Finally, encompassed by the present

Finally, encompassed by the present invention is the use of the โพลีนิวคลีโอไทด์, the vector or the recombinant microorganism of the invention, in general, for the production of คอร์เน็กซิสติน and ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน in any of the methods disclosed herein.


30 All references cited in this specification are herewith incorporated by reference with respect to their entire disclosure content and the disclosure content specifically mentioned in this specification.


EXAMPLES
35 To isolate and clone the คอร์เน็กซิสติน and ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน gene cluster the transformation•
associated recombination (TAR) cloning in the yeast Saccharomyces cerevisiae is used.
This method is based on in vivo recombination between genomic DNA and a linearized TAR cloning vector containing the respective targeting sequences homologous to the region of interest (described in the following as hooks). The method is described in the publications
40 such as Larionov et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 491-496 and Kouprina and Larionov 2008 (Kouprina and Larionov 2008, Nature Protocols 3: 371-377). The cloning of the cluster is done as described by Kouprina and Larionov 2008 below (Kouprina and
Nature Protocols 1


Example 1 Sequencing of genomic DNA of Paeci!omyces divaricatus SANK 21086
Chromosomal DNA of the fungal strain SANK 21086 was isolated using the DNAeasy kit
5 from Qiagen according to the protocol. The DNA was subjected to DNA sequencing and the resulting sequences were assembled and ordered to contig sequences. Contig sequences were analysed for orfs and resulting proteins by intron and exon identification. Annotation was performed and orfs were named. The gene cluster for คอร์เน็กซิสติน and
ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน is identified by genome analysis and functional characteristics of the
1 O contained enzymatic activities of the respective proteins for which the DNA codes.


Example 2 Construction of the TAR cloning vector p9399. The plasmid is generated based on the yeast-£. co/ishuttle vector pVC-604, being available via the American Type Culture Collection ATCC No.: MBA-212 and containing a yeast selectable marker (HIS3) and a
15 yeast centromeric sequence ( CEN6). Plasmid pVC-604 is digested with BamHI to integrate
the first hook (SEQ ID NO: 56) representing 300 bp homologous sequences to the 5' flanking region of the คอร์เน็กซิสติน/ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน cluster. The DNA fragment with the SEQ ID NO: 56 is PCR amplified, purified and ligated in the corresponding BamHI site of
pVC-604. In the same way, the second hook (SEQ ID NO: 57) containing 300 bp of the 3' -
20 flanking region of the คอร์เน็กซิสติน/ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน cluster is PCR amplified and ligated into the EcoRI restriction site to generate plasmid p9399. This plasmid is isolated in high amounts using the DNA Maxi Kit (Qiagen) and 5 µg plasmid-DNA are linearized by Smal and purified by gel extraction. The linearized plasmid is used subsequently in the TAR
cloning experiment.
25
Example 3 Preparation of genomic DNA. The genomic DNA of Paeci!omycesdivaricatus
SANK 21086 for the TAR cloning experiment is isolated using the ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (Zymo Research) according to the protocol of the supplier.


30 Example 4 Preparation of competent yeast spheroplasts. One day before the TAR cloning experiment, 50 ml YEPD medium (2% glucose, 1 % bacto yeast extract, 2 % bacto peptone, 80 mg/I adenine hemisulfate) is inoculated with yeast strain VL6-48, being available via the American Type Culture Collection ATCC No.: MYA-3666, and incubated overnight at 30 °C until 00660 of 3.0-5.0 is achieved. The yeast cells are harvested by
35 centrifugation for 5 min at 1000 g and 5 °C, washed in 30 ml of sterile water and resuspended in 20 ml of 1 M sorbitol. After centrifugation for 5 min at 1000 g and 5 °C the cell pellet is resuspended in 20 ml of SPE solution (1 M sorbitol, 0.01 M Na2HP04 0.01 M Na2EDTA, pH7,5). Subsequently, 20 µI of zymolyase solution (10 mg/ml zymolyase 20T in
25 % (w/v) glycerol) and 40 µI of ME are added and incubated at 30 °C for 20 min with slow
40 shaking. The spheroplasts are centrifuged for 10 min at 570 g at 5 °C and the pellet is resuspended in 50 ml 1 M sorbitol. After repeating the washing step, the final pellet is gently dissolved in 2 ml of STC solution (1 M sorbitol, 0.01 M Tris-HCI, 0.01 M CaCl2, pH 7,5).

