It has been recognized that disturb

It has been recognized that disturbed regulation of the cell
cycle is a hallmark of tumor growth.15,22—24) After the treatment
of HeLa cells with 1, 3, 6 and 10 mM rhinacanthone for
4 and 8 h, the percentages of sub G1 hypodiploid cells were
rapidly increased in a dose-dependent manner, whereas the
appearances of the population of cells in the G2/M phase
were slightly increased at only the lowest concentration
(1 mM) in both of indicated time periods (Fig. 5). These results
are agreed with our previous report that rhinacanthins,
another naphthoquinone compounds found in this plant, inhibited
cell proliferation by G2/M cell cycle arrest, although
these compounds had a higher concentration and took a
longer period of time in HeLaS3-treated cells.12) Subsequently,
we confirmed rhinacanthone-induced apoptosis by
means of a biparametric cytofluorometric analysis using annexin
V-FITC and PI staining assay. Consistent with these results,
the percentages of early apoptotic cells (annexin-V
positive and PI negative) increased dose-dependently (2.93—
22.1%), compared to control group (0.88%) after 4 h of rhinacanthone
exposure. Extended time exposure to 8 h, the percentages
of late stage of apoptotic and/or dead cells (annexin-V
and PI-positive) reached about 96.1% at the highest
concentration of 10 mM rhinacanthone (Fig. 6). In view of our
observations, these data suggest that rhinacanthone-induced
apoptosis in HeLa cells led to cell cycle arrest at G2/M phase
at the earlier stage. When the DNA damage in this cell occurred,
it may be irreparable and therefore force the arrest
cells into apoptosis. Similarly, b-lapachone treatment also
caused large increase in sub G1 DNA contents as potent as
rhinacanthone under the same treatment conditions (Fig. 5C);
however its effect on specific phase of cell cycle was not observed.
This observation corresponds to the non-specific cell
cycle arrest caused by b-lapachone treatment in human
breast cancer (MCF-7),43) suggesting that its effect may depend
on the types of cancer cells. In addition, many previous
studies reported that b-lapachone induced cell cycle arrest at
G1 or S phase, unlike most of DNA damaging agents or DNA
topoisomerase poisons which always arrest cancer cells at
G2/M transition.44—46) Therefore, the presence of other pathways
may contribute to strong growth inhibitory effect of blapachone,
which has different actions from the rhinacanthone-treated
HeLa cells. Further studies are needed to determine
the mechanism of DNA damage and pinpoint the pivotal
regulator(s) of the pathway mediated by rhinacanthone
in HeLa cells.
In the mammalian cells, mitochondria are involved in the
apoptosis signal transduction pathway. Release of cytochrome
c and AIF from mitochondria to cytosol, followed by
induction of caspase-9 dependent activation of caspase has
been identified in the process of mitochondria-dependent
apoptosis.20—23) The Bcl-2 family proteins (pro-apoptotic and
anti-apoptotic proteins) and caspase protenases are critical
regulator of the apoptotic pathway.30) Many reports have
demonstrated that translocation of pro-apoptotic Bax to mitochondria
can alter the permeability of cytochrome c or caspases,
e.g., caspases-9, -8, and -3, then activate postmitochondrial
caspase cascade leading to apoptotic cell
death.31) Consistent with this process, our present study provided
that the treatment of HeLa cells by rhinacanthone
(6 mM) for 2, 4, and 8 h, markedly decreased in the expression
of Bcl-2 protein, whereas Bax protein expression was increased,
thereby increased in Bax/Bcl-2 ratio. Moreover, the
treatment reduced the levels of pro-caspase-9 and pro-caspase-3
proteins, whereas it increased levels of active forms of
caspase-9 and caspase-3 (Fig. 8). In the previous report, b-lapachone
also induced apoptosis in bladder cancer cells by
modulation of Bcl-2 family and caspases.47) These findings
imply the possible involvement of intrinsic pathway which is
mediated by caspase-dependent pathway.
Survivin is a member of the IAP protein family that regulates
cell division and suppresses apoptosis.33—35) It contains
1258 Vol. 32, No. 7
Fig. 8. Caspase Activation by the Treatment of HeLa Cells with Rhinacanthone
Cells were treated with 6 mM rhinacanthone for 2, 4 and 8 h and then harvested. Total
cell lysates were prepared and 25 mg of proteins were separated on 12% SDS-PAGE
and transferred to a nitrocellulose membrane. Protein levels of caspases were detected
by Western blot analysis using antibodies against procaspase-3, active caspase-3 and
caspase-9. b-Actin was used to confirm that equal amounts of protein were in each
lane. Data shown are from a representative of three independent experiments with similar
results.
