Western Blot Assay of Cellular Prot

Western Blot Assay of Cellular Proteins. Cellular proteins extracted from control and drug treated THP-1 cells can also be measured. The washed cell pellets will be resus- pended in extraction lysis buffer (50mM HEPES pH 7.0, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.5 mM dithiothreitol, 5 mM NaF, and 0.5 mM Na orthovanadate) containing 5 μg/mL each of leupeptin and aprotinin and incubated with 15 min at 4◦C. After removal of cell debris by microcentrifugation, supernatants can quickly freeze. Protein concentration will be determined by protein assay reagent according to the manufacture’s instruction. 40–50 μg of cellular proteins from treated and untreated cell extracts will be electroblotted onto nitrocellulose membrane following separation on a 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel elec- trophoresis. The immunoblot will be incubated overnight with blocking solution (5% skim milk) at 4◦C, followed by incubation for 4 h with a 1 : 500 dilution of monoclonal anti- iNOS and COX-2 antibody (Santacruz, CA, USA). Blots will be washed twice with PBS and incubated with a 1 : 1000 dilution of horseradish peroxidase-conjugated goat anti- mouse IgG secondary antibody (Santacruz, CA, USA) for 1h at room temperature. Blots will be rewashed thrice in Tween 20/Tris buffered saline (TTBS) and then developed by enhanced chemiluminescence (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาของโปรตีนเซลลูลาร์ โปรตีนที่สกัดจากยาเสพติดและควบคุมโทรศัพท์มือถือถือว่า THP-1 เซลล์สามารถจะวัดได้ ขี้หินเซลล์จะเป็น resus pended สกัด lysis บัฟเฟอร์ (50 มม. HEPES pH 7.0, NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40 ฟลูออไรด์ phenylmethylsulfonyl 1 มม. 0.5 มม. dithiothreitol, 5 มม. NaF และ 0.5 mM orthovanadate นา 250 mM) มี 5 μg/mL แต่ละ leupeptin และ aprotinin และ incubated ด้วย 15 นาทีที่ 4◦C หลังจากเอาเศษเซลล์โดย microcentrifugation, supernatants สามารถอย่างรวดเร็วตรึง ความเข้มข้นของโปรตีนจะถูกกำหนด โดยรีเอเจนต์ทดสอบโปรตีนตามคำสั่งการผลิต Μg 40 – 50 ของเซลลูลาร์โปรตีนจากสารสกัดจากเซลล์บำบัด และไม่ถูกรักษาจะ electroblotted ลงบนเมมเบรน nitrocellulose ตามแยกในแบบ 10% โซเดียม dodecyl ซัลเฟต (SDS) -เจ polyacrylamide elec-trophoresis จะ incubated immunoblot จะค้างคืนกับบล็อกโซลูชัน (5% skim นม) ที่ 4◦C ตาม ด้วยฟักตัว h 4 กับเจือจาง 1:500 สำหรับป้องกัน iNOS โมโนและแอนติบอดีค็อกซ์-2 (Santacruz, CA, USA) กันบล็อทจะล้าง ด้วย PBS สอง และ incubated มีการเจือจาง 1:1000 ของ horseradish peroxidase กลวงแพะป้องกันเมาส์ IgG รองแอนติบอดี (Santacruz, CA, USA) สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จะ rewashed เลยใน Tween 20/ทริ สเรทติ้ง buffered น้ำเกลือ (TTBS) และพัฒนาแล้ว กันบล็อท โดยเพิ่ม chemiluminescence (Amersham วิทยาศาสตร์ อาร์ลิงตันไฮทส์ IL สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดวงตะวัน Assay ของโปรตีนเซลลูลาร์ โปรตีนสกัดจากโทรศัพท์มือถือและยาเสพติดการควบคุมการรักษาเซลล์ THP-1 ยังสามารถวัดได้ เม็ดล้างเซลล์จะ resus- pended ในบัฟเฟอร์สลายสกัด (50mm HEPES พีเอช 7.0, 250 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 5 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40, ฟลูออไร phenylmethylsulfonyl 1 มิลลิ, 0.5 มิลลิ dithiothreitol 5 มิลลิ NaF และ 0.5 มิลลิ นา orthovanadate) ที่มี 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรแต่ละ leupeptin และ Aprotinin และบ่มกับ 15 นาทีที่4◦C หลังจากที่กำจัดเศษเซลล์โดย microcentrifugation, supernatants ได้อย่างรวดเร็วสามารถตรึง ความเข้มข้นของโปรตีนจะถูกกำหนดโดยการทดสอบสารโปรตีนตามคำสั่งผลิตของ 40-50 ไมโครกรัมต่อโทรศัพท์มือถือของโปรตีนจากสารสกัดจากเซลล์ได้รับการรักษาและได้รับการรักษาจะได้รับการ electroblotted บนเมมเบรน nitrocellulose ต่อไปนี้ในการแยกโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 10% (SDS) -polyacrylamide เจลการไฟฟ้า trophoresis immunoblot จะได้รับการบ่มค้างคืนกับวิธีการแก้ปัญหาการปิดกั้น (5% นมพร่องมันเนย) ที่4◦Cตามด้วยการบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมงกับ 1: 500 ลดสัดส่วนของโมโนโคลนอลต่อต้าน iNOS และแอนติบอดี COX-2 (ซานตากรูซ, CA, USA) blots จะได้รับการล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสและบ่มด้วย 1: 1000 การลดสัดส่วนของ IgG มะรุมแพะ peroxidase-ผันเมาส์แอนติบอดีต่อต้านรอง (ซานตากรูซ, CA, USA) สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง blots จะ rewashed สามครั้งใน Tween 20 / ทริสบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (TTBS) แล้วพัฒนาโดย chemiluminescence เพิ่มขึ้น (Amersham วิทยาศาสตร์ชีวภาพอาร์ลิงตันไฮทส์, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blot assay ของโปรตีนในเซลล์ โปรตีนสกัดจากเซลล์และการควบคุมยารักษา thp-1 เซลล์ยังสามารถวัด การล้างเซลล์เม็ดจะรีซัส - pended ในการสกัดการสลายบัฟเฟอร์ ( 50mm ฮีเปส pH 7.0 , 250 มม. ขนาด 5 mM EDTA , 0.1% nonidet p-40 1 มม. phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ 0.5 มม. บัตรแข็ง , 5 มม. นาฟและ 05 มมนา orthovanadate ) ประกอบด้วย 5 μ g / ml แต่ละลูเพปตินกับ aprotinin บ่มด้วย 15 นาทีที่ 4 ◦ C หลังจากการกำจัดเศษเซลล์โดย microcentrifugation supernatants , ได้อย่างรวดเร็วสามารถตรึง ความเข้มข้นของโปรตีนจะถูกกำหนดโดยโครงสร้างโปรตีนพบจากคำแนะนำของผลิต40 – 50 μกรัม โปรตีนจากสารสกัดเซลล์และเซลล์ที่ได้รับสารจะ electroblotted บนเมมเบรนไนโตรตามแยกใน 10% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS - polyacrylamide gel ) Elec - trophoresis . มมูโนบล็จะบ่มค้างคืนกับที่กั้นทางออก ( 5% skim milk ) ที่ 4 ◦ C ตามบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมงกับ 1500 การเจือจางของโมโนโคลนอลแอนติบอดี และ anti - inos cox-2 ( ซานตาครูซ , CA , USA ) ไม้จะล้างสองครั้งกับ PBS บ่มด้วย 1 : 1000 2 . เอนไซม์ conjugated แพะ anti - เมาส์ระดับแอนติบอดี IgG ( ซานตาครูซ , CA , USA ) สำหรับ 1 ที่อุณหภูมิห้องไม้จะ rewashed Tween 20 / 2 หรือ 3 ครั้งในน้ำเกลือ ( ttbs ) แล้วพัฒนาโดยนโยบายแรงงานเพิ่มขึ้น ( ที่ชีวิตวิทยาศาสตร์ , Arlington Heights , IL , USA )