(b). การยึดเกาะของ mouse แอนติ-ฮิวเ

(b). การยึดเกาะของ mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and
20E5 with full-length ฮิวเมน CD134 construct and various truncated ฮิวเมน
CD134 constructs expressed on 293-F cell line (domain mapping)
In order to analyze the fine specificity of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5, the location of เอพิโทป(s) recognized 25 by mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 was
determined by domain mapping. The ability of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 to bind to truncated ฮิวเมน CD134
constructs, expressed on the surface of (HEK-derived) 297-F cells, was determined
by FACS analysis.
30 Based on literature (Swiss-Prot: P43489.1; Latza et al. Eur J Immunol 1994;
24: 677-683; Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan et al.
Structure 2006; 14: 1321-1330; US Patent Publ. No. 2011/0028688 Al), ซิสเทอีน-
rich domains (CRD) and a hingelike structure in the ภายนอกเซลล์ region of ฮิวเมน

CD134 were identified. CRDs are coded CRD1, CRD2, (truncated) CRD3,
(truncated) CRD4 (see รูป 20). CRDs contain topologically distinct types of
modules, called an A-module and a B-module (see also รูป 20). A modules are C-
shaped structures, and B-modules are S-shaped structures. A typical CRD คือ
5 usually composed of A1-B2-modules หรือ A2-B1-modules (or, less frequently, a
different pair of modules, like Al-B1) with 6 conserved ซิสเทอีน residues, โดยที่
the numeral denotes the number of disulphide bridges within each module (see also
รูป 20). As shown in รูป 20, 5 different ฮิวเมน CD134 constructs were
generated and expressed: (1) full-length ฮิวเมน CD134 construct, which starts with 10 N-terminal CRD1 (i.e., CRD1 Al-B2-module covers amino acids 29-65), and
therefore denoted as `CRD1', and ประกอบรวมด้วยd amino acids 1-277 (see SEQ ID NO. 1),
(2) `CRD2' construct, which starts with N-terminal CRD2 (i.e., CRD2 Al B2-module
covers amino acids 66-107), and ประกอบรวมด้วยd amino acids 66-277 linked to signal
peptide amino acids 1-28 (see SEQ ID NO. 30), (3) `CRD3' construct, which starts 15 with N terminal CRD3 (i.e., CRD3 A1-Bl-module covers amino acids 108-146
(according to Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330) หรือ truncated CRD3
Al-module covers amino acids 108-126 (according to Latza et al. Eur J Immunol
1994; 24: 677-683)), and ประกอบรวมด้วยd amino acids 108-277 linked to signal peptide
amino acids 1-28 (see SEQ ID NO. 31), (4) `CRD4' construct, which consists of N-
20 terminal CRD4 หรือ CRD3 subdomain B1 module/truncated CRD4 Al-module (i.e.,
CRD4 Al-B1-module covers amino acids 127 167 (Latza et al. Eur J Immunol 1994;
24: 677-683) หรือ a combination (not shown in รูป 20) of CRD3 subdomain Bl-
module with truncated CRD4 Al-module covers amino acids 127-146 with amino
acids 147-167, ตามลำดับ (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330)), and 25 ประกอบรวมด้วยd amino acids 127-277 linked to signal peptide amino acids 1-28 (see SEQ
ID NO. 32), and (5) 'truncated (tc) CRD4' construct, which consists of N-terminal
truncated CRD4 หรือ CRD4 subdomain B1-module (i.e., truncated CRD4 Al module
covers amino acids 147-167 (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330) หรือ
CRD4 subdomain B 1-module (not shown in รูป 20; Latza et al. Eur J Immunol 30 1994; 24: 677-683) covers amino acids 147-167), and ประกอบรวมด้วยd amino acids 147-
277 linked to signal peptide amino acids 1-28 (see SEQ ID NO. 33). By assembly
PCR using AccuprimeTM Pfx DNA Polymerase (Invitrogen), these 5 ฮิวเมน CD134
constructs were generated using primers shown in the following table:
* Primer No. according to Bioceros internal coding system 15
Briefly, cDNA encoding amino acids 1-28 of signal peptide and cDNA
encoding amino acids 66-277 of ฮิวเมน CD134 were amplified using ตามลำดับ
primer pair 362/365 and 364/363 in a PCR reaction with full-length ฮิวเมน CD134
as a template. Subsequently, `CRD2' คอนสตรัคต์ was generated by using these two 20 PCR products in an assembly PCR using primer pair 362/363. The cDNA encoding
`CRD2' คอนสตรัคต์ was subcloned into a pcDNA3.1-derived expression plasmid using
suitable restriction sites. Similarly, `CRD3' คอนสตรัคต์ (amino acids 1-28 of signal
peptide linked to amino acids 108-277 of ฮิวเมน CD134), `CRD4' คอนสตรัคต์ (amino
acids 1-28 of signal peptide linked to amino acid 127 -277), and 'truncated CRD4' 25 คอนสตรัคต์ (amino acids 1-28 of signal peptide linked to amino acid 147-277) were
generated and subcloned in pcDNA3.1-derived expression plasmids using the
corresponding primers shown in abovementioned table. Furthermore, full-length
ฮิวเมน CD134 (SEQ ID NO. 1) was also re-cloned in a pcDNA3.1-derived
expression plasmid.
30 Using the FreeStyleTM 293 Expression System (Invitrogen), FreeStyleTM
293-F cells (Invitrogen) were transiently transfected with the 5 generated variants of ฮิวเมน CD134. After 48-72h, surface ฮิวเมน CD134 expression on transfected cells was analyzed by FACS analysis. To this end, transfected cells were harvested


and put at 1-2x106 cells/mL in ice chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated
with 20.0 lig/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and
20E5 for 30 minutes at 4°C. In parallel, 20.0 Rg/mL mouse IgGlic ไอโซไทป์ control
antibody (BD Biosciences) was used as a เนกาทีฟ control. After extensive washing 5 in PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:200 diluted PE-
conjugated goat แอนติ-mouse IgG (Fcy specific) antibodies (Jackson
ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30
minutes at 4°C. การยึดเกาะของ antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี
10 (FACSCalibur; BD Biosciences).
As shown in รูป 21, both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones
12H3 and 20E5 recognized full-length (denoted as `CRD l' คอนสตรัคต์) ฮิวเมน CD134
on transfected 293-F cells, whereas both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies
clones 12H3 and 20E5 showed no binding on mock-transfected 293-F cells.
15 Moreover, mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5 recognized
truncated ฮิวเมน CD134 variants that lacked CRD1 and CRD1-CRD2 (denoted as
`CRD2' คอนสตรัคต์ and `CRD3' คอนสตรัคต์, ตามลำดับ) on transfected 293-F cells. In
contrast, การยึดเกาะของ mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 against
truncated ฮิวเมน CD134 variant that lacked CRD1-CRD2-truncated CRD3 Al
20 module (denoted as `CRD4' คอนสตรัคต์) was very weak, and การยึดเกาะของ mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 against truncated ฮิวเมน CD134 variant that
lacked CRD1-CRD2-truncated CRD3 Al-module-CRD4 subdomain Al-module
(according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรือ
alternatively CRD1-CRD2-CRD3 Al B1 module (according to definition of
25 Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; denoted as `tcCRD4' คอนสตรัคต์) was
completely absent, whereas mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 showed
a strong binding against truncated ฮิวเมน CD134 variant that lacked CRD1-
CRD2-truncated CRD3 Al-module (denoted as `CRD4' คอนสตรัคต์) and against
truncated ฮิวเมน CD134 variant that lacked CRD1-CRD2-truncated CRD3 Al-
30 module-CRD4 subdomain Al-module (according to definition of Latza et al. Eur J
Immunol 1994; 24: 677 683) หรือ alternatively CRD1-CRD2-CRD3 Al-B1-module
(according to definition of Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; denoted
as `tcCRD4' คอนสตรัคต์).


These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies
clones 12H3 and 20E5 specifically recognized ฮิวเมน CD134 (comparison of full-
length ฮิวเมน CD134 transfection vs mock transfection). Furthermore, these
results demonstrated that mouse anti ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 5 20E5 seemed to recognize dissimilar ฮิวเมน CD134 เอพิโทป, which คือ evidenced by
respective lack of binding (using clone 12H3) vs strong binding (using clone 20E5)
with truncated ฮิวเมน CD134 variant that lacked CRD1 CRD2-truncated CRD3
Al-module (denoted as `CRD4' คอนสตรัคต์) and with truncated ฮิวเมน CD134
variant that lacked CRD1-CRD2-truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al-
10 module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677 683) or
alternatively CRD1-CRD2-CRD3 Al-B1-module (according to definition of
Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; denoted as `tcCRD4' คอนสตรัคต์).
These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3
did not seem to recognize a ฮิวเมน CD134 เอพิโทป in CRD1 and CRD2, and mouse 15 แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 did not seem to recognize a ฮิวเมน CD134
เอพิโทป in CRD1, CRD2, and truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al-
module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรือ
alternatively CRD1-CRD2-CRD3 Al B1 module (according to definition of
Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(ข) . การยึดเกาะของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12H 3 และ20E5 กับฮิวเมนปราศจาก CD134 สร้างต่าง ๆ ตัดฮิวเมนโครงสร้าง CD134 แสดงบรรทัด 293 F เซลล์ (โดเมนแม็ป)เพื่อวิเคราะห์ specificity ดีของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134แอนตี้โมโนโคลนอล clones 12H 3 และ 20E5, เอพิโทป(s) สถานที่รู้จัก 25 โดยเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12 H 3 และ 20E5 ถูก กำหนด โดยโดเมนการแม็ป ความสามารถของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนตี้โมโนโคลนอล clones 12H 3 และ 20E5 ผูกกับฮิวเมนตัด CD134 กำหนดโครงสร้าง แสดงบนพื้นผิวของเซลล์ 297-F (มา HEK) โดยการวิเคราะห์ FACSยึดเอกสารประกอบการ 30 (Prot สวิส: P43489.1 Latza et al. Eur J Immunol 199424:677-683 วิทยาศาสตร์วิศวกรรม Biochem แนวโน้ม Bodmer et al. 2002 27:19-26 Compaan et alปี 2006 โครงสร้าง 14:1321-1330 สหรัฐอเมริกาสิทธิบัตรหมายเลข Publ. 2011/0028688 Al), ซิสเทอีน -โดเมนรวย (CRD) และโครงสร้าง hingelike ในแคว้นภายนอกเซลล์ฮิวเมนมีระบุ CD134 CRDs มีรหัส CRD1, CRD2, CRD3 (ตัด)(ตัด) CRD4 (ดูรูปที่ 20) CRDs ประกอบด้วย topologically ประเภทของเรียกว่าโมดูล A เป็นโมดูลและบีโมดูล (ดูรูปที่ 20) โมดูลมี C- รูปโครงสร้าง และโมดูล B มีโครงสร้างเป็นรูปตัว S คือแบบ CRD โดยทั่วไป 5 มักจะประกอบด้วยโมดู B2 A1 หรือ A2 B1 โม (หรือ ไม่ บ่อย การ คู่แตกต่างกันของโมดูล เช่นอัล-B1) กับ 6 อยู่ตกซิสเทอีน โดยที่ ตัวเลขแสดงจำนวน disulphide สะพานภายในแต่ละโมดูล (โปรดดู รูป 20) ดังแสดงในรูปที่ 20, 5 ฮิวเมนอื่น CD134 โครงสร้างได้ สร้าง และแสดง: (1) ฮิวเมนปราศจาก CD134 สร้าง ซึ่งเริ่มต้น ด้วย 10 CRD1 N-เทอร์มินัล (เช่น CRD1 อัล-B2-โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 29-65), และสามารถบุจึง เป็น 'CRD1' และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 1-277 (ดูรหัสลำดับหมายเลข 1),(2) ' โครงสร้าง CRD2' ซึ่งเริ่มต้น ด้วย N-สถานี CRD2 (เช่น CRD2 อัลบี 2 โมดูล ครอบคลุมถึงกรดอะมิโน 66-107), และกรดอะมิโน 66-277 ประกอบรวมด้วยd กับสัญญาณ เพปไทด์กรดอะมิโน 1-28 (ดูลำดับรหัสหมายเลข 30) (3) 'CRD3' สร้าง ซึ่งเริ่มต้น 15 ด้วย N CRD3 เทอร์มินัล (เช่น CRD3 A1-Bl-โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 108 146 (ตาม Compaan et al. 2006 โครงสร้าง 14:1321-1330) หรือตัด CRD3 กรดอะมิโน 108-126 (ตาม Latza et al. Eur J Immunol ครอบคลุมโมดูอัล ปี 1994 24:677-683)), และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 108-277 กับสัญญาณเพปไทด์ กรดอะมิโน 1-28 (ดูลำดับรหัสหมายเลข 31) (4) 'CRD4' สร้าง ซึ่งประกอบด้วย N-20 สถานี CRD4 หรือ CRD3 โดเมนย่อยบี 1 โมดูล/ตัด CRD4 อัลโม (เช่น CRD4 กรดอะมิโน (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 127 167 ครอบคลุมโมดูอัล B1 24:677-683) หรือการรวมกัน (ไม่แสดงในรูปที่ 20) ของโดเมนย่อย CRD3 Bl - กรดอะมิโน 127 146 กับอะมิโนครอบคลุมโมดูลกับตัด CRD4 อัลโมดูล กรด 147-167 ตามลำดับ (Compaan et al. โครงสร้าง 2006; 14:1321-1330)), และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 25 127 277 กับสัญญาณเพปไทด์กรดอะมิโน 1-28 (ดูลำดับ รหัสหมายเลข 32), และ (5) ' ตัด (tc) CRD4' สร้าง ซึ่งประกอบด้วยสถานี N ตัด CRD4 หรือ CRD4 โดเมนย่อย (เช่น ตัดอัล CRD4 โมดูล B1-โมดูล กรดอะมิโน 147-167 ครอบคลุม (Compaan et al. โครงสร้าง 2006; 14:1321-1330) หรือ CRD4 โดเมนย่อย B 1 โมดูล (ไม่แสดงในรูปที่ 20 Latza et al. Eur J Immunol 30 ปี 1994 24:677-683) ครอบคลุมถึงกรดอะมิโน 147-167), และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 147 - 277 กับสัญญาณเพปไทด์กรดอะมิโน 1-28 (ดูลำดับรหัสหมายเลข 33) โดยมีสภา PCR โดยใช้ AccuprimeTM Pfx ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Invitrogen), ฮิวเมนเหล่านี้ 5 CD134 โครงสร้างถูกสร้างโดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางต่อไปนี้:* หมายเลขรองพื้น ตามรหัสระบบ 15 ภายใน Biocerosสั้น ๆ cDNA เข้า 28 1 กรดอะมิโนเพปไทด์สัญญาณและ cDNAกรดอะมิโน 66 277 ของฮิวเมนการเข้ารหัส CD134 ถูกขยายโดยใช้ตามลำดับคู่รองพื้น 362/365 และ 364/363 ในปฏิกิริยา PCR มีฮิวเมนปราศจาก CD134 เป็นแม่แบบ ในเวลาต่อมา 'CRD2' คอนสตรัคต์ถูกสร้างขึ้น โดยใช้เหล่านี้สอง 20 ผลิตภัณฑ์ PCR ในแอสเซมบลี PCR โดยใช้รองพื้นคู่ 362/363 การเข้ารหัส cDNA 'CRD2' คอนสตรัคต์เป็น subcloned เป็น plasmid มา pcDNA3.1 นิพจน์โดยใช้ ข้อจำกัดเหมาะสมไซต์ เหมือนกับ 'CRD3' คอนสตรัคต์ (กรดอะมิโน 1-28 ของสัญญาณ เพปไทด์กับกรดอะมิโน 108-277 ของฮิวเมน CD134), 'CRD4' คอนสตรัคต์ (อะมิโน กรด 1-28 ของเพปไทด์สัญญาณกับกรดอะมิโน 127-277), และ 'ตัด CRD4' 25 คอนสตรัคต์ (กรดอะมิโน 1-28 ของเพปไทด์สัญญาณที่เชื่อมโยงกับกรดอะมิโน 147-277) สร้าง และ subcloned plasmids นิพจน์ pcDNA3.1 มาใช้ในการ ไพรเมอร์ตรงที่แสดงในตารางดังกล่าวข้างต้น นอกจากนี้ ปราศจาก ฮิวเมน CD134 (ลำดับรหัสหมายเลข 1) ที่ยังใหม่โคลนใน pcDNA3.1 ได้รับ plasmid นิพจน์30 ใช้ FreeStyleTM 293 นิพจน์ระบบ (Invitrogen), FreeStyleTM293-F เซลล์ (Invitrogen) ถูก transfected กับตัวแปรสร้าง 5 ของฮิวเมน transiently CD134 หลัง 48-72h ฮิวเมนผิว CD134 นิพจน์ในเซลล์ transfected ถูกวิเคราะห์ โดยวิเคราะห์ FACS เพื่อการนี้ transfected เซลล์เก็บเกี่ยวและย้ายที่ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubated20.0 lig/mL เมาส์แอนติ-ฮิวเมนแอนตี้โมโนโคลนอล CD134 clones 12H 3 และ 20E5 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ขนาน Rg 20.0 mL IgGlic ไอโซไทป์ควบคุมเมาส์ แอนติบอดี (เวลาออก BD) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเนกาทีฟ หลังจากอ่านรีวิวซัก 5 ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1: 200 ทำให้ PE - แอนตี้ IgG (เฉพาะ Fcy) แอนติ-เมาส์แพะกลวง (Jackson ImmunoResearch) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 ใน 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส แอนตี้การยึดเกาะของถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี10 (FACSCalibur BD เวลาออก)ดังแสดงในรูปที่ 21 แอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนทั้งเมาส์ clones12H 3 และ 20E5 รู้ปราศจาก (สามารถบุเป็น 'CRD l' คอนสตรัคต์) ฮิวเมน CD134 บน transfected 293 F เซลล์ ในขณะทั้งเมาส์แอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมน clones 12H 3 และ 20E5 แสดงให้เห็นว่าไม่รวมในเซลล์ 293-F mock transfected 15 Moreover แอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์ clones 12H 3 และ 20E5 รู้ ตัดทอนตัวแปร CD134 ฮิวเมนที่ขาด (สามารถบุเป็น CRD2 CRD1 และ CRD1 'CRD2' คอนสตรัคต์ 'CRD3' และคอนสตรัคต์ ตามลำดับ) ในเซลล์ 293-F transfected ใน ความคมชัด การยึดเกาะของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลนราคา 12H 3 กับ ตัวแปร CD134 ฮิวเมนตัดที่อัล CRD3 CRD1-CRD2-ตัดขาด โมดูล 20 (ตาม 'CRD4' คอนสตรัคต์) ได้อ่อนมาก และการยึดเกาะของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 กับตัวแปร CD134 ฮิวเมนตัดที่ ขาดโดเมนย่อย CRD1-CRD2-ตัด CRD3 อัลโม-CRD4 อัล-โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677-683) หรือ หรือ CRD1-CRD2-CRD3 อัลบี 1 โมดูล (ตามคำนิยามของ ปี 2006 โครงสร้าง 25 Compaan et al. 14:1321-1330 สามารถบุเป็น 'tcCRD4' คอนสตรัคต์) ได้ ขาดทั้งหมด ในขณะที่เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 พบ ผูกแข็งแรงกับตัวแปร CD134 ฮิวเมนตัดที่ขาด CRD1- ตัด CRD2 CRD3 อัลโมดูล (ตาม 'CRD4' คอนสตรัคต์) และ ตัวแปร CD134 ฮิวเมนตัดที่ขาด CRD1-CRD2-ตัด CRD3 อัล-โมดูล CRD4 30 โดเมนย่อยอัล-โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994 24:677 683) หรืออีกวิธีหนึ่งคือ CRD1-CRD2-CRD3 อัล-B1-โมดูล (ตามคำนิยามของ Compaan et al. ปี 2006 โครงสร้าง 14:1321-1330 สามารถบุ เป็น 'tcCRD4' คอนสตรัคต์)ผลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์ที่แอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนclones 12H 3 และฮิวเมน 20E5 โดยเฉพาะรู้จัก CD134 (เปรียบเทียบเต็ม- ความยาวฮิวเมน CD134 transfection vs ล้อ transfection) นอกจากนี้ เหล่านี้ ผลลัพธ์แสดงว่าเมาส์ป้องกันฮิวเมน CD134 แอนตี้โคลน 12H 3 และ 5 20E5 ที่ดูเหมือนจะ รับรู้ไม่เหมือนฮิวเมน CD134 เอพิโทป คือที่เป็นหลักฐานด้วย เกี่ยวข้องขาดการผูก (ใช้โคลน 12H 3) vs ผูกแข็งแรง (ใช้โคลน 20E5) กับตัวแปร CD134 ฮิวเมนตัดที่ขาดตัด CRD1 CRD2 CRD3 โมดูอัล (ตาม 'CRD4' คอนสตรัคต์) และ มีฮิวเมนตัด CD134 ตัวแปรที่ขาดโดเมนย่อย CRD1-CRD2-ตัด CRD3 A1-โม-CRD4 อัล-โมดูล 10 (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677 683) หรือหรือ CRD1-CRD2-CRD3 อัล-B1-โมดูล (ตามคำนิยามของปี 2006 โครงสร้าง Compaan และ al. 14:1321-1330 สามารถบุเป็น 'tcCRD4' คอนสตรัคต์) ว่าผลเหล่านี้แสดงว่าเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 ไม่ได้ดูเหมือนไม่ รู้จักฮิวเมนเป็น CD134 เอพิโทป CRD1 และ CRD2 และเมาส์ 15 แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ไม่ได้ดูเหมือนไม่ รู้จักฮิวเมนเป็น CD134 เอพิโทป CRD1, CRD2 และโดเมนย่อย CRD3 A1-โม-CRD4 ตัดอัล- โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677-683) หรือ หรือ CRD1-CRD2-CRD3 อัลบี 1 โมดูล (ตามคำนิยามของ ปี 2006 โครงสร้าง Compaan และ al. 14:1321-1330)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

(ข) การยึดเกาะของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ
20E5 ที่มีความยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 สร้างต่าง ๆ ที่ถูกตัดทอนฮิวเมน
CD134 โครงสร้างแสดงบน 293-F สายพันธุ์ของเซลล์ (การทำแผนที่โดเมน)
เพื่อที่จะวิเคราะห์ความจำเพาะที่ดีของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5, สถานที่ตั้งของเอพิโทป (s) ได้รับการยอมรับ 25 โดยใช้เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโน โคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5
ถูกกำหนดโดยการทำแผนที่โดเมน ความสามารถของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ผูกกับตัดทอนฮิวเมน CD134
สร้างแสดงบนพื้นผิวของ (HEK มา) เซลล์ 297-F
ที่ถูกกำหนดโดยมาซึ่ง. การวิเคราะห์
30 จากวรรณกรรม (สวิส Prot: P43489.1; Latza et al, Eur J Immunol 1994.
