(AS1290, Promega GmbH, Mannheim, Ge

(AS1290, Promega GmbH, Mannheim, Germany) was used for DNA extraction from plant material (maize flour, provided by the Bavarian Health and Food Safety Authority, Germany), but resulted in very low DNA concentrations below 10 ng lL-1 and a bad DNA purity, not suitable for seed surveillance (data not shown). Therefore, we developed a new automated DNA extraction method on basis of the AS1290 extraction kit. Several parameters like the initial sample amount, kind and volume of the extraction buffer, addition of enzymes supporting the DNA extraction and detachment of interfering molecules, incubation time and incubation temperature, volume of the supernatant transferred to the first well of the cartridge, kind and volume of the binding buffer and volume of the elution buffer were optimised. The optimisation process led to a rapid and easy DNA extraction workflow (see results part). The assay was validated using maize, soya bean and rapeseed samples (n = 12 each).
Manual CTAB buffer-based DNA extraction
In order to compare the automated DNA extraction with a manual DNA extraction method, twelve samples of maize and soya bean mixtures were extracted using a CTAB buffer-based extraction procedure. CTAB buffer-based DNA extraction is commonly applied in GMO reference laboratories [7]. Initially, 200 mg ground maize or 100 mg ground soya bean (n = 12 each) were mixed with 1 mL CTAB extraction buffer in a 2-mL tube. Subsequently, 20 lL RNase A (10 mg lL-1) were added, mixed and incubated for 30 min. at 65 C while shaking. Then, 40 lL proteinase K (20 mg mL-1) were added, and the mixture was incubated for 3 h at 65 C. After centrifugation for 10 min. at 14,5009g , the clear supernatant was transferred to a new tube, and 500 lL chloroform were added, followed by centrifugation at 14,5009g for 10 min. The upper watery phase was transferred to a new tube and 2 vol. precipitation buffer (0.5 % CTAB, 40 mM NaCl, 50 mM Tris, pH = 8.0) were added. After incubation for 60 min. at room temperature and subsequent centrifugation for 5 min. at 14,5009g , the supernatant was discarded, and the pellet was dissolved in 350 lL NaCl solution (1.2 M NaCl). Afterwards, 350 lL chloroform were added, and the mixture was centrifuged for 10 min. at 14,5009g. The upper watery phase was again transferred into a new tube, and 2 lL glycogen (20 mg mL-1) and 1 vol. 2-propanol (precooled at -20 C) were added. The samples were incubated at -20 C for 30 min before another centrifugation step for 15 min. at 17,0009g was performed. The supernatant was discarded, and the pellet washed by addition of 500 lL ethanol (70 %, precooled at -20 C). Another centrifugation step for 5 min. at 17,0009g was performed,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(AS1290, Promega GmbH มา เยอรมนี) ถูกใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากวัสดุพืช (ข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ flour บาวาเรียสุขภาพและหน่วยงานด้านความปลอดภัยอาหาร เยอรมนี), ได้ส่งผลให้ดีเอ็นเอความเข้มข้นต่ำมากต่ำกว่า 10 ng จะ-1 และดีเอ็นเอความบริสุทธิ์ ไม่เหมาะสำหรับการเฝ้าระวังเมล็ด (ข้อมูลไม่แสดง) ดังนั้น เราสามารถพัฒนาตัวใหม่ DNA สกัดวิธีบนพื้นฐานของชุดสกัด AS1290 พารามิเตอร์หลายอย่างเช่นตัวอย่างแรกยอด ชนิด และปริมาณของบัฟเฟอร์สกัด เพิ่มสนับสนุนการสกัดดีเอ็นเอและปลดของโมเลกุลรบกวนเอนไซม์ คณะทันตแพทยศาสตร์เวลาและอุณหภูมิบ่ม ปริมาณของ supernatant ที่โอนย้ายไป first ดีของตลับ ชนิด และปริมาณของบัฟเฟอร์รวมและปริมาณของบัฟเฟอร์ elution ถูกเหมาะงานกราฟฟิก การเพิ่มประสิทธิภาพนำไปสู่การอย่างรวดเร็ว และง่ายดีเอ็นเอแยก workflow (ดูส่วนผล) ทดสอบถูกตรวจสอบโดยใช้ข้าวโพด ถั่วเหลืองถั่วและเมล็ดต้นเรพตัวอย่าง (n = 12 ละ)คู่มือ CTAB ใช้บัฟเฟอร์ DNA สกัดเพื่อเปรียบเทียบการสกัดดีเอ็นเออัตโนมัติ ด้วยวิธีการสกัดดีเอ็นเอด้วยตนเอง ตัวอย่างสิบสองส่วนผสมถั่วเหลืองและข้าวโพดถูกสกัดโดยใช้กระบวนการสกัดที่ใช้บัฟเฟอร์ CTAB โดยทั่วไปใช้การสกัดดีเอ็นเอใช้บัฟเฟอร์ CTAB ในห้องปฏิบัติการอ้างอิงของพืชจีเอ็มโอ [7] เริ่มแรก ข้าวโพดดิน 200 มิลลิกรัมหรือ 100 มิลลิกรัมดินถั่ว (n = 12 ละ) ถูกผสมกับบัฟเฟอร์สกัด CTAB 1 mL ในหลอด 2 มล. ในเวลาต่อมา 20 จะ RNase (10 mg จะ-1) ได้เพิ่ม ผสม และ incubated ใน 30 นาทีที่ 65 C ขณะสั่น แล้ว เพิ่ม 40 จะ proteinase K (20 mg mL-1) และส่วนผสมถูก incubated สำหรับ h 3 ที่ซี 65 หลัง centrifugation สำหรับ 10 นาทีที่ 14, 5009g, supernatant ชัดเจนถูกถ่ายโอนไปหลอดใหม่ และคลอโรฟอร์มจะ 500 เพิ่ม ตาม centrifugation ที่ 14, 5009g สำหรับ 10 นาที ระยะแฉะบนถูกโอนไปที่หลอดใหม่และบัฟเฟอร์ฝนปีที่ 2 (0.5% CTAB, 40 มม. NaCl, 50 มม.