Example 5 Transformation of spheroplasts by genomic DNA along with the TAR vector p9399. 200 µI of the spheroplast suspension is mixed with µg of genomic DNA 1 µg of the linearized p9399 vector and incubate for 10 min at room temperature. 800 µI of
5 PEG8000 solution (20 % PEG8000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCI, pH7,5) is added and
the sample is incubated for 10 min at room temperature. After centrifugation for 5 min at
300-500 g at 5 °C, the spheroplasts are resuspended in 800 µI of SOS solution (1 M
sorbitol, 6.5 mM CaCl2, 0.25 % yeast extract, 0,5 % peptone) and incubated for 40 min at
30 °C without shaking. The spheroplasts are transferred into a tube containing 7 ml of
10 melted SORB-TOP-His selection medium (1 M sorbitol, 2 % D-glucose, 0.17 % yeast nitrogen base, 0.5 % (NH4)2S04 and 3 % bacto agar containing the following supplements:
0.006 % adenine sulfate, 0.006 % uracil, 0.00 5% L-arginine.HCI, 0.008 % L-aspartic acid,
0.01 % L-glutamic acid, 0.005 % L-isoleucine, 0.01 % L-leucine, 0.012 % L-lysine.HCI,
0.002 % L-methionine, 0.005 % L-phenylalanine, 0.0375 % L-serine, 0.01 % L-threonine,
15 0.005 %L-tryptophan, 0.005 % L-tyrosine and 0.015 % L-valine) gently mixed and quickly poured onto SORB-His plates with selective medium. The plates are incubated for days at 30 °C until transformants become visible.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สุดท้าย ผ่าน โดยประดิษฐ์ปัจจุบันได้ใช้การโพลีนิวคลีโอไทด์ เวกเตอร์ หรือจุลินทรีย์ recombinant ของประดิษฐ์ ทั่วไป การผลิตคอร์เน็กซิสตินและไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินในวิธีนี้การเปิดเผย30 อ้างอิงทั้งหมดที่อ้างถึงในข้อกำหนดนี้มี herewith รวม โดยอ้างอิงกับเนื้อหาเปิดเผยทั้งหมดและเปิดเผยเนื้อหาที่กล่าวถึงในข้อกำหนดนี้โดยเฉพาะตัวอย่าง35การแยก และโคลน ยีนคอร์เน็กซิสตินและไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินคลัสเตอร์ transformation•ใช้เชื่อมโยง recombination (ทาร์) โคลนในยีสต์ Saccharomyces cerevisiaeวิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับในสัตว์ทดลอง recombination ระหว่าง genomic DNA และทาร์ linearized ที่โคลนเวกเตอร์ประกอบด้วยลำดับ targeting เกี่ยวข้อง homologous เพื่อให้น่าสนใจ (ที่กล่าวถึงในต่อไปนี้เป็นตะขอ) วิธีการอธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์40 เช่น Larionov et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. สหรัฐอเมริกา 93:491-496 และ Kouprina และ Larionov 2008 (Kouprina และ Larionov 2008 ธรรมชาติ 3 โปรโตคอล: 371-377) ของคลัสเตอร์จะทำตามที่อธิบายไว้ โดย Kouprina และ Larionov 2008 ด้านล่าง (Kouprina และ โพรโทคอธรรมชาติ 1ตัวอย่างที่ 1 การจัดลำดับของ genomic DNA Paeci ! omyces divaricatus SANK 21086ของโครโมโซมดีเอ็นเอของสายพันธุ์เชื้อรา SANK 21086 ถูกแยกโดยใช้ชุด DNAeasy5 Qiagen ตามโพรโทคอล ดีเอ็นเอถูกยัดเยียดให้ลำดับดีเอ็นเอ และลำดับได้ถูกรวบรวม และสั่งการลำดับ contig ลำดับ Contig ถูก analysed orfs และโปรตีนได้ โดยรหัส intron และ exon ทำคำอธิบาย และได้ชื่อว่า orfs คลัสเตอร์ยีนสำหรับคอร์เน็กซิสติน และไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินถูกกำหนด โดยการวิเคราะห์จีโนมและลักษณะงานของการ1 O ประกอบด้วยกิจกรรมเอนไซม์ในระบบของโปรตีนที่เกี่ยวข้องซึ่งรหัสดีเอ็นเอตัวอย่างที่ 2 การก่อสร้างของทาร์โคลน p9399 เวกเตอร์ Plasmid ถูกสร้างโดยใช้ยีสต์-£ บริษัท/ishuttle เวกเตอร์ pVC-604 ได้ผ่านอเมริกันวัฒนธรรมชุด ATCC หมายเลขชนิด: MBA-212 และประกอบด้วยเครื่องหมายเลือกยีสต์ (HIS3) และยีสต์ 15 ลำดับ centromeric (CEN6) Plasmid pVC-604 เป็นเจ่ากับ BamHI รวมเบ็ดครั้งแรก (ลำดับ ID ไม่: 56) แสดง 300 bp homologous ลำดับไป 5' flanking ภูมิภาคของคลัสเตอร์คอร์เน็กซิสติน/ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน ส่วนดีเอ็นเอที่ไม่มีรหัสของลำดับ: 56 เป็น PCR ขยาย บริสุทธิ์ และควบในเว็บไซต์ BamHI ที่สอดคล้องกันของพีวีซี-604 เดียว เบ็ดสอง (ลำดับ ID ไม่: 57) ประกอบด้วย 300 bp ของ 3' -20 flanking ภูมิภาคของคลัสเตอร์คอร์เน็กซิสติน/ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน PCR ขยาย และควบเป็นไซต์จำกัด EcoRI สร้าง plasmid p9399 Plasmid นี้จะแยกต่างหากในปริมาณสูงใช้ชุดแม็กซี่ของดีเอ็นเอ (Qiagen) และ 5 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง plasmid-ดีเอ็นเอจะเป็นเส้นตรง โดย Smal และบริสุทธิ์ โดยแยกเจ Linearized plasmid ใช้มาในทาร์โคลนทดลอง25ตัวอย่างที่ 3 การเตรียมของ genomic DNA ดีเอ็นเอ genomic Paeci ! omycesdivaricatusSANK 21086 สำหรับทาร์โคลนทดลองใช้ที่ ZR Fungal/แบคทีเรีย ดีเอ็นเอ MiniPrep (Zymo การวิจัยตามโพรโทคอลของผู้จัดจำหน่ายที่แยกได้เตรียมตัวอย่างที่ 4 30 ของยีสต์เชี่ยวชาญ spheroplasts หนึ่งวันก่อนทาร์โคลนทดลอง ขนาดกลาง 50 ml YEPD (กลูโคส 2% สารสกัดจากยีสต์ bacto 1%, 2% bacto peptone, 80 มิลลิกรัม / ฉัน adenine hemisulfate) inoculated ด้วยต้องใช้ยีสต์ VL6-48 ได้ผ่านอเมริกันวัฒนธรรมชุด ATCC หมายเลขชนิด: MYA-3666 และ incubated ค้างคืนที่ 30 ° C จนกระทั่งสำเร็จ 00660 3.0-5.0 มีการเก็บเกี่ยวเซลล์ยีสต์ด้วยcentrifugation 35 สำหรับ 5 นาที 1000 กรัม และ 5 ° C ล้างใน 30 ml ใส่น้ำ และ resuspended ใน 20 ml ของซอร์บิทอล 1 M หลังจาก centrifugation สำหรับ 5 นาที 1000 กรัม และ 5 ° C เซลล์ เม็ดเป็น resuspended ใน 20 ml ของ SPE (ซอร์บิทอล 1 M, M Na2HP04 0.01 0.01 M Na2EDTA, pH7, 5) ในเวลาต่อมา 20 µI ของ zymolyase (10 mg/ml zymolyase 20T ใน25% (w/v) กลีเซอร) และ µI 40 ของผมจะเพิ่ม incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 20 นาทีกับช้า40 ที่สั่น