24: 677-683; Bodmer et al, แนวโน้ม Biochem วิทย์ 2002; 27:.. 19-26; Compaan et al,
โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330; สิทธิบัตรสหรัฐอเมริกาเลขที่ Publ 2011/0028688 อัล), ซิสเทอีน -
โดเมนที่อุดมไปด้วย (CRD) และโครงสร้าง hingelike ในภูมิภาคภายนอกเซลล์ของฮิวเมนCD134 ถูกระบุ CRDs จะเขียน CRD1, CRD2 (ตัด) CRD3, (ตัด) CRD4 (ดูรูปที่ 20) CRDs มีประเภทที่แตกต่างทอพอโลยีของโมดูลที่เรียกว่าA-โมดูลและ B-โมดูล (ดูรูปที่ 20) โมดูล C- มีโครงสร้างที่มีรูปร่างและB โมดูลจะมีโครงสร้างเป็นรูปตัว S ทั่วไป CRD คือ5 มักจะประกอบด้วย A1-B2 โมดูลหรือ A2-B1 โมดูล (หรือน้อยเป็นคู่ที่แตกต่างกันของโมดูลเช่นAl-B1) มี 6 อนุรักษ์ซิสเทอีนตกค้างโดยที่เลขหมายถึงจำนวนสะพาน disulphide ในแต่ละโมดูล (ดูรูปที่20) ดังแสดงในรูปที่ 20 แตกต่างกัน 5 ฮิวเมนโครงสร้าง CD134 ถูกสร้างขึ้นและแสดง(1) ยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 สร้างซึ่งเริ่มต้นด้วย 10 CRD1 n- ขั้ว (เช่น CRD1 Al-B2 โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 29-65) และแสดงจึงเป็น`CRD1 'และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 1-277 (ดูรหัส SEQ NO. 1), (2)` CRD2' สร้างซึ่งเริ่มต้นด้วย CRD2 n- ขั้ว (เช่น CRD2 อัลบี 2 โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน66-107) และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 66-277 สัญญาณที่เชื่อมโยงกับกรดอะมิโนเปปไทด์1-28 (ดูรหัส SEQ NO. 30), (3) `CRD3 'สร้างซึ่ง เริ่มต้นด้วย 15 ไม่มีขั้ว CRD3 (เช่น CRD3 A1-Bl โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 108-146 (ตาม Compaan et al, โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330) หรือตัดทอน CRD3 อัลโมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 108-126 ( ตาม Latza et al, Eur J Immunol. 1994; 24: 677-683)) และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 108-277 ที่เชื่อมโยงกับสัญญาณเปปไทด์. กรดอะมิโนที่ 1-28 (ดูรหัส SEQ NO 31), (4) `CRD4 'สร้างซึ่งประกอบด้วย N-20 ขั้ว CRD4 หรือ CRD3 ย่อยโมดูล B1 / ตัด CRD4 อัลโมดูล (เช่นCRD4 Al-B1 โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 127 167 (Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรือการรวมกัน (ไม่ได้แสดงในรูปที่ 20) ของ CRD3 ย่อย Bl- โมดูลที่ถูกตัดทอน CRD4 อัลโมดูลครอบคลุมกรดอะมิโนที่มี 127-146 อะมิโนกรด147-167, ตามลำดับ (Compaan . et al, โครงสร้าง 2006; 14: 1321-1330)) และ 25 ประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 127-277 ที่เชื่อมโยงกับสัญญาณอะมิโนเปปไทด์กรด 1-28 (ดู SEQ ID NO 32) และ (5) 'ที่ถูกตัดทอน (. TC) CRD4 'สร้างซึ่งประกอบด้วย n- ขั้วที่ถูกตัดทอนหรือCRD4 CRD4 ย่อย B1 โมดูล (เช่นตัดโมดูลอัล CRD4 ครอบคลุมกรดอะมิโน 147-167 (Compaan et al, โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330) หรือโดเมนย่อยCRD4 บี 1 โมดูล (ไม่ปรากฏในรูป 20; Latza et al, Eur J Immunol 30 1994; 24:. 677-683) ครอบคลุมกรดอะมิโน 147-167) และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 147- 277 ที่เชื่อมโยงกับอะมิโนเปปไทด์ส่งสัญญาณ กรด 1-28 (ดูรหัส SEQ NO. 33) โดยการชุมนุมPCR โดยใช้ดีเอ็นเอ AccuprimeTM PFX โพลิเมอร์ (Invitrogen) 5 เหล่านี้ฮิวเมน CD134 โครงสร้างที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางต่อไปนี้: * จำนวนรองพื้นตามระบบการเข้ารหัสภายใน 15 Bioceros สั้น ๆ , การเข้ารหัส cDNA กรดอะมิโนที่ 1-28 ของ เปปไทด์ของสัญญาณและยีนเข้ารหัสกรดอะมิโน66-277 ของฮิวเมน CD134 ถูกขยายตามลำดับโดยใช้คู่ไพรเมอร์362/365 และ 364/363 ในปฏิกิริยา PCR ที่มีความยาวเต็มฮิวเมน CD134 เป็นแม่แบบ ต่อจากนั้น `CRD2 'คอนสตรัคต์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ทั้งสอง 