a BIR-domain (Baculoviral IAP repeat) essential for interaction
with pro-apoptotic proteins, such as caspases (caspases-
3 and -7). Survivin is unique among the IAP proteins because
it exhibits cell cycle-regulated expression that peaks at
G2/M phase. Down-regul

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มันได้รับการยอมรับว่ารบกวนระเบียบของเซลล์
วงจรคือจุดเด่นของ growth.15,22-24 เนื้องอก) หลังจากการรักษา
ของเซลล์ HeLa กับ 1, 3, 6 และ 10 มิลลิ rhinacanthone สำหรับ
4 และ 8 ชั่วโมงที่ผ่านมาร้อยละของการย่อย G1 เซลล์ hypodiploid ถูก
เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วในลักษณะปริมาณขึ้นอยู่กับในขณะที่
การปรากฏตัวของประชากรของเซลล์ใน G2 ที่ / M เฟส
เพิ่มขึ้นเล็กน้อยเพียงความเข้มข้นต่ำสุด
(1 มิลลิเมตร) ทั้งในช่วงเวลาที่ระบุ (รูปที่. 5) . ผลลัพธ์เหล่านี้
จะเห็นด้วยกับรายงานก่อนหน้านี้ของเราที่ rhinacanthins,
สารประกอบ naphthoquinone อื่นที่พบในพืชชนิดนี้สามารถยับยั้ง
การเพิ่มจำนวนเซลล์โดยการจับกุม G2 / M เซลล์วงจรแม้ว่า
สารเหล่านี้มีความเข้มข้นสูงกว่าและเอา
เวลานานของเวลาในเซลล์ HeLaS3 รับการรักษา 12) ต่อจากนั้น
เราได้รับการยืนยันการตายของเซลล์ rhinacanthone ที่เกิดขึ้นโดย
ใช้วิธีการวิเคราะห์โดยใช้ cytofluorometric biparametric annexin
V-FITC และ PI การย้อมสีการทดสอบ สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้
ร้อยละของเซลล์ apoptotic ต้น (annexin-วี
ในเชิงบวกและเชิงลบ PI) เพิ่มปริมาณ dependently (2.93-
22.1%) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (0.88%) หลังจาก 4 ชั่วโมง rhinacanthone
การสัมผัส การสัมผัสเวลานานถึง 8 ชั่วโมงเปอร์เซ็นต์
ของขั้นตอนปลายของเซลล์ที่เกิด apoptosis และ / หรือตาย (annexin-V
และ PI บวก) ถึงประมาณ 96.1% ที่สูงสุด
ความเข้มข้น 10 มิลลิ rhinacanthone (รูปที่. 6) ในมุมมองของเรา
สังเกตข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า rhinacanthone เหนี่ยวนำให้เกิด
การตายของเซลล์ในเซลล์ HeLa นำไปสู่การจับกุมวงจรมือถือที่ระยะ G2 / M
ในขั้นตอนก่อนหน้านี้ เมื่อทำลายดีเอ็นเอในเซลล์นี้เกิดขึ้น
ก็อาจจะไม่สามารถแก้ไขได้และดังนั้นจึงบังคับให้จับกุม
เซลล์เข้าสู่การตายของเซลล์ ในทำนองเดียวกันการรักษา B-lapachone ยัง
ก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นมากในเนื้อหาย่อย G1 ดีเอ็นเอที่มีศักยภาพเป็น
rhinacanthone ภายใต้เงื่อนไขที่รักษาเดียวกัน (รูป 5C.)
. แต่ส่งผลกระทบต่อขั้นตอนที่เฉพาะเจาะจงของวงจรมือถือก็ไม่ได้สังเกต
การสังเกตนี้สอดคล้องกับที่ไม่ใช่ เซลล์เฉพาะ
การจับกุมวงจรที่เกิดจากการรักษา B-lapachone ในมนุษย์
มะเร็งเต้านม (MCF-7) 43) ชี้ให้เห็นว่าผลกระทบที่อาจขึ้นอยู่
กับชนิดของเซลล์มะเร็ง นอกจากนี้ก่อนหน้านี้หลาย
การศึกษารายงานว่า B-lapachone เหนี่ยวนำให้เกิดการจับกุมวงจรมือถือที่
G1 หรือ S เฟสแตกต่างมากที่สุดของตัวแทนที่สร้างความเสียหายดีเอ็นเอหรือดีเอ็นเอ
สารพิษ topoisomerase ซึ่งมักจะจับกุมเซลล์มะเร็งที่
G2 / M transition.44-46) ดังนั้นการแสดงตน วิถีอื่น ๆ
อาจนำไปสู่ผลการเจริญเติบโตที่แข็งแกร่งของการยับยั้ง blapachone,
ซึ่งมีการกระทำที่แตกต่างจาก rhinacanthone รับการรักษา
เซลล์ HeLa การศึกษาเพิ่มเติมที่มีความจำเป็นในการกำหนด
กลไกของการเสียหายของดีเอ็นเอและหาการพิจาณา
ควบคุม (s) ของทางเดินไกล่เกลี่ยโดย rhinacanthone
ในเซลล์ HeLa.