Spheroplasts มี centrifuged สำหรับ 10 นาทีที่ 570 g ที่ 5 ° C และเม็ดเป็น resuspended ในชนิด 1 เมตร 50 ml หลังจากทำซ้ำขั้นตอนซักผ้า เม็ดสุดท้ายจะค่อย ๆ ละลายใน 2 ml ของ STC (1 M ชนิด 0.01 M ตรี hci, 0.01 M CaCl2, pH 7,5) ตัวอย่างที่ 5 การเปลี่ยนแปลงของ spheroplasts โดย genomic DNA กับ p9399 เวกเตอร์ทาร์ µI 200 การระงับ spheroplast ผสมกับไมโครกรัมเป็นเครื่องของ genomic ไมโครกรัมเป็นเครื่อง 1 ดีเอ็นเอของเวกเตอร์ p9399 เป็นเส้นตรง และฟักใน 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง µI 800 ของแก้ปัญหา PEG8000 5 (20% PEG8000, CaCl2, 10 มม.ตรี hci, pH7, 5 10 mM) มีเพิ่ม และตัวอย่างคือ incubated สำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจาก centrifugation สำหรับ 5 นาทีใน300-500 g ที่ 5 ° C, resuspended spheroplasts ที่ใน µI 800 ของ SOS (1 Mซอร์บิทอล CaCl2, 6.5 mM 0.25% ยีสต์สกัด 0,5% peptone) และ incubated สำหรับที่ 40 นาที30 ° C โดยไม่สั่น Spheroplasts มีการโอนย้ายเป็นท่อที่ประกอบด้วยของ 7 mlเลือกหลอม SORB-บนพระกลาง 10 (ซอร์บิทอล 1 M, 2% D-กลูโคส ฐานไนโตรเจนยีสต์ 0.17%, 0.5% (NH4) 2S04 และ 3% bacto agar ที่ประกอบด้วยอาหารเสริมต่อไปนี้:ซัลเฟต adenine 0.006%, 0.00 5%, uracil 0.006% L-arginine.HCI, 0.008% L-aspartic กรด0.01% L-กลูตาเมต 0.005% L isoleucine, 0.01% L leucine, 0.012% L-lysine.HCI0.002% L-methionine, 0.005% L phenylalanine, 0.0375% L-แถ 0.01% L-ทรีโอนีน15 0.005 %L ทริปโตเฟน 0.005 L tyrosine และ 0.015% L-วาลีน) ผสมเบา ๆ และรวดเร็ว poured บนแผ่นพระ SORB กับสื่อที่เลือก แผ่นที่ incubated วันที่ 30 ° C จนกว่า transformants มองเห็นได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สุดท้ายห้อมล้อมด้วยการประดิษฐ์ในปัจจุบันคือการใช้โพลีนิวคลีโอไทด์, เวกเตอร์หรือจุลินทรีย์ recombinant ของการประดิษฐ์โดยทั่วไปสำหรับการผลิตคอร์เน็กซิสตินและไฮดรอกซี คอร์เน็กซิสตินในการใดวิธีการเปิดเผยในที่นี้. 30 ทั้งหมดอ้างอิงที่อ้างถึงในข้อกำหนดนี้มีความพร้อมที่จัดตั้งขึ้นโดยการอ้างอิงเกี่ยวกับการเปิดเผยเนื้อหาของพวกเขาทั้งเนื้อหาและการเปิดเผยข้อมูลดังกล่าวโดยเฉพาะในข้อกำหนดนี้. ตัวอย่าง35 เพื่อแยกและโคลน คอร์เน็กซิสตินและไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินกลุ่มยีนเปลี่ยนแปลง• รวมตัวกันอีกที่เกี่ยวข้อง (TAR) โคลนในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ถูกนำมาใช้. วิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับการรวมตัวกันในร่างกายระหว่างดีเอ็นเอ และ TAR linearized โคลนเวกเตอร์ที่มีการกำหนดเป้าหมายแต่ละลำดับคล้ายคลึงกันในภูมิภาคที่น่าสนใจ (อธิบายในต่อไปนี้เป็นตะขอ) วิธีการอธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์40 เช่น Larionov et al, 1996 พร Natl Acad วิทย์ สหรัฐอเมริกา 93: 491-496 และ Kouprina และ Larionov 2008 (Kouprina และ Larionov 2008 โปรโตคอลธรรมชาติ 3: 