20 ผลิตภัณฑ์ PCR ในการชุมนุม PCR โดยใช้คู่ไพรเมอร์ 362/363 ยีนเข้ารหัส`CRD2 'คอนสตรัคต์ได้ subcloned เป็นพลาสมิดแสดงออก pcDNA3.1 ที่ได้มาจากการใช้เว็บไซต์ข้อจำกัด ที่เหมาะสม ในทำนองเดียวกัน `CRD3 'คอนสตรัคต์ (กรดอะมิโนที่ 1-28 ของสัญญาณเปปไทด์ที่เชื่อมโยงกับกรดอะมิโน108-277 ของฮิวเมน CD134)` CRD4' คอนสตรัคต์ (อะมิโนกรด1-28 ของสัญญาณเปปไทด์ เชื่อมโยงกับกรดอะมิโน 127 -277) และ 'ตัด CRD4 25 คอนสตรัคต์ (กรดอะมิโนที่ 1-28 ของสัญญาณเปปไทด์ที่เชื่อมโยงกับกรดอะมิโน 147-277) ถูกสร้างขึ้นและsubcloned ในการแสดงออก pcDNA3.1 พลาสมิดที่ได้มาจากการใช้ไพรเมอร์ที่สอดคล้องกันที่แสดงในตารางข้างต้น นอกจากนี้ยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 (ID SEQ NO. 1) ยังเป็นโคลนอีกครั้งใน pcDNA3.1 ที่ได้มาจากพลาสมิดแสดงออก. 30 การใช้ FreeStyleTM 293 ระบบการแสดงออก (Invitrogen) FreeStyleTM เซลล์ 293-F (Invitrogen) ถูก transfected transiently กับสายพันธุ์ที่ 5 สร้างของฮิวเมน CD134 หลังจาก 48-72h พื้นผิวฮิวเมนแสดงออก CD134 เซลล์ transfected ได้รับการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์มาซึ่ง ด้วยเหตุนี้เซลล์ transfected เก็บเกี่ยวและใส่ที่1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็นพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 20.0 lig / mL เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 30 นาทีที่ 4 ° C ในแบบคู่ขนาน 20.0 Rg / mL เมาส์ IgGlic ไอโซไทป์ควบคุมแอนติบอดี(BD ชีววิทยาศาสตร์) ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเนกาทีฟ หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าที่ 5 ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 1: 200 ปรับลด PE- แพะผันแอนติ -mouse IgG (FCY เฉพาะ) แอนติบอดี (แจ็คสันImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C การยึดเกาะของแอนติบอดีที่ได้รับการวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี10 (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์). ดังแสดงในรูปที่ 21 ทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี12H3 และ 20E5 ได้รับการยอมรับยาวเต็มรูปแบบ (แสดงเป็น `CRD ลิตร 'คอนสตรัคต์) ฮิวเมน CD134 ใน transfected เซลล์ 293-F ในขณะที่ทั้งสองเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดี. โคลน 12H3 และ 20E5 พบว่าไม่มีผลผูกพันกับจำลอง transfected เซลล์ 293-F 15 นอกจากนี้เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ได้รับการยอมรับที่ถูกตัดทอนฮิวเมนพันธุ์CD134 ที่ขาด CRD1 และ CRD1-CRD2 (แสดงเป็น`CRD2 'คอนสตรัคต์และ` CRD3' คอนสตรัคต์ , ตามลำดับ) ในเซลล์ transfected 293-F ในทางตรงกันข้ามการยึดเกาะของเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 กับตัวแปรที่ถูกตัดทอนฮิวเมนCD134 ที่ขาด CRD1-CRD2-ตัด CRD3 อัล20 โมดูล (แสดงเป็น `CRD4 'คอนสตรัคต์) เป็น อ่อนแอมากและการยึดเกาะของเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 กับตัวแปรที่ถูกตัดทอนฮิวเมน CD134 ที่ขาดCRD1-CRD2-ตัด CRD3 อัลโมดูล CRD4 ย่อยอัลโมดูล(ตามคำนิยามของ Latza . et al, Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรืออีกทางเลือกหนึ่งCRD1-CRD2-CRD3 อัลโมดูล B1 (ตามคำนิยามของ25 Compaan et al, โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330; แสดงเป็น `tcCRD4 'คอนสต รัคต์) เป็นขาดอย่างสมบูรณ์ขณะที่เมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 แสดงให้เห็นว่ามีความแข็งแกร่งที่มีผลผูกพันกับตัดทอนฮิวเมนCD134 ตัวแปรที่ขาด CRD1- CRD2-ตัด CRD3 อัลโมดูล (แสดงเป็น `CRD4 'คอน สตรัคต์) และต่อต้านตัดฮิวเมนCD134 ตัวแปรที่ขาด CRD1-CRD2-ตัด CRD3 Al- 30 โมดูลย่อย CRD4 อัลโมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al, Eur J. Immunol 1994; 24: 677 