จมูก อย่างไรก็ตามการใช้รอบที่สองของ micPCR ให้เราสามารถเพิ่มจำนวนของโมเลกุล amplicon สำหรับ NGS, รวมทั้งช่วยให้การเพิ่มของลำดับโมเลกุลประจำตัวประชาชน (MID) และโรช 454 เฉพาะ A และ B ลำดับ ในขั้นตอนแรก micPCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้การปรับเปลี่ยน 357F และ 926R ไพรเมอร์ที่ขยายภูมิภาค V3-V5 ของยีน 16S rRNA และหางซึ่งเป็น บริษัท สากลลำดับที่ 5 'ปลาย ในขั้นตอนที่สองเป็น micPCR ถูกนำมาใช้อีกครั้ง แต่จะขยาย amplicons micPCR ที่ได้จากขั้นตอนแรก micPCR ขั้นตอนที่สอง micPCR ใช้ไพรเมอร์ที่มีลำดับประกอบกับหางสากลและเพิ่มเติมรวม 454 นิวคลีโอลำดับที่เฉพาะเจาะจงและตัวอย่างเฉพาะ MIDs ทั้งขั้นตอนการขยายอิมัลชันน้ำในน้ำมันที่ได้จัดทำขึ้นโดยใช้ดีเอ็นเอ Micellula อิมัลชั่ Kit (Roboklon) ขั้นตอนประกอบด้วยน้ำมัน ~ 73% ส่วนประกอบอิมัลชั่ 1 ~ 7% ส่วนประกอบอิมัลชั่ 2 และ 20% ส่วนประกอบอิมัลชั่ 3 ซึ่งได้รับการผสมเป็นเวลา 5 นาทีในห้องเย็นตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต ในช่วงน้ำเป็นปฏิกิริยาผสม PCR ประกอบ 0.01 mg / ml บีเอสเอ 2 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์ 200 ไมครอนผสม dNTP และ 2.5 U โพลิเมอร์ Taq 1 × PCR บัฟเฟอร์ B (EURx) ดีเอ็นเอแม่แบบและน้ำที่ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้มีปริมาณสุดท้ายของ 50 ไมโครลิตรสำหรับแต่ละตัวอย่าง อีมัลชั่น้ำในน้ำมันที่ได้จัดทำขึ้นโดยการเพิ่ม 50 ไมโครลิตรของการเกิดปฏิกิริยา PCR ก่อนเย็นผสม 300 ไมโครลิตรเฟสน้ำมันก่อนการระบายความร้อน รอบแรกของการ micPCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้เงื่อนไขการขี่จักรยานต่อไปนี้: 95 ° C เป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 25 รอบของ PCR กับเงื่อนไขการขี่จักรยานของ 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 60 วินาทีที่ 72 องศาเซลเซียสและนามสกุลสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที อีมัลชั่ถูกทำลายโดยการเติม 1 มิลลิลิตร 2 บิวทานอและ 400 ไมโครลิตรของ buffer ส้ม DX (Roboklon) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อแก้ปัญหาอิมัลชันหัก วิธีการแก้ปัญหานี้ได้รับการหมุนเหวี่ยงเพื่อแยกเฟส สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่อยู่ในระยะที่น้ำ NucliSENS น้ำยา EasyMAG (bioMerieux) ถูกนำมาใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ที่จะปรับความเข้มข้นของดีเอ็นเอและลดจำนวนของโมเลกุลแม่แบบสำหรับรอบที่สองของการขยายดีเอ็นเอบริสุทธิ์ถูกเจือจาง 1E + 04 หรือ 1E + 02 เท่าสำหรับปัจจัยการผลิตที่สูงและต่ำตามลำดับในช่วงแรก micPCR รอบที่สองของ micPCR ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้: denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 25 รอบของ PCR กับเงื่อนไขการขี่จักรยานของ 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 50 องศาเซลเซียสและ 60 วินาทีที่ 72 ° C ในช่วงแรก 10 รอบของ PCR อุณหภูมิการหลอมที่เพิ่มขึ้น 0.5 องศาเซลเซียสต่อวงจรกับอุณหภูมิการอบ 55 องศาเซลเซียส PCR ก็หยุดหลังจากที่ขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที อีกครั้งอิมัลชันถูกทำลายโดยใช้ 2 บิวทานอและดีเอ็นเอบริสุทธิ์โดยใช้น้ำยา NucliSENS EasyMAG (bioMerieux)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

มิเซล PCR (
micpcr ประกอบด้วย 2 โดยรอบ micpcr ขยาย . นี้เป็นเพราะ micpcr ผลผลิตเท่านั้นจำนวนจำกัด amplicons ต่อโมเลกุลแม่แบบ ซึ่งเป็นผลของการจำกัดปริมาณที่มีอยู่ในไมเซลล์เดียวเราประเมินว่า หลังจาก micpcr เพียง 1e    04 และโมเลกุลขึ้นในไมเซลล์เดียวที่เริ่มต้นด้วยเดียวจีโนมดีเอ็นเอแบกเบส 16S rRNA ยีนคัดลอก จำนวนน้อยและไม่เพียงพอสำหรับภาพหลุดของโมเลกุลดีเอ็นเอของแบคทีเรียตัวอย่างที่มีปริมาณน้อย เช่น จากจมูก อย่างไรก็ตามใช้เป็นรอบที่สองของ micpcr อนุญาตให้เราเพิ่มจำนวนและโมเลกุลของเทค ตลอดจนช่วยเพิ่มลำดับการจำแนกโมเลกุล ( กลาง ) และ โรช 454 เฉพาะ A และ B ดังนี้ ในขั้นตอนแรกการดัดแปลงและใช้ micpcr 357f 926r ไพรเมอร์ที่ขยายการ V3 และ V5 16S rRNA ยีนและภูมิภาคซึ่งรวมหางดับสากลที่ 5 ได้รับของพวกเขาจบลง ในขั้นตอนที่สอง เป็นการ micpcr อีกครั้ง แต่ใช้เพื่อขยาย micpcr micpcr amplicons ที่ได้จากขั้นตอนแรกการ micpcr ขั้นตอนที่สองใช้ไพรเมอร์ที่มีลำดับประกอบกับหางสากล รวม 454 ลำดับนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติมเฉพาะ และเสียงกลางที่เฉพาะเจาะจงตัวอย่าง ทั้งการเพิ่มขั้นตอน น้ำมันในน้ำอิมัลชันที่เตรียมใช้ micellula ดีเอ็นเออิมัลชัน Kit ( roboklon ) เฟสน้ำมันประกอบด้วย ~ 73% โดยองค์ประกอบที่ 1 ~ 7 % โดยส่วน 2และ 20% โดยองค์ประกอบที่ 3 ซึ่งถูกผสม 5  นาทีในห้องเย็นตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต ระยะน้ำเป็นเชื้อผสมประกอบด้วยปฏิกิริยา  0.01 มก. / มล. ( 2  μ M ละ 200  μ M dntp ผสมไพรเมอร์ และ 2.5   U ได้ดีใช้กับ 1 × PCR buffer b ( eurx ) ดีเอ็นเอแม่แบบและน้ำเพิ่มเพื่อให้สุดท้ายปริมาณ 50  μ L สำหรับแต่ละตัวอย่างน้ำมันในน้ำอิมัลชันที่เตรียมโดยการเพิ่ม 50  μผมก่อนด้วย เพื่อตรวจหา μผสม 300 ลิตร ระยะก่อนระบายความร้อนด้วยน้ำมัน รอบแรกของ micpcr ถูกหามออกมาใช้ตามจักรยาน สภาพ : 95  ° C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย  25 รอบของ PCR กับจักรยานเงื่อนไข 15 วินาที  95  ° C วินาที 30   55  ° C , และ 60 วินาที  72  ° Cและส่วนขยายสุดท้ายที่ 72  ° C เป็นเวลา 7 นาที   . อิมัลชั่นถูกทำลายโดยการเพิ่มของ 2-butanol ml 1  และ 400  μ L ของ DX ส้มบัฟเฟอร์ ( roboklon ) ถูกเพิ่มลงในสารละลายอิมัลชันเสีย วิธีการแก้ปัญหานี้ที่ระดับสำหรับการแยกเฟส สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอภายในน้ำ เฟส nuclisens easymag สารเคมี ( biom é rieux ) ถูกใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิตปกติของดีเอ็นเอ และลดจำนวนของแม่แบบสำหรับรอบที่สองของโมเลกุล DNA amplification , บริสุทธิ์เจือจาง 1e    04 หรือ 1E พับ   02 สำหรับปัจจัยการผลิต สูงและต่ำ ตามลำดับ ในช่วง micpcr ก่อน รอบที่สองของ micpcr ถูกดำเนินการภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้ : ( เริ่มต้นที่ 95  ° C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย  25 รอบของ PCR ,กับจักรยานเงื่อนไข 15 วินาที  95  ° C 30  วินาทีที่ 50 และ 60 วินาที ° C   72  ° C ในช่วง 10 รอบแรกของ PCR , อุณหภูมิการอบอ่อนเพิ่มขึ้น 0.5  ° C ต่อวงจรที่อุณหภูมิการอบอ่อน 55  ° C PCR ถูกหยุดหลังจากขยายสุดท้ายที่ 72  °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที  . อีกครั้ง ในการใช้ 2-butanol แตก ,และดีเอ็นเอบริสุทธิ์ใช้ nuclisens easymag สารเคมี ( biom é rieux )