- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Materials and methods2.1. Chemic
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and raw materials
Polyethylene glycol (PEG), sodium dodecyl sulfate (SDS), bovine serum albumin (BSA), casein and l-cysteine were obtained from Fluka (Buchs, Switzerland). Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 and R-250 were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Ammonium sulfate ((NH4)2SO4), trichloroacetic acid (TCA) and other chemicals with analytical grade were obtained from Merck (Darmstadt, Germany).
Carica papaya fruits were harvested from 3 to 4 months maturation at Mae Fah Luang University, Chiang Rai, Thailand.
2.2. Extraction of proteases from papaya peels
Papaya peels were prepared by peeling the fruits and cutting them into small pieces. The peels were dried in a tray-dryer at 55 oC until 90% (w/w) of moisture content was removed according to previously reported [1]. The fresh or dried papaya peels were ground in a blender before mixed with the extraction media (H2O and 50 mM phosphate buffers, pH 7.0) at a ratio of 1:9 (w/v), and it was then let stand for 30 min. The extracted samples were then centrifuged at 9000 × g at 4 °C for 20 min. The obtained supernatant was filtered through a Whatman paper No. 1. This sample was referred to as the “crude extract” and used for further experiment.
2.3. Three-phase partitioning (TPP)
2.3.1. Effect of the ratio of crude extract to t-butanol on protease partitioning
The TPP was carried out as described by Roy and Gupta [8]. The effect of the ratio of papaya peel crude extract to t-butanol was studied. Firstly, the crude extract was added with t-butanol at ratios of 1.0:0.5, 1.0:1.0, 1.0:1.5, and 1.0:2.0 (v/v) of sample to t-butanol at 40% (NH4)2SO4. The ratio of crude extract to t-butanol that gave the highest enzyme recovery was chosen for further study.
2.3.2. Effect of ammonium sulfate concentration on protease partitioning
The effect of (NH4)2SO4 concentrations at 20, 30, 40 and 50% (w/v) were also investigated by using the ratio of crude extract to t-butanol (with the highest enzyme recovery) obtained from Section 2.3.1. The bottom phase and the interphase were collected and dialyzed against water overnight at 4 °C before the analysis of proteolytic activity and protein content. The salt concentration providing the highest protease recovery was chosen for further study.
2.3.3. Optimization of TPP for recovery of proteases from papaya peel extract
The phase of the first TPP that gave the highest activity recovery was chosen as the starting material for optimization in the second TPP. The selected phase (without dialysis) was mixed with the t-butanol in a ratio of 1.0:0.5 and (NH4)2SO4 was added to the mixture to obtain the final concentrations of 50, 55 and 60% (w/v). The phases obtained were analyzed as previously mentioned.
2.4. Caseinolytic activity and protein determinations
The caseinolytic activity of the enzyme sample was performed by following the method described in Chaiwut et al. [1]. The protein concentration in the sample was measured by the Bradford method [10], using BSA as a protein standard.
2.5. SDS-PAGE and protease activity staining
SDS-PAGE of the samples was performed according to the method of Laemmli [11] with slight modification. Protein samples (10 and 2 μg for CBB and activity staining, respectively) were loaded onto the electrophoresis gel (20 mA/gel) made of 4% stacking and 15% separating gels. After electrophoresis, the gel was then stained overnight with staining solutions (0.02% (w/v) CBB R-250 in 50% (v/v) methanol, and 7.5% (v/v) acetic acid). The proteases separated on the SDS-gel were verified by using activity staining as done in Garcia-Carreno et al. [12]. The development of a clear band on the dark background indicated the caseinolytic activity of proteases from papaya peels.
2.1. Chemicals and raw materials
Polyethylene glycol (PEG), sodium dodecyl sulfate (SDS), bovine serum albumin (BSA), casein and l-cysteine were obtained from Fluka (Buchs, Switzerland). Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 and R-250 were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Ammonium sulfate ((NH4)2SO4), trichloroacetic acid (TCA) and other chemicals with analytical grade were obtained from Merck (Darmstadt, Germany).
Carica papaya fruits were harvested from 3 to 4 months maturation at Mae Fah Luang University, Chiang Rai, Thailand.
2.2. Extraction of proteases from papaya peels
Papaya peels were prepared by peeling the fruits and cutting them into small pieces. The peels were dried in a tray-dryer at 55 oC until 90% (w/w) of moisture content was removed according to previously reported [1]. The fresh or dried papaya peels were ground in a blender before mixed with the extraction media (H2O and 50 mM phosphate buffers, pH 7.0) at a ratio of 1:9 (w/v), and it was then let stand for 30 min. The extracted samples were then centrifuged at 9000 × g at 4 °C for 20 min. The obtained supernatant was filtered through a Whatman paper No. 1. This sample was referred to as the “crude extract” and used for further experiment.
2.3. Three-phase partitioning (TPP)
2.3.1. Effect of the ratio of crude extract to t-butanol on protease partitioning
The TPP was carried out as described by Roy and Gupta [8]. The effect of the ratio of papaya peel crude extract to t-butanol was studied. Firstly, the crude extract was added with t-butanol at ratios of 1.0:0.5, 1.0:1.0, 1.0:1.5, and 1.0:2.0 (v/v) of sample to t-butanol at 40% (NH4)2SO4. The ratio of crude extract to t-butanol that gave the highest enzyme recovery was chosen for further study.