683) หรืออีกทางเลือกหนึ่ง CRD1-CRD2-CRD3 Al-B1 โมดูล(ตามคำนิยามของ Compaan et al, โครงสร้าง 2006 14: 1321-1330; เขียนแทน. เป็น `tcCRD4 'คอนสตรัคต์) ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน12H3 และได้รับการยอมรับโดยเฉพาะ 20E5 ฮิวเมน CD134 (เปรียบเทียบเต็มความยาวของฮิวเมนtransfection CD134 เทียบ transfection จำลอง ) นอกจากนี้เหล่านี้ผลการแสดงให้เห็นว่าเมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 5 20E5 ดูเหมือนจะรับรู้ที่แตกต่างกันฮิวเมน CD134 เอพิโทปซึ่งคือหลักฐานโดยขาดตามลำดับของผลผูกพัน(โดยใช้การโคลนนิ่ง 12H3) เทียบกับที่แข็งแกร่งมีผลผูกพัน (โดยใช้การโคลนนิ่ง 20E5) กับตัดทอนฮิวเมน CD134 ตัวแปรที่ขาด CRD1 CRD2-ตัด CRD3 อัลโมดูล (แสดงเป็น `CRD4 'คอนสตรัคต์) และมีการตัดทอนฮิวเมน CD134 ตัวแปรที่ขาด CRD1-CRD2-ตัด CRD3 A1 โมดูล -CRD4 ย่อย Al- 10 โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677 683) หรืออีกทางเลือกหนึ่งCRD1-CRD2-CRD3 Al-B1 โมดูล (ตามคำนิยามของCompaan et al, โครงสร้าง 2006. 14: 1321-1330; แสดงเป็น `tcCRD4 'คอนสตรัคต์). ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ไม่ได้ดูเหมือนจะรู้จักฮิวเมน CD134 เอพิโทปใน CRD1 และ CRD2 และเมาส์ 15 แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 ไม่ได้ดูเหมือนจะรู้จักฮิวเมน CD134 เอพิโทปใน CRD1, CRD2 และตัดทอน CRD3 A1-โมดูลย่อย CRD4 Al- โมดูล (ตาม ความหมายของ Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรืออีกทางเลือกหนึ่งCRD1-CRD2-CRD3 อัลโมดูล B1 (ตามคำนิยามของCompaan et al, โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( ข ) การยึดเกาะของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 และ
20e5 กับเต็มตัวฮิวเมน cd134 สร้างต่าง ๆ และตัดฮิวเมน
cd134 โครงสร้างที่แสดงในเซลล์ 293-f ( แผนที่โดเมน )
เพื่อวิเคราะห์ได้เฉพาะแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน และ 20e5 12h3 ,สถานที่ตั้งของเอพิโทป ( s ) ที่รู้จัก 25 โดยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและถูกกำหนดโดย 12h3 20e5
แผนที่โดเมน ความสามารถของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและ 12h3 20e5 ผูกปลายตัด ฮิวเมน cd134
โครงสร้าง ที่แสดงออกบนผิว ( hek มา ) 297-f เซลล์ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ facs
.
30 ตามวรรณคดี ( สวิสก่อน : p43489.1 ; latza et al . Eur J immunol 1994 ;
24 : 677-683 ; bodmer et al . แนวโน้มเกี่ยวกับชีวเคมีวิทยาศาสตร์ 2002 ; 27 : 19-26 ; compaan et al .
โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1321-1330 ; เราสิทธิบัตร PUBL . หมายเลข 2011 / 0028688 AL ) ซิสเทอีน -
รวยโดเมน ( CRD ) และโครงสร้าง hingelike ในภูมิภาคภายนอกเซลล์ของฮิวเมน

cd134 ระบุ . crds เขียน crd1 crd2 ( ตัด ) crd3 , , , crd4
( ตัด ) ( ดู 20 รูป ) crds ประกอบด้วย topologically แตกต่างกันประเภทของ
โมดูลที่เรียกว่า a-module และ b-module ( เห็นรูป 20 ) เป็นโมดูล C -
รูปร่าง โครงสร้าง และ b-modules รูปโครงสร้าง โดยทั่วไปความ (
5 มักจะประกอบด้วย a1-b2-modules ค็อค a2-b1-modules ( หรือน้อยกว่า ,
คู่ของโมดูลที่แตกต่างกัน เช่น al-b1 ) กับ 6 ปีซิสเทอีนตกค้าง , โดยที่
ตัวเลขแสดงจำนวน = สะพานภายในแต่ละโมดูล ( เห็น
รูป 20 ) แสดง 20 รูป cd134 , ฮิวเมนแตกต่างกัน 5 โครงสร้างถูก
สร้างและแสดง ( 1 ) เต็มตัวฮิวเมน cd134 สร้างซึ่งเริ่มต้นด้วย 10 ถูก crd1 ( เช่นcrd1 al-b2-module ครอบคลุมกรดอะมิโน 29-65 ) และ
ดังนั้นกล่าวคือเป็น ` crd1 ' และประกอบรวมด้วย D กรดอะมิโนเซียวเหล่งนึ่ง ( ดู seq id หมายเลข 1 )
( 2 ) ` crd2 ' สร้างกรดอะมิโน ซึ่งเริ่มต้นด้วย crd2 ( เช่น crd2 อัล B2
ครอบคลุมโมดูลกรดอะมิโน 66-107 ) และประกอบรวมด้วย D กรดอะมิโน 66-277 เชื่อมโยงสัญญาณ
