2.3. Detection of G-6-PD gene mutat

2.3. Detection of G-6-PD gene mutations
Genomic DNAwas extracted fromperipheral blood leukocytes using DNAzol kit (Invitrogen Corp.). The DNA concentration of each sample was quantified with the GE NanoVue spectrophotometer (AZoNetwork UK Ltd.) and adjusted to 10 ng/μl for RFLP-PCR assays. G-6-PD gene mutations screened were G-6-PD Viangchan (871 G N A) (the most common variant in the Thai population [12]), G-6-PD Mahidol (487 G N A), G-6-PD Canton (1376 C N T), G-6-PD Union (1360 C N T),
G-6-PD Kaiping (1388 G N A), G-6-PD Chinese-4 (392 G N T), G-6-PD Chinese-5 (1024 C N T) and G-6-PD Gaohe (95 A N G). Primers used were as described previously. PCR was performed in a 25 μl reaction mixture containing 1× PCR buffer, 1 U Taq polymerase (Invitrogen Corporation), 20 ng of each primer pair, 1.5 mmol/l MgCl2, 200 μmol/l each dNTP and 50 ng of DNA template. PCR thermocycling (conducted in TProfessional standard thermocycler; Biometra GmbH) conditions were as follows: 95 °C for 5 min; 35 cycles of 95 °C for 60 s, 56–62 °C (depending on Tm of the primer pair) for 45 s and 72 °C for 45 s; and a final step of 72 °C for 5 min. Then 5 μl aliquots of the amplicons were digested with 5 U of the appropriate restriction endonuclease in a 10 μl reaction volume at 37 °C for 3 h. A 5 μl aliquot from each of the reaction mixture was analyzed by 3% agarose gel-electrophoresis, and the DNA fragments were stained with ethidium bromide and visualized under UV light.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน G-6-PDDNAwas การแยก fromperipheral เลือดหญิงใช้ชุด DNAzol (Invitrogen Corp.) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอของแต่ละอย่างถูกวัด ด้วย spectrophotometer GE NanoVue (AZoNetwork UK จำกัด) และปรับเป็น 10 ฉบับ/μl สำหรับ RFLP-PCR assays กลายพันธุ์ของยีน G-6-PD ฉายถูก G-6-PD เวียงจันทน์ (871 G N A) (แบบทั่วไปตัวแปรในประชากรไทย [12]), G-6-PD มหิดล (487 G N A), G-6-PD Canton (1376 C N T) G-6-PD สหภาพ (1360 C N T),ไคผิง G-6-PD (1388 G N A), G-6-PD จีน-4 (392 G N T), G-6-PD จีน-5 (1024 C N T) และ G-6-PD Gaohe (95 N G) ไพรเมอร์ที่ใช้ได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ทำ PCR ในปฏิกิริยา 25 μl ที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR × 1, 1 U Taq พอลิเมอเรส (Invitrogen Corporation), 20 ฉบับของแต่ละคู่ไพรเมอร์ 1.5 mmol/l MgCl2, 200 ไมโครโมล/ลิตรละ dNTP และ 50 ฉบับของดีเอ็นเอแม่แบบ เทอร์โม゚ PCR (ดำเนินการใน TProfessional มาตรฐาน thermocycler Biometra GmbH) เงื่อนไขมีดังนี้: 95 ° C เป็นเวลา 5 นาที รอบ 35 95 ° c 60 s, 56-62 ° C (ขึ้นอยู่กับ Tm ของคู่ไพรเมอร์) สำหรับ s และ 72 ° C สำหรับ 45 45 s และขั้นสุดท้ายของ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที แล้ว 5 aliquots μl ของ amplicons ถูกย่อยสลาย ด้วย 5 U ของ endonuclease จำกัดที่เหมาะสมในโวลุ่มปฏิกิริยา μl 10 ที่ 37 ° C เป็นเวลา 3 ชม Μl 5 ทั้งจากของผสมปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์ โดย 3% agarose เจอิ และชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium ดู และภายใต้แสงยูวี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน G-6-PD
