The HSP 47 assay based on the enzym

The HSP 47 assay based on the enzymatic activity of β-galactosidase (Isoda et al., 2003), driven by the
hsp47 gene promoter, aims to determine the stress response of HSP 47-transformed cells due to samples
addition. HSP 47-transformed cells were trypsinized and plated onto 96-well plates at initial
concentrations of 1×104 cells per well in 100 μL of F12 Medium (Gibco®, Invitrogen) supplemented with
10% FBS, 200 μg/mL of G418 (Gibco BRL) and 0.1 μg/mL kanamycin solution (Sigma). The cells were
allowed to attach for 48 h before removing medium and adding 100 μL of samples diluted with medium
followed by incubation for 3 h in a 5% CO2 incubator at 37 °C. The wastewater samples were added at 5
concentrations 0.01, 0.1, 1, 5, 10 and 20% (V/V). For the highest concentrations, additional controls (5,
10 and 20% PBS(-), data not shown) were considered as references in order to consider the sample effect
exclusively. The medium was then carefully removed and the cells washed twice with PBS(-). Fifty
microliters of lysis buffer (Promega) was then added and the plates incubated for 30 min at room
temperature (RT). Twenty microliters of cell lysate was transferred to a new plate, to which 100 μL of
substrate solution (10 mM NaH2PO4•2H2O, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0.005% NaN3, 1 mM MgCl2•6H2O,
1% 4-methylumbelliferyl-β-galactose (MUG), pH 7.0) was added in order to trigger the conversion of
MUG into β-galactose and methylumbelliferyl. After allowing the reaction to occur in the dark for 30
min at RT, 60 μl of reaction stop buffer (1 M glycine-NaOH, pH 10.3) was added and the fluorescence at
365 nm excitation/ 450 nm emission was then determined using a multidetection microplate reader.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ HSP 47 ตามกิจกรรมเอนไซม์ในระบบของβ-galactosidase (Isoda et al., 2003), ขับเคลื่อนด้วยการโปรโมเตอร์ของยีน hsp47 มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบการตอบสนองต่อความเครียดของ HSP 47 แปลงเซลล์เนื่องจากตัวอย่างนอกจากนี้ HSP 47 แปลงเซลล์ trypsinized และเคลือบลงบนแผ่น 96 ดีที่เริ่มต้นความเข้มข้นของ 1 × 104 เซลล์ต่อดีใน μL 100 ของ F12 กลาง (Gibco ® Invitrogen) เสริมด้วย10% FBS, μg 200 mL ของ G418 (Gibco BRL) และ 0.1 μg/mL โซลูชั่นกานามัยซิน (ซิกมา) เซลล์ได้สามารถแนบสำหรับ h 48 ก่อนเอาออกสื่อ และเพิ่ม μL 100 ตัวอย่างผสมกับสื่อตามที่คณะทันตแพทยศาสตร์สำหรับ h 3 ใน incubator 5% CO2 ที่ 37 องศาเซลเซียส มีเพิ่มตัวอย่างน้ำทิ้งที่ 5ความเข้มข้น 0.01, 0.1, 1, 5, 10 และ 20% (V/V) สำหรับความเข้มข้นสูงสุด ควบคุมเพิ่มเติม (510 และ 20% PBS(-) ข้อมูลที่ไม่แสดง) ได้ถือเป็นข้อมูลอ้างอิงเพื่อพิจารณาผลกระทบอย่างโดยเฉพาะการ สื่อแล้วลบออกอย่างระมัดระวัง และเซลล์ล้างสองครั้ง ด้วย PBS(-) ห้าสิบแล้วเพิ่ม microliters lysis บัฟเฟอร์ (Promega) และแผ่น incubated สำหรับห้อง 30 นาทีอุณหภูมิ (RT) Microliters 20 ของเซลล์ lysate ถูกถ่ายโอนไปจานใหม่ การ μL ที่ 100 ของแก้ปัญหาพื้นผิว (10 มม. NaH2PO4•2H2O, NaCl บีเอสเอ 1%, 0.005% NaN3, 1 มม. MgCl2•6H2O, 100 มม.% 4-methylumbelliferyl-β-กาแล็กโทส (MUG) 1, pH 7.0) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อทำการแปลงMUG β-กาแล็กโทสและ methylumbelliferyl หลังจากช่วยให้ปฏิกิริยาเกิดขึ้นในมืดสำหรับ 30เพิ่มนาทีที่ RT, μl 60 บัฟเฟอร์หยุดปฏิกิริยา (1 M glycine NaOH, pH 10.3) และ fluorescence ที่365 nm ในการกระตุ้น / 450 nm มลพิษแล้วกำหนดใช้อ่าน multidetection microplate

