2.2. Other apparatusVarian Cary 50

2.2. Other apparatus
Varian Cary 50 UV–vis. spectrophotometer (Palo Alto, CA, USA)
with 1 cm quartz cuvettes was used to calibrate retinyl propionate
(325 nm), tocopherol propionate (284 nm) and apo-carotenoic acid
ethyl ester (450 nm). Protease incubation was performed at
50 ± 3 C in a Grant water bath with GD100 controller (Chelmsford,
UK). Sample clarification was performed in a Gerber centrifuge
(Funke-Gerber, Berlin, Germany) at 1000 revs/min (350 rcf) and
buckets to contain 50 mL polypropylene Centristar centrifuge
tubes (Corning, NY, USA). pH control was done with a Metrohm
867 (Herisau. Switzerland).
2.3. Reagents
Thermostable protease (EC 3.4.21.14), subtilisin A from Bacillus
licheniformis was sourced from Megazyme (Bray, County Wicklow,
Eire), product code E-BSPRT in 50% glycerol, with >300 tyrosine
equivalent U/mL (casein substrate, pH 8).
Tris.HCl buffer (1 M) was prepared by dissolving 121 g tris base
(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) in about 800 mL water, then
bringing to pH 8.0 with drop-wise addition of concentrated
hydrochloric acid. This was made to 1 L and diluted to 0.1 M for
use.
Solvents used were HPLC-grade hexane, ethanol and isopropanol
(IPA) from Fisher Scientific (Loughborough, UK). An
extraction solution of 50% ethanol in hexane was prepared. To prepare
the mobile phase, various volumes of IPA were tested to
achieve optimum separation of vitamin A and E esters, the preferred
being 600 lL in 1 L hexane. The mobile phase was filtered
through anhydrous sodium sulphate (Scharlau, Barcelona, Spain)
on a 0.45 lm membrane filter with standard vacuum apparatus
thus minimising its humidity and stabilising retention times. The
mobile phase was continuously recycled to reduce reagent costs
and replaced when retention time or baseline fluctuations were
observed.
Saturated sodium chloride was prepared by adding 320 g
sodium chloride (Merck, Darmstedt, Germany) to 1 L of deionised
water, ensuring some solid remained undissolved.
Vitamin A propionate (2,500,000 IU/g) was sourced from BASF
(part 50096515, Basel, Switzerland) and stored in a freezer under
nitrogen gas. A stock solution of about 625 IU/mL was prepared
by dissolving 25 mg in 100 mL isopropanol (IPA) containing
100–200 mg butylated hydroxytoluene crystals (BHT, Sigma
Aldrich, St Louis, MO, USA) to minimise vitamin degradation. This
was stored in the dark in a freezer (20 C) for up to six months
and used as internal standard for vitamin A palmitate and vitamin
A acetate. It was calibrated, using Eq. (1), by dilution of 100 lL to
10 mL with subsequent absorbance measurement against IPA at
325 nm. Recalibration was performed on a weekly basis. Calculations
were converted to IU/mL to permit unitary (1.00) response
factors no matter which retinyl esters were being measured,
including the natural long-chain esters.
Retinyl propionate ðIU=mLÞ ¼ A325  104  100
1595  0:359
ð1Þ
where
A325 = observed absorbance at 325 nm (1 cm)
1595 = extinction coefficient in IPA at 325 nm
104 = conversion of % to lg/mL
0.359 = conversion of lg to IU for retinyl propionate
100 = dilution for usable absorbance
Retinyl palmitate and retinyl acetate were obtained from
Sigma–Aldrich (St Louis, MO, USA), containing 1,750,000 IU/g and