DNAwas จีโนมสกัดเม็ดเลือดขาวในเลือด fromperipheral ใช้ชุด DNAzol (Invitrogen คอร์ป) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอของแต่ละกลุ่มตัวอย่างที่มีปริมาณจีอี NanoVue spectrophotometer (AZoNetwork UK Ltd. ) และปรับถึง 10 ng / ไมโครลิตรสำหรับ RFLP-PCR ตรวจ G-6-PD การกลายพันธุ์ของยีนคัดเลือกเป็น G-6-PD Viangchan (871 GNA) (ตัวแปรที่พบมากที่สุดในประชากรไทย [12]), G-6-PD มหิดล (487 GNA) G-6-PD แคนตัน (1376 CNT), G-6-PD ยูเนี่ยน (1360 CNT),
G-6-PD Kaiping (1388 GNA) G-6-PD จีน 4 (392 GNT) G-6-PD จีน-5 (1024 CNT) และ G-6-PD Gaohe (95 ANG) ไพรเมอร์ที่ใช้ถูกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ PCR ที่ได้ดำเนินการใน 25 ไมโครลิตรผสมปฏิกิริยาที่มี 1 ×บัฟเฟอร์ PCR 1 U Taq โพลิเมอร์ (Invitrogen คอร์ปอเรชั่น) 20 NG ของแต่ละคู่ไพรเมอร์ 1.5 มิลลิโมล / ลิตร MgCl2 200 ไมโครโมล / ลิตรแต่ละ dNTP และ 50 NG ของแม่แบบดีเอ็นเอ PCR thermocycling (ดำเนินการใน TProfessional thermocycler มาตรฐาน Biometra GmbH) เงื่อนไขมีดังนี้ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 35 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 วินาที, 56-62 ° C (ขึ้นอยู่กับ Tm คู่ไพรเมอร์) 45 และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที และขั้นตอนสุดท้ายของ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น 5 aliquots ไมโครลิตรของ amplicons ถูกย่อยด้วย 5 U ของ endonuclease ข้อ จำกัด ที่เหมาะสมในปริมาณ 10 ไมโครลิตรปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 ชั่วโมง หาร 5 ไมโครลิตรจากแต่ละผสมปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์โดย 3% agarose เจลอิเลคและชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกย้อมด้วย ethidium bromide และมองเห็นภายใต้แสงยูวี

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน g-6-pdจีโนม dnawas สกัด fromperipheral เลือดเม็ดเลือดขาวที่ใช้ dnazol Kit ( Invitrogen Corp . ) DNA ความเข้มข้นของแต่ละตัวอย่างถูกวัดกับ GE nanovue Spectrophotometer ( azonetwork UK Ltd . ) และปรับให้ 10 กรัม / ลิตร สำหรับ rflp-pcr μ ) . g-6-pd ยีนกลายพันธุ์กันเป็น g-6-pd เวียงจันทร์ ( 475 กรัม N ) ( ตัวแปรที่พบบ่อยที่สุดในประชากรไทย [ 12 ] ) , g-6-pd มหาวิทยาลัยมหิดล ( 487 G n ) , g-6-pd Canton ( 1273 ซี เอ็น ที ยูเนี่ยน ( 1360 ) g-6-pd ซี เอ็น ที )g-6-pd Kaiping ( 908 กรัม N ) , g-6-pd chinese-4 ( 392 กรัม N T ) g-6-pd chinese-5 ( 1024 C n t ) และ g-6-pd ถ่านหิน ( 95 N G ) ไพรเมอร์ใช้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ร่วมแสดงใน 25 μ L ปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR 1 × 1 วูทัค Polymerase ( Invitrogen Corporation ) 20 นาโนแต่ละ primer คู่ 1.5 mmol / L ชุด 200 μ mol / L แต่ละ dntp และ 50 ของแม่แบบดีเอ็นเอ ( 1 ) ผื่นแดงใน tprofessional มาตรฐานเทอร์มอไซเคล ์ ; biometra GmbH ) เงื่อนไขดังนี้ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที ; 35 รอบ 95 องศา C นาน 60 วินาที , 56 และ 62 องศา C ( ขึ้นอยู่กับ TM ของไพรเมอร์คู่ ) 45 และ 72 ° C เป็นเวลา 45 วินาที และขั้นตอนสุดท้ายของ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาทีแล้ว 5 μผมเฉยๆของ amplicons ถูกย่อยด้วย 5 U ของเอนโดนิวคลีเอสจำกัดที่เหมาะสมใน 10 μปฏิกิริยาปริมาณที่ 37 ° C ชั้น 3 ซ. 5 μ L ส่วนลงตัวจากแต่ละปฏิกิริยาผสมโดยใช้ 3% เจลอิเลคโตรโฟรีซีสและดีเอ็นเอถูกเปรอะเปื้อน กับทิเดียมโบรไมด์และมองเห็นภายใต้แสงยูวี