For large-scale preparation of ESA

For large-scale preparation of ESA proteins,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับการเตรียมขนาดใหญ่ของประเทศโปรตีน < 5´109 tachyzoites ถูกเก็บเกี่ยวจากวัฒนธรรม lysed สดของ HFFเซลล์และหินใน HBSS 10 มม. HEPES และ 0.1 มม. EGTA (HHE) ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูก resuspended ใน PBS, pH7.4 ประกอบด้วย 0.1% (v/v) FBS และถูกกระตุ้นปลด micronemes ด้านนอกของเอทานอลเพื่อเป็น ® nal เข้มข้น 1.0% (v/v) และร้อนถึง C 378 ใน 30 นาที (Carruthers et al., 1999) เซลล์ถูกลบ โดย centrifugation 2000g และ supernatant เรียกประเทศ ถูกเก็บไว้สำหรับผูกทดลอง ต้องทำรายการ micronemes, < 5´109 tachyzoites HHE เป็นเหนือเก็บเกี่ยวผลผลิต และการใช้โพรโทคอลที่ได้รับจากการศึกษาก่อนหน้า (Dubremetz และ Dissous, 1980) แยกส่วน sonication และเซลล์ Brie¯y ปรสิตได้ resuspended ใน HHE เย็นที่ < 109mlÿ1 และ sonicated บนน้ำแข็ง [3´30s กะพริบที่ตั้ง 35 บน sonicator BioSonik III (Bronwill Scienti ® c) พร้อมกับ microprobe] หลังจาก sonication เศษโทรศัพท์มือถือขนาดใหญ่ถูกเอาออก โดย centrifugation ที่ g 2000 สำหรับ 10 นาทีที่ 48C และ supernatant ถูกเพิ่มเติม clari ® ed โดยปั่นที่ 8000g สำหรับ 20 นาทีที่ 48 ค Micronemes ถูกกู้คืนมาจาก 8000g supernatant โดย centrifugation ที่ 30000g ใน 30 นาทีที่ 48 ค เม็ด 30000g ถูก resuspended ใน PBS, pH6.0 ประกอบด้วยค็อกเทลของรติเอส inhibitors (1mgmlÿ1 E64, 10mgmlÿ1 APMSF, 10mgmlÿ1 TLCK, 1mgmlÿ1 leupeptin) และต้องสามรอบ freeze±thaw อย่างรวดเร็ว การระงับได้แล้ว sonicated สำหรับ 3´15s โดยใช้การตั้งค่าสูงสุดสำหรับ sonicator microprobe (550 เสียง Dismembrator ตื่น Scienti ® c) การระงับได้ centrifuged ที่ 100000g สำหรับ h 1 เพื่อลบ micronemes ไม่เสียหายและสาร และ supernatant ที่ประกอบด้วยโปรตีนละลายน้ำได้อย่างอิสระ microneme ถูกเก็บไว้สำหรับการทดลองเซลล์ผูก ประเทศ Theproteincontentof และ wasdetermined การเตรียมโปรตีน themicroneme ใช้โปรตีนเป็น assay (เพียร์ซ) เตรียมโปรตีนถูกเก็บไว้ที่ ÿ708C และ aliquoted จนกว่าจะใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับการเตรียมขนาดใหญ่ของโปรตีนอีเอสเอ <5'109 tachyzoites เก็บเกี่ยวจากวัฒนธรรม lysed สดใหม่ของ HFF
เซลล์และล้างใน HBSS มี 10 mM HEPES และ 0.1mm EGTA (HHE) ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูก resuspended ในพีบีเอส pH7.4 ที่มี 0.1% (v / v) FBS และกระตุ้นให้ปล่อย micronemes โดยนอกเหนือจากเอทานอลจะมีความเข้มข้น®nal 1.0% (v / v) และภาวะโลกร้อนที่จะ 378C สำหรับ 30 นาที (คาร์รูเธอ et al., 1999) เซลล์ที่ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 2000 g และใสที่เรียกว่าอีเอสเอได้รับการเก็บรักษาไว้สำหรับการทดลองที่มีผลผูกพัน ในการชำระล้างเนื้อหาของ micronemes ที่ <5'109 tachyzoites ถูกเก็บเกี่ยวใน HHE ข้างต้นและเป็นไป sonication และแยกเซลล์โดยใช้โปรโตคอลที่ได้มาจากการศึกษาก่อนหน้านี้ (Dubremetz และ Dissous, 1980) Briey ปรสิตถูก resuspended ใน HHE เย็น <109mlÿ1และ sonicated ในขณะที่น้ำแข็ง [พั 3'30s ที่ 35 การตั้งค่าบน BioSonik คลื่นเสียงที่สาม (Bronwill Scienti®c) พร้อมกับ microprobe เป็น] หลังจาก sonication เศษโทรศัพท์มือถือที่มีขนาดใหญ่ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 2000 g สำหรับ 10 นาทีที่ 48C และใสถูกclari®edต่อไปโดยการปั่นที่ 8000G สำหรับ 20min ที่ 48C micronemes หายจากสารละลาย 8000G โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 30000g สำหรับ 30 นาทีที่ 48C เม็ด 30000g ถูก resuspended ในพีบีเอส pH6.0, ค๊อกเทลที่มีสารยับยั้งน้ำย่อย (1mgmlÿ1 E64, 10mgmlÿ1 APMSF, 10mgmlÿ1 TLCK, 1mgmlÿ1 leupeptin) และเป็นไปสามแช่แข็งอย่างรวดเร็ว±รอบละลาย ที่ถูกระงับ sonicated แล้ว 3'15s โดยใช้การตั้งค่าสูงสุดสำหรับ microprobe คลื่นเสียง (550 โซนิค Dismembrator; Scienti®cฟิสเชอร์) ระงับถูกหมุนเหวี่ยงที่ 100000g สำหรับ 1 ชั่วโมงที่จะลบ micronemes ติดต่อกันและเยื่อและสารละลายที่มีโปรตีนที่ละลายน้ำได้อย่างอิสระ microneme ถูกเก็บรักษาไว้สำหรับการทดลองเซลล์ที่มีผลผูกพัน Theproteincontentof อีเอสเอและการเตรียมโปรตีน themicroneme wasdetermined ใช้ทดสอบโปรตีน (เพียร์ซ) การเตรียมโปรตีนถูก aliquoted และเก็บไว้ที่ÿ708Cจนถึงการใช้งาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเตรียมโปรตีน ESA ขนาดใหญ่ < 5 ใหม่สด ๆเก็บจาก 109 tachyzoites lysed วัฒนธรรมของ hff
เซลล์และล้างใน hbss ที่มีฮีเปส 10mm - หน่วย ( และเขา ) ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์มี resuspended ในพีบีเอส ph7.4 ที่มี 0.1 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) FBS และกระตุ้นให้ออก micronemes โดยการเติมเอทานอลให้®นาล ความเข้มข้นของ 10 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) และเริ่ม 378c ( สำหรับ 30 นาที คาร์รัทเธอร์ et al . , 1999 ) เซลล์ถูกเอาออกโดยการเหวี่ยงแยกที่ 2000g และน่าน เรียกว่า ESA ถูกเก็บไว้สำหรับการทดลองมีผลผูกพัน เนื้อหาของ micronemes ให้บริสุทธิ์ ,< 5 ใหม่ 109 tachyzoites ถูกเก็บเกี่ยวในเขาข้างบน และต้อง sonication และองค์ประกอบของเซลล์โดยใช้โปรโตคอลที่ได้มาจากการศึกษาก่อนหน้านี้ ( dubremetz และ dissous , 1980 ) บรี ¯ Y , พยาธิอยู่ในที่เย็น resuspended เขา < 109ml ÿ 1 และ sonicated ในขณะที่ [ 3 น้ำแข็งใหม่ 30 กะพริบที่ 35 ในการ biosonik III เครื่องเขย่าแบบเสียง ( bronwill scienti ® C ) พร้อมกับไมโครโพรบ ] sonication หลัง ,เศษเซลล์ขนาดใหญ่จะถูกลบออกโดยการเหวี่ยงแยกที่ 2000g สำหรับวันที่ 48c และนำเพิ่มเติม คลารี®เอ็ดโดยปั่นที่ 8000g สำหรับ 20 นาทีที่ 48c . micronemes หายจาก 8000g นำโดยปั่นที่ 30000g สำหรับ 30 นาทีที่ 48c . 30000g เม็ดเป็น resuspended ในพีบีเอส ph6.0 ที่มีค็อกเทลของโปรตีเอสอินฮิบิเตอร์ ( 1mgml ÿ 1 e64 10mgml ÿ 1 apmsf , ,10mgml ÿ 1 tlck 1mgml , ÿ 1 ลูเพปติน ) และถูกตรึง±ละลายอย่างรวดเร็ว สามรอบ ถูกระงับแล้ว sonicated 3 ใหม่ 15s โดยใช้การตั้งค่าสูงสุดสำหรับไมโครโพรบเครื่องเขย่าแบบเสียง ( 550 โซนิค dismembrator ; ฟิชเชอร์ scienti ® C ) ถูกระงับ 100000g สำหรับระดับที่ 1 เพื่อลบและ micronemes ไม่เสียหายขนาดและโปรตีนที่มีปริมาณสูง microneme อิสระยังคงผูกพันเซลล์ทดลอง theproteincontentof ESA และการเตรียมโปรตีน themicroneme ทดสอบโดยใช้โปรตีน assay ( แทง ) การเตรียมโปรตีน คือ aliquoted และเก็บไว้ที่ÿ 708c
จนใช้