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2 เครื่องอื่น ๆแล้วแต่กำหนดแครีแกรนต์ 50 UV – vis. เครื่องทดสอบกรดด่าง (ดัลลัส CA, USA)ด้วย cuvettes ควอตซ์ 1 ซ.ม.ใช้ในการปรับเทียบ retinyl propionate(325 nm), tocopherol propionate (284 nm) และกรดอะโป carotenoicเอทิลเอสเตอร์ (450 nm) ทำการบ่มรติเอสที่50 ± 3 C ในน้ำน้ำให้กับตัวควบคุม GD100 (Chelmsfordสหราชอาณาจักร) ทำการชี้แจงอย่างในเครื่องหมุนเหวี่ยงเป็น Gerber(Funke Gerber เบอร์ลิน เยอรมนี) ที่ 1000 revs/min (350 rcf) และกลุ่มมี 50 mL polypropylene Centristar เครื่องหมุนเหวี่ยงหลอด (คอร์นทำ NY สหรัฐอเมริกา) ทำกับ Metrohm การควบคุม pH867 (Herisau สวิตเซอร์แลนด์)2.3. reagentsThermostable รติเอส (EC 3.4.21.14), A subtilisin จากคัดlicheniformis ได้มาจาก Megazyme (Bray, Wicklow เขตEire), ผลิตภัณฑ์รหัส E-BSPRT ใน 50% กลีเซอร กับ > 300 tyrosineเท่ากับ U/mL (พื้นผิวเคซีน pH 8)Tris.HCl บัฟเฟอร์ (1 เมตร) ถูกเตรียม โดยยุบทริสเรทติ้ง 121 g พื้นฐาน(Aldrich ซิก St Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ประมาณ 800 mL น้ำ จากนั้นนำ pH 8.0 drop-wise บวกเข้มข้นกรดไฮโดรคลอริก นี้ทำ 1 L และทำให้เจือจาง 0.1 เมตรสำหรับใช้หรือสารทำละลายที่ใช้ก็เกรด HPLC เฮกเซน เอทานอล และ isopropanol(IPA) จาก Fisher วิทยาศาสตร์ (Loughborough สหราชอาณาจักร) มีมีเตรียมแยกโซลูชั่นของเอทานอล 50% ในเฮกเซน การเตรียมตัวระยะเคลื่อน ทดสอบการไดรฟ์ข้อมูลต่าง ๆ ของ IPAให้แยกที่เหมาะสมของวิตามิน A และ E esters ต้องกำลัง 600 จะในเฮกเซน 1 L เฟสเคลื่อนที่ถูกกรองผ่านไดโซเดียมซัลเฟต (Scharlau บาร์เซโลนา สเปน)ตัวกรองเมมเบรน lm 0.45 กับมาตรฐานเครื่องสูญญากาศดังนั้น minimising ความชื้น และสำหรับเก็บข้อมูลเวลา ที่ระยะเคลื่อนที่กลับอย่างต่อเนื่องเพื่อลดต้นทุนการรีเอเจนต์และเมื่อเก็บข้อมูลเวลาหรือพื้นฐานความผันผวนได้สังเกตอิ่มตัวโซเดียมคลอไรด์ที่เตรียม โดยการเพิ่มก.โซเดียมคลอไรด์ (เมอร์ค Darmstedt เยอรมนี) ใน 1 L ของ deionisedน้ำ ใจแข็งบางยังคง undissolvedมีที่มาจาก BASF propionate วิตามินเอ (2,500,000 IU/g)(ส่วน 50096515 บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) และเก็บไว้ในตู้แช่แข็งภายใต้แก๊สไนโตรเจน มีเตรียมแก้ไขปัญหาสต็อกของประมาณ 625 IU/mLโดยยุบ 25 มิลลิกรัมใน 100 mL ประกอบด้วย isopropanol (IPA)100 – 200 มิลลิกรัมผลึก butylated hydroxytoluene (บาท ซิกAldrich, St Louis, MO สหรัฐอเมริกา) เพื่อลดการสลายตัวของวิตามิน นี้เก็บในมืดในตู้แช่แข็ง (20 C) 6 เดือนและใช้เป็นมาตรฐานภายใน vitamin A palmitate และวิตามินAcetate มันถูกปรับเทียบ ใช้ Eq. (1), โดยเจือจาง 100 จะต้อง10 mL กับวัด absorbance ต่อกับ IPA ที่325 nm Recalibration ที่ดำเนินการเป็นประจำทุกสัปดาห์ คำนวณถูกแปลงเป็น IU/mL ให้อนุญาตให้มีการตอบสนอง (1.00) unitaryปัจจัยเรื่องไม่มีวัดใด retinyl estersรวม esters ยาวห่วงโซ่ธรรมชาติRetinyl propionate ðIU = mLÞ ¼ A325 104 1001595 0:359ð1Þซึ่งA325 =สังเกต absorbance ที่ 325 nm (1 ซม.)1595 =สัมประสิทธิ์สูญพันธุ์ใน IPA ที่ 325 nm104 =แปลง% lg/mL0.359 =แปลง lg IU สำหรับ retinyl propionate100 =เจือจางสำหรับ absorbance ได้Retinyl palmitate และ retinyl acetate ได้รับมาจากซิกมา-Aldrich (St Louis, MO สหรัฐอเมริกา), ประกอบด้วย 1,750,000 IU/g และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 อุปกรณ์อื่น ๆ
Varian นิวเคลียส 50 UV-Vis spectrophotometer (Palo Alto, CA, USA)
กับ 1 ซม cuvettes ควอทซ์ถูกนำมาใช้ในการสอบเทียบ propionate retinyl
(325 นาโนเมตร) propionate โทโคฟีรอ (284 นาโนเมตร) และกรด APO-carotenoic
เอทิลเอสเตอร์ (450 นาโนเมตร) บ่มโปรติเอสเป็นที่
50 ± 3 องศาเซลเซียสในอ่างน้ำให้กับตัวควบคุม GD100 (เชล์มส,
สหราชอาณาจักร) ชี้แจงตัวอย่างที่ได้ดำเนินการใน centrifuge Gerber