ในเซลล์สัตว์, mitochondria มีส่วนร่วมใน
สัญญาณการตายของเซลล์พลังงานทางเดิน การเปิดตัวของ cytochrome
C และ AIF จาก mitochondria เพื่อเซลล์ตามด้วย
การชักนำของ caspase-9 ยืนยันการใช้งานขึ้นอยู่กับ caspase ได้
รับการระบุในกระบวนการของ mitochondria ขึ้นอยู่กับ
apoptosis.20-23) เดอะ Bcl-2 โปรตีนครอบครัว (โปร apoptotic และ
ป้องกัน โปรตีน -apoptotic) และ protenases caspase มีความสำคัญ
ควบคุมของ pathway.30 apoptotic) รายงานหลายคนได้
แสดงให้เห็นว่าการโยกย้ายของ Pro-apoptotic แบ็กซ์เพื่อ mitochondria
สามารถปรับเปลี่ยนการซึมผ่านของ cytochrome C หรือ caspases ที่
เช่น caspases-9, -8 และ -3 แล้วเปิดใช้งาน postmitochondrial
น้ำตก caspase นำไปสู่เซลล์ apoptotic
death.31) สอดคล้องกับขั้นตอนนี้การศึกษาในปัจจุบันของเราให้ไว้
ว่าการรักษาของเซลล์ HeLa โดย rhinacanthone
(6 มิลลิเมตร) สำหรับ 2, 4 และ 8 ชั่วโมงลดลงอย่างเห็นได้ชัดใน การแสดงออก
ของ Bcl-2 โปรตีนในขณะที่แบ็กซ์การแสดงออกของโปรตีนสูงขึ้น
จึงเพิ่มขึ้นในแบ็กซ์ / Bcl-2 อัตราส่วน นอกจากนี้ยังมี
การรักษาลดระดับของ Pro-caspase-9 และ Pro-caspase-3
โปรตีนในขณะที่มันเพิ่มระดับของรูปแบบการใช้งานของ
caspase-9 และ caspase-3 (รูปที่. 8) ในรายงานก่อนหน้านี้ B-lapachone
ยังเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์มะเร็งกระเพาะปัสสาวะโดย
การปรับ Bcl-2 ครอบครัวและ caspases.47) การค้นพบนี้
บ่งบอกถึงการมีส่วนร่วมเป็นไปได้ของทางเดินที่แท้จริงซึ่งเป็น
ผู้ไกล่เกลี่ยโดยทางเดิน caspase ขึ้นอยู่กับ.
survivin เป็นสมาชิกของ ครอบครัวโปรตีน IAP ที่ควบคุมการ
แบ่งตัวของเซลล์และยับยั้ง apoptosis.33-35) มันมี
1,258 ฉบับ 32, ฉบับที่ 7
รูป 8. Caspase การเปิดใช้งานโดยการรักษาเซลล์ HeLa กับ Rhinacanthone
เซลล์ได้รับการรักษาที่มี 6 มิลลิ rhinacanthone สำหรับ 2, 4 และ 8 ชั่วโมงแล้วเก็บเกี่ยว รวม
lysates เซลล์ได้จัดทำและ 25 มิลลิกรัมของโปรตีนที่ถูกแยกออกเมื่อวันที่ 12% SDS-PAGE
และโอนไปยังเมมเบรน nitrocellulose ระดับโปรตีนของ caspases ถูกตรวจพบ
โดยการวิเคราะห์ดวงตะวันโดยใช้แอนติบอดีต่อ procaspase-3, ปราดเปรียว caspase-3 และ
caspase-9 B-โปรตีนถูกใช้ในการยืนยันว่าปริมาณที่เท่ากันของโปรตีนที่อยู่ในแต่ละ
ช่องทาง ข้อมูลที่แสดงจากตัวแทนของการทดลองสามอิสระที่มีที่คล้ายกัน
ผล.
BIR โดเมน (IAP Baculoviral ซ้ำ) ที่จำเป็นสำหรับการทำงานร่วมกัน
กับโปรตีน Pro-apoptotic เช่น caspases (caspases-
3 -7) survivin จะไม่ซ้ำกันในหมู่โปรตีน IAP เพราะ
มันจัดแสดงนิทรรศการเซลล์แสดงออกวงจรควบคุมที่ยอดที่
ระยะ G2 / M ลง regul