ตรี pH = 8.0) เพิ่มขึ้น หลังจากฟักตัวใน 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องและต่อมา centrifugation ใน 5 นาทีที่ 14, 5009g, supernatant ถูกยกเลิก แล้วเม็ดถูกละลายในโซลูชัน NaCl จะ 350 (1.2 M NaCl) ภายหลัง คลอโรฟอร์มจะ 350 เพิ่ม และส่วนผสมถูก centrifuged สำหรับ 10 นาทีที่ 14, 5009g ระยะแฉะบนถูกอีกซื้อ หลอดใหม่ และไกลโคเจนจะ 2 (20 mg mL-1) และ 1 ปี 2-อย่างไร propanol (precooled ที่ - 20 C) เพิ่มขึ้น ตัวอย่างที่ incubated ที่ -20 C ใน 30 นาทีก่อนอื่นขั้น centrifugation สำหรับ 15 นาทีที่ 17, 0009 g ทำ Supernatant ถูกละทิ้ง และเม็ดที่ล้าง โดยเพิ่ม 500 จะเอทานอล (70%, precooled ที่-20 C) ขั้นตอน centrifugation อีกใน 5 นาทีที่ 17, 0009g ทำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( as1290 promega GmbH , Mannheim , เยอรมนี ) คือใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากวัสดุพืช ( ข้าวโพดflของเราโดยบาวาเรียสุขภาพและหน่วยงานความปลอดภัยอาหารเยอรมัน ) แต่ผล DNA ความเข้มข้นต่ำมาก ล่าง 10 ng ll-1 และความบริสุทธิ์ ดีเอ็นเอ ไม่ดี ไม่เหมาะสำหรับการเฝ้าระวังเมล็ด ( ข้อมูลไม่แสดง ) ดังนั้นเราได้พัฒนาวิธีการสกัดดีเอ็นเอใหม่โดยอัตโนมัติบนพื้นฐานของ as1290 แยกชุด พารามิเตอร์ต่างๆเช่นปริมาณตัวอย่างเบื้องต้น ชนิดและปริมาณของสารสกัดเพิ่มเอนไซม์สนับสนุนการสกัดดีเอ็นเอและการไล่ของรบกวนโมเลกุล ระยะเวลาบ่มที่อุณหภูมิและปริมาณของนำโอนไปจึงตัดสินใจเดินทางดีของตลับหมึกชนิดและปริมาณของบัฟเฟอร์ และปริมาณของสารประกอบบัฟเฟอร์มี - . กระบวนการเพิ่มประสิทธิภาพ นำไปสู่การอย่างรวดเร็วและง่ายในการสกัดดีเอ็นเอทำงานflโอ๊ย ( เห็นผลส่วนหนึ่ง ) ( กำลังตรวจสอบการใช้ข้าวโพด ถั่วเหลือง และเมล็ดต้นตัวอย่าง ( n = 12 คน บัฟเฟอร์ ctab คู่มือตาม

การสกัดดีเอ็นเอเพื่อเปรียบเทียบโดยอัตโนมัติสกัดดีเอ็นเอที่มีคู่มือการสกัดดีเอ็นเอวิธี12 ตัวอย่างของข้าวโพดและถั่วเหลืองผสมถั่วที่ใช้บัฟเฟอร์ ctab ขั้นตอนการสกัดจาก การสกัดดีเอ็นเอจาก ctab บัฟเฟอร์โดยทั่วไปที่ใช้ในห้องปฏิบัติการอ้างอิงจีเอ็มโอ [ 7 ] เริ่มต้น 200 มก. พื้นดินข้าวโพดหรือถั่วเหลืองบด 100 มิลลิกรัม ( n = 12 แต่ละ ) ผสม 1 ml ctab ใช้สารใน 2-ml หลอด จำนวน 20 จะเลส ( มก. ll-1 10 ) เพิ่มขึ้นผสมและบ่มเป็นเวลา 30 นาที ที่ 65  C ในขณะที่สั่น แล้วจะโปร 40 K ( 20 mg แน่นอน ) มีการเพิ่มและผสมบ่มเป็นเวลา 3 ชม. ที่ 65  C หลังการปั่นเหวี่ยงสำหรับ 10 นาทีที่ 145009g , นำใส ถูกย้ายไปเป็นหลอดใหม่ และคลอโรฟอร์ม 500 จะเพิ่มตาม โดยปั่นที่ 145009g นาน 10 นาทีระยะน้ำด้านบนไปเป็นหลอดใหม่ และ 2 . การตกตะกอนของบัฟเฟอร์ ( 0.5% ctab 40 mM NaCl , 50 มม. โดย pH = 8.0 ) มีการเพิ่ม หลังจากบ่มเป็นเวลา 60 นาที ที่อุณหภูมิห้อง และที่ตามมาปั่น 5 นาทีที่ 145009g , น่านถูกทิ้ง และเม็ดละลายในสารละลาย NaCl 350 จะ ( 1.2 M NaCl ) หลังจากนั้น , 350 จะเข้าไปเพิ่มขึ้นและส่วนผสมระดับสำหรับ 10 นาทีที่ 145009g เฟสน้ำชั้นบนอีกครั้งโอนเป็นหลอดใหม่และ 2 จะไกลโคเจน ( 20 mg แน่นอน ) และโพรพานอล 1 ฉบับ ( precooled ที่ - 20  C ) มีการเพิ่ม ตัวอย่างที่อุณหภูมิ - 20  C นาน 30 นาทีก่อนอีก 3 ขั้นตอนสำหรับ 15 นาทีที่ 170009g กำหนด และน่านถูกทิ้ง