371-377) โคลนของกลุ่มที่จะทำตามที่อธิบาย Kouprina และ Larionov 2008 ดังต่อไปนี้ (Kouprina และธรรมชาติโปรโตคอล 1 ตัวอย่างที่ 1 ลำดับของดีเอ็นเอของจีโนมของ Paeci! omyces divaricatus จม 21086 โครโมโซมดีเอ็นเอของสายพันธุ์ของเชื้อราจม 21086 ถูกแยกออกโดยใช้ชุด DNAeasy 5 Qiagen ตามโปรโตคอล. ดีเอ็นเอได้ภายใต้การลำดับดีเอ็นเอและลำดับส่งผลให้ถูกประกอบและสั่งให้ลำดับ contig. ลำดับ contig วิเคราะห์สำหรับ ORFs และโปรตีนที่เกิดจาก intron และบัตรประจำตัวเอกซ์ซอน. หมายเหตุได้ดำเนินการและถูกตั้งชื่อ ORFs. ยีน สำหรับกลุ่มคอร์เน็กซิสตินและไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินจะถูกระบุโดยการวิเคราะห์จีโนมและลักษณะการทำงานของโอ 1 มีกิจกรรมของเอนไซม์โปรตีนที่เกี่ยวข้องที่รหัสดีเอ็นเอ. ตัวอย่างที่ 2 การก่อสร้าง TAR โคลน p9399 เวกเตอร์. พลาสมิดถูกสร้างอยู่บนพื้นฐานของ£ yeast-. ร่วม / ishuttle เวกเตอร์ PVC-604, การให้บริการผ่านทางวัฒนธรรมประเภทอเมริกันเก็บ ATCC No .: MBA-212 และมียีสต์เครื่องหมายเลือก (HIS3) และ15 ยีสต์ลำดับ centromeric (CEN6) พลาสมิด PVC-604 จะถูกย่อยด้วย BamHI เพื่อบูรณาการเบ็ดแรก (SEQ ID NO: 56) ตัวแทนลำดับคล้ายคลึงกัน 300 bp เป็น 5 ภูมิภาคของขนาบข้าง กลุ่ม ชิ้นดีเอ็นเอที่มี ID SEQ NO: 56 PCR ขยายบริสุทธิ์และ ligated ในเว็บไซต์ BamHI ที่สอดคล้องกันของPVC-604 ในทำนองเดียวกับเบ็ดสอง (SEQ ID NO: 57) ที่มี 300 bp ของ 3 '- ภูมิภาค 20 ขนาบข้างของ คลัสเตอร์ PCR และ ligated ขยายเข้าไปในเว็บไซต์ EcoRI ข้อ จำกัด ในการสร้างพลาสมิด p9399 พลาสมิดนี้จะถูกแยกออกในปริมาณที่สูงโดยใช้ดีเอ็นเอ Maxi Kit (Qiagen) และ 5 ไมโครกรัมพลาสมิดดีเอ็นเอมีการเชิงเส้นโดย Smal และบริสุทธิ์โดยการสกัดเจล พลาสมิด linearized ถูกนำมาใช้ในภายหลัง TAR ทดลองโคลนนิ่ง. 25 ตัวอย่างที่ 3 การเตรียมดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอของ Paeci! omycesdivaricatus จม 21086 สำหรับ TAR โคลนทดลองจะถูกแยกออกโดยใช้ ZR เชื้อรา / แบคทีเรียดีเอ็นเอ miniprep (Zymo วิจัย) ตามโปรโตคอลของผู้จัดจำหน่าย. 30 ตัวอย่างที่ 4 การจัดทำ spheroplasts ยีสต์ที่มีอำนาจ หนึ่งวันก่อนการทดลองโคลน TAR 50 มล. ขนาดกลาง YEPD (กลูโคส 2%, 1% สารสกัดจากยีสต์ bacto, 2% bacto เปปโตน 80 มก. / I hemisulfate adenine) คือเชื้อยีสต์ VL6-48 เป็นใช้ได้ผ่านทางประเภทอเมริกัน การเก็บวัฒนธรรม ATCC No .: ม-3666 และฟักค้างคืนที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสจน 00660 ของ 3.0-5.0 จะประสบความสำเร็จ เซลล์ยีสต์มีการเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง 35 เป็นเวลา 5 นาทีที่ 1000 กรัมและ 5 องศาเซลเซียสล้างใน 30 ml ของน้ำผ่านการฆ่าเชื้อและ resuspended ใน 20 มล. 1 M ซอร์บิทอ หลังจากที่ปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่ 1000 กรัมและ 5 องศาเซลเซียสเม็ดเซลล์ถูก resuspended ใน 20 มล. ของการแก้ปัญหา SPE (1 M ซอร์บิทอ, 0.01 M Na2HP04 0.01 M