(Funke-Gerber, เบอร์ลิน, เยอรมนี) เครื่องยนต์ที่ 1000 รอบ / นาที (? 350 RCF)
และถังจะมีโพรพิลีน50 มิลลิลิตร Centristar? centrifuge
หลอด (Corning, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) การควบคุมค่า pH ได้ทำกับเมทโธรห์
867 (เฮริ. วิตเซอร์แลนด์).
2.3 รีเอเจนต์โปรติเอสทนความร้อน (EC 3.4.21.14) subtilisin จาก Bacillus licheniformis ได้รับมาจาก Megazyme (เบรย์มณฑลวิกโคลว์ไอร์แลนด์) รหัสสินค้า E-BSPRT ในกลีเซอรีน 50% ด้วย> 300 ซายน์เทียบเท่าU / มิลลิลิตร (สารตั้งต้นเคซีน พีเอช 8). บัฟเฟอร์ Tris.HCl (1 M) ถูกจัดทำขึ้นโดยการละลาย 121 กรัมฐาน tris (ซิกม่าดิช, St Louis, MO, USA) ในน้ำประมาณ 800 มิลลิลิตรแล้วนำค่าpH 8.0 ลดลงด้วยนอกจากนี้ที่ชาญฉลาดที่มีความเข้มข้นของไฮโดรคลอริกกรด. นี้ถูกสร้างขึ้น 1 ลิตรและลดลงเหลือ 0.1 M สำหรับการใช้งาน. ตัวทำละลายใช้คือเฮกเซน HPLC เกรดเอทานอลและ isopropanol (IPA) จากฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ (Loughborough สหราชอาณาจักร) วิธีการแก้ปัญหาการสกัดเอทานอล 50% ในเฮกเซนถูกจัดทำขึ้น เพื่อเตรียมความพร้อมขั้นตอนการถือปริมาณต่างๆของ IPA ได้รับการทดสอบเพื่อให้เกิดการแยกที่เหมาะสมของวิตามินเอและเอสเทอีที่ต้องการเป็น600 LL ใน 1 เฮกเซน L ขั้นตอนที่มือถือถูกกรองผ่านโซเดียมซัลเฟตปราศจากน้ำ (Scharlau, บาร์เซโลนา, สเปน) บนตัวกรองเมมเบรน LM 0.45 ด้วยเครื่องสูญญากาศมาตรฐานจึงลดความชื้นและการรักษาเสถียรภาพครั้งการเก็บรักษา เฟสเคลื่อนที่ถูกนำกลับมาใช้อย่างต่อเนื่องเพื่อลดค่าใช้จ่ายน้ำยาและแทนที่เมื่อเก็บรักษาเวลาหรือความผันผวนของพื้นฐานที่ถูกตั้งข้อสังเกต. โซเดียมคลอไรด์อิ่มตัวถูกจัดทำขึ้นโดยการเพิ่ม 320 กรัมโซเดียมคลอไรด์(เมอร์ค Darmstedt, เยอรมนี) 1 ลิตรของ deionised น้ำเพื่อให้มั่นใจของแข็งบางอย่างยังคงอยู่ undissolved. วิตามิน propionate (2,500,000 IU / g) ได้รับมาจาก บริษัท BASF (ส่วน 50,096,515, บาเซิลวิตเซอร์แลนด์) และเก็บไว้ในช่องแช่แข็งภายใต้ก๊าซไนโตรเจน วิธีการแก้ปัญหาเกี่ยวกับสต็อกของ 625 IU / mL ถูกจัดทำขึ้นโดยการละลาย25 มก. ใน 100 มล isopropanol (IPA) ที่มี100-200 มิลลิกรัม butylated hydroxytoluene ผลึก (บาทซิกดิช, St Louis, MO, USA) เพื่อลดการเสื่อมสภาพของวิตามิน นี้ได้รับการจัดเก็บไว้ในที่มืดในช่องแช่แข็งที่ (? 20? C) นานถึงหกเดือนและใช้เป็นมาตรฐานภายในสำหรับวิตามินpalmitate และวิตามินอะซิเตท มันได้รับการสอบเทียบโดยใช้สมการ (1) โดยการลดสัดส่วนของ 100 จะไป10 มิลลิลิตรวัดการดูดกลืนแสงที่ตามมากับ IPA ที่325 นาโนเมตร recalibration ได้ดำเนินการเป็นประจำทุกสัปดาห์ การคำนวณเปลี่ยน IU / mL ที่จะอนุญาตให้รวม (1.00) การตอบสนองต่อปัจจัยเรื่องที่เอสเทอretinyl ถูกวัดรวมทั้งเอสเทอสายโซ่ยาวธรรมชาติ. Retinyl propionate อู = mLÞ¼ A325? 104? 100 1595? 0: 359 ð1Þที่A325 = สังเกตการดูดกลืนแสงที่ 325 นาโนเมตร (1 เซนติเมตร) 1,595 = ค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียใน IPA ที่ 325 นาโนเมตรแปลง= 104% ถึง LG มิลลิลิตร / 0.359 = แปลง lg เพื่อ IU สำหรับ propionate retinyl 100 = เจือจางสำหรับการดูดกลืนแสงที่ใช้งานได้retinyl palmitate และ retinyl acetate ที่ได้รับจากSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) ที่มี 1,750,000 IU / g และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . อุปกรณ์อื่น ๆเครื่องยูวี -
50 –วิส Spectrophotometer ( อัลโต แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา )
1 เซนติเมตรใช้เรติน คิวเวททควอตซ์คาลิเบรต propionate
( 325 nm ) , โทโคเฟอรอล กรดโพรพิโอนิก ( 284 nm ) และความ carotenoic กรด
ethyl ester ( 450 nm ) โปรติเอสบ่มดำเนินการโดย
50 ± 3  C ให้อาบน้ำกับตัวควบคุม gd100 ( Chelmsford ,
UK )ชี้แจงตัวอย่างแสดงใน Gerber
( ฟังก์ Gerber , เบอร์ลิน , เยอรมนี ) 1000 revs / min (  350 rcf ) ถังมีปริมาตร 50 มิลลิลิตรและ