เปปไทด์ กรดอะมิโน 1-28 ( ดู seq id หมายเลข 30 ) , ( 3 ) ` crd3 ' สร้างซึ่งจะเริ่ม 15 กับเทอร์มินัล crd3 ( เช่น crd3 A1 BL โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 108-146
( ตาม compaan et al . โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1321-1330 ) ค็อคตัดทอน crd3
อัลโมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 108-126 ( ตาม latza et al . immunol Eur J
1994 ; 24 : 677-683 ) และประกอบรวมด้วย D กรดอะมิโน 108-277 เชื่อมโยงสัญญาณเปปไทด์ กรดอะมิโน 1-28
( เห็น seq id หมายเลข 31 )( 4 ) ` crd4 ' สร้าง ซึ่งประกอบด้วย n -
20 สถานี crd4 ค็อค crd3 ย่อย B1 โมดูล / ตัด crd4 อัลโม ( I ,
crd4 al-b1-module ครอบคลุมกรดอะมิโน 127 167 ( latza et al . Eur J immunol 1994 ;
24 : 677-683 ) ค็อครวมกัน ( ไม่แสดงใน 20 รูป ) ของ crd3 ซับโดเมน BL -
โมดูลด้วยตัดทอน crd4 อัลโมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 127-146 กับอะมิโนกรด 147-167
,ตามลำดับ ( compaan et al . โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1321-1330 ) และ 25 ประกอบรวมด้วย D กรดอะมิโน 127-277 เชื่อมโยงสัญญาณเปปไทด์ กรดอะมิโน 1-28 ( ดู seq
ID หมายเลข 32 ) และ ( 5 ) การสื่อสาร ( TC ) crd4 ' สร้าง ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโน
ตัด crd4 ค็อค crd4 โมดูลย่อย B1 ( เช่น ตัด crd4 ล โมดูล
ครอบคลุมกรดอะมิโน 147-167 ( compaan et al .โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1321-1330 ) ค็อค
crd4 ย่อย B 1-module ( ไม่แสดงใน 20 รูป latza et al . Eur J immunol 30 ปี 1994 ; 24 : 677-683 ) ครอบคลุมกรดอะมิโน 147-167 ) และประกอบรวมด้วย D กรดอะมิโน 147 -
277 เชื่อมโยงสัญญาณเปปไทด์ กรดอะมิโน 1-28 ( ดู seq id หมายเลข 33 ) โดยวิธี PCR ที่ใช้ประกอบ
accuprimetm pfx DNA polymerase ( Invitrogen ) 5 ฮิวเมน cd134
สร้างขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงอยู่ในตารางต่อไปนี้ :
* รองพื้นไม่ ตาม bioceros ภายในการเข้ารหัสระบบ 15
สั้น , การโคลนยีนของเปปไทด์และกรดอะมิโน 1-28 สัญญาณการเข้ารหัสยีน
กรดอะมิโน 66-277 ของฮิวเมน cd134 กำลังขยายการใช้ไพรเมอร์คู่ตามลำดับ
362 / 365 364 / 363 ในปฏิกิริยา PCR กับฮิวเมนเต็มตัว cd134
เป็นแม่แบบต่อมา " crd2 ' คอนสตรัคต์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้เหล่านี้ 2 20 PCR ผลิตภัณฑ์ในการประกอบวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ 362 / 363 . การโคลนยีน
` crd2 ' คอนสตรัคต์คือของใน pcdna3.1-derived การแสดงออกโดยใช้พลาสมิด
เหมาะสมข้อ จำกัด เว็บไซต์ ในทำนองเดียวกัน " crd3 ' คอนสตรัคต์ ( กรดอะมิโน 1-28 สัญญาณ
เชื่อมโยงไปยังกรดอะมิโนเปปไทด์ 108-277 ของฮิวเมน cd134 ) ' ' ( กรดอะมิโน crd4 คอนสตรัคต์
1-28 สัญญาณเปปไทด์เชื่อมกรดอะมิโน 127 - 277 ) , และ ' ' ปลาย crd4 25 คอนสตรัคต์ ( กรดอะมิโน 1-28 สัญญาณเชื่อมโยงกรดอะมิโนเปปไทด์ 147-277 ) ถูกสร้างขึ้นในการแสดงออกของ pcdna3.1-derived

) โดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ดังกล่าวข้างต้น นอกจากนี้ เต็มตัว
ฮิวเมน cd134 ( seq id หมายเลข 1 ) ยังเป็นโคลนในการแสดงออก pcdna3.1-derived

30 โดยใช้พลาสมิด freestyletm 293 การแสดงออกระบบ ( Invitrogen ) freestyletm
293-f เซลล์ ( Invitrogen ) เป็นบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราว transfected กับ 5 สร้างสายพันธุ์ของฮิวเมน cd134 . 48-72h หลัง ,ฮิวเมนการแสดงออกในเซลล์ผิว cd134 transfected วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ facs . ทั้งนี้ transfected เซลล์เก็บ


และใส่ใน 1-2x106 เซลล์ / มล. ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับ 20.0 lig / ml เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 และ
20e5 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา ในแบบคู่ขนาน 20