Na2EDTA, pH7,5) ต่อจากนั้น 20 μIของการแก้ปัญหา zymolyase (10 mg / ml zymolyase 20T ใน25% (w / v) กลีเซอรอล) และ 40 μIของ ME มีการเพิ่มและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีช้า40 สั่น spheroplasts จะหมุนเหวี่ยง 10 นาทีที่ 570 กรัมที่ 5 องศาเซลเซียสและเม็ดเป็น resuspended ใน 50 มล. 1 M ซอร์บิทอ หลังจากการทำซ้ำขั้นตอนการซักผ้าเม็ดสุดท้ายจะละลายเบา ๆ ใน 2 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหาเอสทีซี (1 M ซอร์บิทอ, 0.01 M Tris-HCI, 0.01 M CaCl2 ค่า pH 7,5). ตัวอย่างที่ 5 การเปลี่ยนแปลงของ spheroplasts โดยดีเอ็นเอพร้อมกับ TAR เวกเตอร์ p9399 200 μIของการระงับ spheroplast ผสมกับไมโครกรัมของดีเอ็นเอ 1 ไมโครกรัมของเวกเตอร์ p9399 linearized และฟักไข่เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 800 μIของ5 PEG8000 วิธีการแก้ปัญหา (20% PEG8000 10 มิลลิ CaCl2 10 มิลลิ Tris-HCI, pH7,5) จะเพิ่มและตัวอย่างที่มีการบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากที่ปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่300-500 กรัมที่ 5 องศาเซลเซียส spheroplasts จะ resuspended ใน 800 ของการแก้ปัญหาμI SOS (1 M ซอร์บิทอ 6.5 มิลลิ CaCl2, สารสกัดจากยีสต์ 0.25%, 0.5% เปปโตน) และบ่มเป็นเวลา 40 นาที ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสโดยไม่ต้องสั่น spheroplasts จะถูกโอนลงในหลอดที่มี 7 มล10 ละลาย Sorb-TOP-เขาเลือกขนาดกลาง (M 1 ซอร์บิทอ, 2% D-กลูโคสฐานไนโตรเจนยีสต์ 0.17%, 0.5% (NH4) 2S04 และ 3% bacto อาหารเลี้ยงเชื้อที่มี ผลิตภัณฑ์เสริมอาหารดังนี้: 0.006% ซัลเฟต adenine, uracil 0.006% 0.00% 5 L-arginine.HCI, 0.008% เป็นกรด L-aspartic, เป็นกรด L-0.01% กลูตา, 0.005% L-isoleucine, 0.01% L-leucine, 0.012% L -lysine.HCI, 0.002% L-methionine, 0.005% L-phenylalanine, 0.0375% L-ซีรีน 0.01% L-ธ รีโอนี, 15 0.005% L-โพรไบโอ, 0.005% L-tyrosine และ 0.015% L-valine) ผสมเบา ๆ ได้อย่างรวดเร็วและเทลงบนแผ่น-Sorb ของเขากับสื่อที่เลือก แผ่นได้รับการบ่มเป็นเวลาวันที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสจน transformants เป็นรูปเป็นร่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สุดท้าย ในบริเวณใกล้เคียง โดยปัจจุบันการประดิษฐ์คือการใช้ของโพลีนิวคลีโอไทด์ , เวกเตอร์หรือจุลินทรีย์โปรตีนของสิ่งประดิษฐ์ในทั่วไปสำหรับการผลิตและคอร์เน็กซิสตินไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินในใด ๆของวิธีการเปิดเผย

ในที่นี้30 การอ้างอิงทั้งหมดที่อ้างถึงใน สเปคนี้ พร้อมกันนี้ จัดตั้งขึ้นโดยอ้างอิงเกี่ยวกับการเปิดเผยเนื้อหาของพวกเขาทั้งหมดและการเปิดเผยเนื้อหาเฉพาะกล่าวถึงในรายละเอียดนี้ .



ตัวอย่าง 35 แยกและโคลนและการคอร์เน็กซิสตินไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินกลุ่มยีนเปลี่ยนแปลง -
ที่เกี่ยวข้องการ ( TAR ) ยีนในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ใช้ .