 โพรพิลีน centristar centrifuge หลอด ( Corning , NY , USA ) อ ควบคุมได้ด้วย metrohm
867 ( switzerland . kgm . สวิตเซอร์แลนด์ ) .
2.3 สารเคมี
ในโปรติเอส ( EC 3.4.21.14 ) จาก Bacillus licheniformis ซับทีลิซิน
มีที่มาจาก megazyme ( Bray ,County Wicklow ,
ไอร์แลนด์ ) รหัสสินค้า e-bsprt 50% กลีเซอรอลกับ > 300 แต่อย่างใด
เทียบเท่า U / ml ( เคซีน ( pH 8 )
tris.hcl บัฟเฟอร์ ( 1 ) เตรียมโดยละลาย 121 กรัมต่อฐาน
( ซิกม่า Aldrich เซนต์หลุยส์ โม สหรัฐอเมริกา ) ในน้ำประมาณ 800 มล. แล้ว
นำ pH 8.0 ลดลงปัญญาเพิ่ม
กรดเกลือเข้มข้น . นี้ได้ 1 ลิตรและเจือจางใน 0.1 M สำหรับ

ใช้ .ใช้เป็นตัวทำละลายเฮกเซนเกรด HPLC , เอทานอล และไอโซโพรพานอล
( IPA ) จากฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ( Loughborough , UK ) โซลูชั่นการ
การสกัดเอทานอล 50% เฮกเซนที่เตรียมไว้ เตรียมตัว
เฟสเคลื่อนที่ปริมาณต่างๆของชุดทดสอบ