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

HSP 47 ทดสอบขึ้นอยู่กับเอนไซม์ของβ-galactosidase (ISODA et al., 2003) โดยได้แรงหนุน
ก่อการยีน hsp47 มีเป้าหมายที่จะตรวจสอบการตอบสนองต่อความเครียดของ HSP เซลล์ 47 เนื่องจากการเปลี่ยนตัวอย่าง
นอกจากนี้ HSP 47 เปลี่ยนเซลล์ถูก trypsinized และชุบลงบนแผ่น 96 หลุมเริ่มต้นที่
ความเข้มข้น 1 × 104 เซลล์ต่อดีใน 100 ไมโครลิตรของ F12 กลาง (Gibco®, Invitrogen) เสริมด้วย
FBS 10%, 200 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร G418 (Gibco BRL) และ 0.1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรวิธีการแก้ปัญหา kanamycin (ซิกม่า) เซลล์ที่ได้รับ
อนุญาตให้แนบเป็นเวลา 48 ชั่วโมงก่อนที่จะลบกลางและเพิ่ม 100 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างที่มีขนาดกลางปรับลด
ตามด้วยการบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมงในศูนย์บ่มเพาะ CO2 5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ตัวอย่างน้ำเสียที่ถูกเพิ่ม 5
ความเข้มข้น 0.01, 0.1, 1, 5, 10 และ 20% (V / V) สำหรับความเข้มข้นสูงสุดควบคุมเพิ่มเติม (5,
10 และ 20% พีบีเอส (-), ไม่ได้แสดงข้อมูล) ได้รับการพิจารณาเป็นข้อมูลอ้างอิงในการสั่งซื้อที่จะต้องพิจารณาผลกระทบตัวอย่าง
เฉพาะ กลางแล้วก็ลบออกอย่างระมัดระวังและเซลล์ล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส (-) ห้าสิบ
microliters ของ buffer สลาย (Promega) ถูกเพิ่มเข้ามาแล้วและแผ่นบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ห้อง
อุณหภูมิ (RT) ยี่สิบ microliters ของ lysate เซลล์ถูกย้ายไปแผ่นใหม่ที่ 100 ไมโครลิตรของ
การแก้ปัญหาพื้นผิว (10 มิลลิ NaH2PO4 • 2H2O 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 1% BSA, 0.005% NaN3 1 มิลลิ MgCl2 • 6H2O,
1% 4 methylumbelliferyl- β-กาแลคโต (แก้ว), ค่า pH 7.0) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อที่จะเรียกการเปลี่ยนแปลงของ
แก้วเข้าβ-และกาแลคโต methylumbelliferyl หลังจากที่ปล่อยให้เกิดปฏิกิริยาที่จะเกิดขึ้นในที่มืดเป็นเวลา 30
นาทีที่ RT 60 ไมโครลิตรของการเกิดปฏิกิริยาหยุดบัฟเฟอร์ (1 M-glycine NaOH ค่า pH 10.3) ได้รับการเพิ่มและการเรืองแสงที่
365 นาโนเมตรกระตุ้น / 450 นาโนเมตรปล่อยก๊าซเรือนกระจกที่ถูกกำหนดแล้วใช้ multidetection อ่าน microplate

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การศึกษาวิธีที่ 47 ตามกิจกรรมของเอนไซม์บีตา - galactosidase ( isoda et al . , 2003 ) , ขับเคลื่อนโดย
hsp47 ยีนส่งเสริม มีจุดมุ่งหมายเพื่อศึกษาความเครียดการตอบสนองของ HSP 47 เปลี่ยนเซลล์จากตัวอย่าง
นอกจากนี้ ไถ่ถอน 47 แปลงเซลล์มี trypsinized และชุบลงบนจานที่ 96 ก็เริ่มต้น
( 1 × 104 เซลล์ต่อลิตรใน 100 μ F12 ( gibco ®ขนาดกลาง ,Invitrogen ) เสริมด้วย
10% FBS 200 μ g / ml g418 ( gibco BRL ) และ 0.1 μ g / ml ทั้งสองโซลูชั่น ( Sigma ) เซลล์ถูก
อนุญาตให้แนบ 48 ชั่วโมงก่อนที่จะลบปานกลางและเพิ่ม 100 μลิตรตัวอย่างที่เจือจางกับขนาดกลาง
ตามด้วยการบ่มเป็นเวลา 3 ชม. ในตู้อบ CO2 5 % ที่อุณหภูมิ 37 องศา น้ำเสียจำนวนเพิ่ม 5
ความเข้มข้น 0.01 , 0.1 , 1 , 5 , 10 และ 20 % ( v / 5 )สำหรับความเข้มข้นสูงสุด ควบคุมเพิ่มเติม ( 5 , 10 และ 20 %
PBS ( - ) , ข้อมูลไม่แสดง ) ก็ถือว่าเป็นข้อมูลอ้างอิงในการพิจารณาตัวอย่างผล
โดยเฉพาะ สื่อก็ลบออกอย่างระมัดระวังและเซลล์ล้างสองครั้งกับ PBS ( - ) ห้าสิบ
ตัวเลขของการสลายบัฟเฟอร์ ( promega ) แล้วเพิ่มแผ่น 30 นาทีและบ่มที่อุณหภูมิห้อง
( RT )ยี่สิบตัวเลขของเซลล์ lysate ถูกโอนไปยังจานใหม่ที่ 100 μ l
พื้นผิวโซลูชั่น ( 10 มม. - nah2po4 2H2O-dx , 100 mM NaCl 1 % BSA , 0.005 % nan3 1 มม. 6h2o ไอโซโทป - , -
1 % 4-methylumbelliferyl บีตา - กาแลคโตส ( แก้ว ) , pH 7.0 ) ถูกเพิ่มเข้ามาใน เพื่อที่จะเรียกการเปลี่ยนแปลงของบีตา - กาแลคโตส
แก้วเป็น 45 กิโลดาลตันและ . หลังจากที่ให้ปฏิกิริยาเกิดขึ้นในที่มืดเป็นเวลา 30
มินที่ RT ,60 μ L ของปฏิกิริยาหยุดบัฟเฟอร์ ( 1 M glycine NaOH Ph 10.3 ) คือการเพิ่มและการเรืองแสงที่
365 nm กระตุ้น / 450 nm ออกมาแล้วพิจารณาใช้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย multidetection คนอ่าน