วิธีนี้จะขึ้นอยู่กับการรวมตัวระหว่างดีเอ็นเอในหลอดทดลอง และช่วงที่มีการเกี่ยวข้องทาร์เวกเตอร์เป้าหมายลำดับความคล้ายคลึงกับภูมิภาคที่น่าสนใจ ( อธิบายในต่อไปนี้เป็นตะขอ ) วิธีการที่อธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์
40 เช่น larionov et al . 1996 proc . NATL .ราช . สภาวะโลกร้อน 93 สหรัฐอเมริกาและและ 491-496 kouprina larionov 2008 ( kouprina larionov ธรรมชาติโปรโตคอลและ 2008 , 3 : 371-377 ) โคลนนิ่งของคลัสเตอร์และทำตามที่อธิบายไว้โดย kouprina larionov 2008 ด้านล่าง ( kouprina
ธรรมชาติและโปรโตคอล 1


1 ตัวอย่างการหาลำดับเบสของดีเอ็นเอ paeci ! omyces divaricatus จม 21086
โครโมโซมอลดีเอ็นเอของสายพันธุ์เชื้อราจม 21086 แยกโดยใช้
ชุด dnaeasy5 เพิ่มตามขั้นตอน ดีเอ็นเอภายใต้การจัดลำดับดีเอ็นเอและลำดับให้ถูก ประกอบให้ contig ลำดับ contig ลำดับวิเคราะห์หา orfs และผลโปรตีนโดย iNtRON และระบุชนิด . หมายเหตุ คือ ปฏิบัติ และ orfs ถูกตั้งชื่อ กลุ่มยีนสำหรับคอร์เน็กซิสตินและ
ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินระบุโดยการวิเคราะห์และลักษณะการทำงานของ
1 o ) มีกิจกรรมเอนไซม์ของโปรตีนที่เกี่ยวข้องซึ่งดีเอ็นเอรหัส


ตัวอย่างการก่อสร้างของทาร์โคลนเวกเตอร์ p9399 . พลาสมิดที่ถูกสร้างขึ้นบนพื้นฐานของยีสต์ - ง . เวกเตอร์ pvc-604 Co / ishuttle ,ที่มีอยู่ผ่านทางคอลเลกชันอเมริกันประเภทวัฒนธรรมและหมายเลข : mba-212 ประกอบด้วยยีสต์และเลือกเครื่องหมาย ( his3 ) และ
15 centromeric ลำดับยีสต์ ( cen6 ) พลาสมิด pvc-604 แยกย่อยด้วย BamHI รวม
ตะขอแรก ( seq id ไม่ :56 ) คิด 300 BP เปรียบเทียบลำดับที่ 5 ' flanking region ของคอร์เน็กซิสติน / ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสตินคลัสเตอร์ ดีเอ็นเอจำเพาะกับ seq id : 56 คือ PCR ไพรบริสุทธิ์และผูกในที่เว็บไซต์ของ pvc-604 BamHI
. ในทางเดียวกัน , ตะขอสอง ( seq id : 57 ) ประกอบด้วย 300 BP ของ 3 ' -
20 flanking region ของคอร์เน็กซิสติน / ไฮดรอกซีคอร์เน็กซิสติน PCR ของคลัสเตอร์และผูกเป็นเว็บไซต์ข้อ จำกัด ด้วยการสร้างพลาสมิด p9399 . สายพันธุ์นี้เป็นสายพันธุ์ปริมาณสูงใช้ดีเอ็นเอ maxi ชุด ( เพิ่ม ) และ 5 µกรัม ในช่วง smal DNA โดยการสกัดและทำให้บริสุทธิ์ โดยเจลพลาสมิดที่ใช้ในภายหลังในช่วงการทดลองโคลนทาร์
.