บรรลุแยกเหมาะสมของ วิตามินเอ และอี เอสเทอร์ ที่ต้องการ
เป็น 600 จะใน 1 ใบ . ระยะเคลื่อนที่กรอง
ผ่านไฮดรัสโซเดียมซัลเฟต ( scharlau , บาร์เซโลนา , สเปน )
บนเยื่อกรองที่มีมาตรฐาน 0.45 โดยสูญญากาศเครื่องลดความชื้นของมัน และคุม
ดังนั้นการเก็บรักษาครั้ง
เฟสเคลื่อนที่เป็นอย่างต่อเนื่องเพื่อลดต้นทุนและรีไซเคิลสารเคมี
แทนเมื่อเวลาเก็บกัก หรือพื้นฐานของถูก

สังเกต ไขมันอิ่มตัว โซเดียม คลอไรด์ถูกเตรียมโดยการเพิ่ม 320 g
โซเดียม คลอไรด์ ( เมอร์ค darmstedt , เยอรมนี ) 1 ลิตร deionised
น้ำ มั่นใจบางแข็งยังคง undissolved .
วิตามินเอ กรดโพรพิโอนิก ( 2500000 IU / g ) ที่มาจาก BASF
( ส่วน 50096515 , Basel , Switzerland ) และเก็บไว้ในช่องแช่แข็งใน
แก๊สไนโตรเจน หุ้นโซลูชั่นของเกี่ยวกับ 625 IU / ml ได้ถูกเตรียมโดยละลาย 25 มิลลิกรัมไอโซโพรพานอล

100 มิลลิลิตร ( IPA ) ซึ่งประกอบด้วย100 – 200 มก. butylated ผลึกเรตไฮดรอกซีโทลูอีนเปรียบเทียบ ( BHT , Sigma
Aldrich เซนต์หลุยส์ , โม , USA ) ลดการสลายตัวของวิตามิน นี้
ถูกเก็บไว้ในที่มืดในตู้แช่ (  20  C ) เป็นเวลาถึงหกเดือน
และใช้เป็นมาตรฐานภายในวิตามินและวิตามิน Palmitate : อะซิเทต มันปรับใช้อีคิว ( 1 ) โดยการเจือจางของ 100 จะ

10 ml การวัดการดูดกลืนแสงที่ตามมากับ IPA ที่
325 nm .recalibration แสดงในสัปดาห์ การคำนวณ
ถูกแปลงมิลลิลิตร IU / อนุญาตให้คงที่ ( 1.00 ) ปัจจัยไม่ว่า As เอสเทอร์ถูกวัดการตอบสนอง

รวมทั้งเปลี่ยนตัวธรรมชาติเอสเทอร์ .
เรติน propionate ð IU = ml Þ¼ a325  104  100

ขอให้  0:359 ð 1 Þ

) ที่ a325 = การดูดกลืนแสงที่ 325 nm ( 1 ซม. )
1595 = การสูญพันธุ์สัมประสิทธิ์ใน IPA ที่ 325 nm
104 = การแปลงจาก LG / ml
0.359 = การแปลง LG IU สำหรับ As propionate
100 = เจือจางเพื่อใช้ค่า
Retinyl Palmitate และเรตินีล ซีเตทได้จาก
ซิกม่า–ดิช ( เซ็นต์หลุยส์ โม สหรัฐอเมริกา ) ที่ 690 , 000 IU / กรัม และ