25
ตัวอย่าง 3 การเตรียม genomic DNA ดีเอ็นเอจีโนมของ paeci ! omycesdivaricatus
จมโคลน 21086 สำหรับทาร์การทดลองแยกเชื้อรา / แบคทีเรียใช้ ZR miniprep DNA ( zymo วิจัยตามขั้นตอนของผู้ผลิต


30 ตัวอย่างที่ 4 การเตรียมการของพนักงานเจ้าหน้าที่ยีสต์ spheroplasts .หนึ่งวันก่อนที่ทาร์โคลนการทดลอง 50 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อ medium ( กลูโคส 2 % Bacto extract , 2% Bacto extract , 80 มก. / ล. และ hemisulfate ) ใส่ vl6-48 สายพันธุ์ยีสต์ เป็นใช้ได้ผ่านทางคอลเลกชันอเมริกันประเภทวัฒนธรรมและหมายเลข : mya-3666 และบ่มค้างคืนที่ 30 ° C ถึง 00660 ในกาได้ เซลล์ยีสต์จะเก็บเกี่ยวโดย
35 ปั่นเป็นเวลา 5 นาที 1 , 000 กรัมและ 5 ° C , ล้างใน 30 ml ของน้ำหมัน และ resuspended 20 ml 1 M ซอร์บิทอล . หลังการปั่นเหวี่ยงสำหรับ 5 นาทีที่ 1000 กรัมและ 5 ° C เซลล์เม็ด เป็น resuspended 20 มิลลิลิตร สารละลาย ( 1 เมตร สารซอร์บิทอล 0.01 M na2hp04 0.01 M na2edta ph7,5 , ) จำนวน 20 µผมของ zymolyase โซลูชั่น ( 10 mg / ml ใน zymolyase 20t
25 % ( w / v ) กลีเซอรอล ) และ 40 µฉันฉันมีการเพิ่มและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 20 นาที ช้า
40 สั่น การ spheroplasts เป็นระดับ 10 นาทีที่ 570 กรัม 5 ° C และเม็ดอยู่ resuspended 50 ml 1 M ซอร์บิทอล . หลังจากการซักก้าว เม็ดสุดท้ายจะค่อย ๆละลายใน 2 มิลลิลิตรของสารละลาย ( 1 M STC ซอร์บิทอล 0.01 M ทริสไฮโดรคลอไรด์ , 0.01 M ผลิตพีเอช 7 , 5 )

ตัวอย่างที่ 5 การเปลี่ยนแปลงของ spheroplasts โดยสกัดดีเอ็นเอพร้อมกับน้ำมันดินเวกเตอร์ p9399 . 200 µผมของการระงับ spheroplast ผสมกับµกรัมของ genomic DNA 1 µกรัมในช่วง p9399 เวกเตอร์และบ่มเป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิห้อง 800 µผม
5 peg8000 โซลูชั่น ( 20% peg8000 10 มม. ผลิตโดยบริษัท ph7,5 , MM , 10 ) เพิ่มและ
ตัวอย่างบ่มเป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิห้องหลังการปั่นเหวี่ยงสำหรับ 5 นาทีที่ 5 ° C
300-500 กรัม , spheroplasts เป็น resuspended ใน 800 µผมขอความช่วยเหลือแก้ปัญหา ( 1 M
ซอร์บิทอล , 6.5 มม. ผลิตสารสกัดจากยีสต์ , 0.25 % 0 , 5 % , ตามลำดับ ) และบ่มเป็นเวลา 40 นาทีที่ 30 ° C
โดยไม่สั่น การ spheroplasts โอนเข้าไปในหลอดบรรจุ 7 ml
10 sorb ด้านบนของเขาการเลือกสื่อละลาย ( 1 M ซอร์บิทอล 2% ดี กูลโคส , 0.17% ยีสต์ไนโตรเจนเบส , 05% ( NH4 ) 2s04 และ 3% Bacto วุ้นที่มีข้อมูลเพิ่มเติมต่อไปนี้ :
0.006 % และซัลเฟต , 0.006 % Name , 0.00 l-arginine.hci 0.008 % l-aspartic 5% , กรด
0.01 % l-glutamic กรด 0.005% แอล ไอโซลูซีน , 0.01 % แอล 0.012 % , แอล - ไลซีน ไฮโดรคลอไรด์ร้อยละ 0.002 , .
แอล 0.005% แอล - ฟีนิลอะลานีน 0.0375 % , l-serine 0.01 % l-threonine
15 , 0.005 % - แอล ไทโรซีน , 0.005 % 0015 - วาลีนเบา ๆผสมและรวดเร็ว % ) เทลงบนจานของเขากับ sorb เลือกปานกลาง แผ่นจะบ่มสำหรับวันที่ 30 ° C จนกลายเป็นมองเห็นได้พลาสมิด