2.3.2. Effect of ammonium sulfate concentration on protease partitioning
The effect of (NH4)2SO4 concentrations at 20, 30, 40 and 50% (w/v) were also investigated by using the ratio of crude extract to t-butanol (with the highest enzyme recovery) obtained from Section 2.3.1. The bottom phase and the interphase were collected and dialyzed against water overnight at 4 °C before the analysis of proteolytic activity and protein content. The salt concentration providing the highest protease recovery was chosen for further study.
2.3.3. Optimization of TPP for recovery of proteases from papaya peel extract
The phase of the first TPP that gave the highest activity recovery was chosen as the starting material for optimization in the second TPP. The selected phase (without dialysis) was mixed with the t-butanol in a ratio of 1.0:0.5 and (NH4)2SO4 was added to the mixture to obtain the final concentrations of 50, 55 and 60% (w/v). The phases obtained were analyzed as previously mentioned.
2.4. Caseinolytic activity and protein determinations
The caseinolytic activity of the enzyme sample was performed by following the method described in Chaiwut et al. [1]. The protein concentration in the sample was measured by the Bradford method [10], using BSA as a protein standard.
2.5. SDS-PAGE and protease activity staining
SDS-PAGE of the samples was performed according to the method of Laemmli [11] with slight modification. Protein samples (10 and 2 μg for CBB and activity staining, respectively) were loaded onto the electrophoresis gel (20 mA/gel) made of 4% stacking and 15% separating gels. After electrophoresis, the gel was then stained overnight with staining solutions (0.02% (w/v) CBB R-250 in 50% (v/v) methanol, and 7.5% (v/v) acetic acid). The proteases separated on the SDS-gel were verified by using activity staining as done in Garcia-Carreno et al. [12]. The development of a clear band on the dark background indicated the caseinolytic activity of proteases from papaya peels.
0/5000
2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีภัณฑ์และวัตถุดิบPolyethylene glycol (PEG), โซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS), วัว serum albumin (บีเอสเอ), เคซีน และ l-cysteine ได้รับมาจาก Fluka (Buchs สวิตเซอร์แลนด์) Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 และ R-250 ที่ซื้อจาก บริษัทเคมีซิก (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) แอมโมเนียซัลเฟต ((NH4) 2SO4), กรด trichloroacetic (TCA) และสารเคมีอื่น ๆ ด้วยเกรดวิเคราะห์ได้รับมาจากบริษัทเมอร์ค (ดาร์มส เยอรมนี)ผลไม้มะละกอ Carica ถูกเก็บเกี่ยวจาก 3 ไป 4 เดือนพ่อแม่ที่ มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวง เชียงราย ไทย2.2 การสกัด proteases จากมะละกอมักหลุดลอกPeels มะละกอได้เตรียมผลไม้ปอกเปลือก และตัดให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ Peels ถูกอบแห้งในถาดอบที่ 55 องศาเซลเซียสจนกว่า 90% (w/w) ของชื้นถูกเอาตามรายงานก่อนหน้านี้ [1] มะละกอสด หรือแห้ง peels ถูกพื้นในเบลนเดอร์ก่อนผสมกับแยกสื่อ (บัฟเฟอร์ฟอสเฟต H2O และ 50 มม. pH 7.0) ในอัตราส่วน 1:9 (w/v), และมันได้แล้วให้ถึง 30 นาที ตัวอย่างที่แยกได้แล้ว centrifuged ที่ 9000 × g ที่ 4 ° C สำหรับ 20 นาที Supernatant ได้รับถูกกรองผ่าน Whatman กระดาษหมายเลข 1 อย่างนี้เรียกว่า "สารสกัดหยาบ" และใช้ในการทดลองต่อไป2.3. ระยะสามพาร์ทิชัน (TPP)2.3.1. ผลของอัตราส่วนของดิบแยก t-บิวทานอบนพาร์ทิชันรติเอสTPP ได้ดำเนิน ตามรอยทางกุปตา [8] มีศึกษาผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบเปลือกมะละกอกับบิวทานอ t ประการแรก สารสกัดหยาบถูกเพิ่มกับ t-บิวทานอที่อัตราส่วนของ 1.0:0.5, 1.0:1.0, 1.0:1.5 และ 1.0:2.0 (v/v) ของตัวอย่างกับ t-บิวทานอที่ 40% (NH4) 2SO4 อัตราส่วนของสารสกัดหยาบให้ t-บิวทานอที่ให้กู้เอนไซม์สูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาต่อ2.3.2. ผลของความเข้มข้นของแอมโมเนียมซัลเฟตในพาร์ทิชันรติเอสผลของ (NH4) 2SO4 ความเข้มข้นที่ 20, 30, 40 และ 50% (w/v) ยังถูกตรวจสอบ โดยใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบกับบิวทานอ t (มีเอนไซม์สูงกู้คืน) ได้จากหัวข้อ 2.3.1 ระยะล่างและ interphase ที่ถูกรวบรวม และ dialyzed กับน้ำค้างคืนที่ 4 ° C ก่อนวิเคราะห์เนื้อหากิจกรรมและโปรตีน proteolytic ความเข้มข้นเกลือให้กู้คืนรติเอสสูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาต่อ2.3.3 การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP การกู้คืน proteases จากเปลือกมะละกอสารสกัดระยะของ TPP แรกกู้คืนกิจกรรมสูงสุดที่ถูกเลือกเป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการปรับใน TPP ที่สอง ขั้นตอนการเลือก (ไม่ มีหน่วย) ที่ผสมกับ t-บิวทานอในอัตราส่วนของ 1.0:0.5 และ (NH4) 2SO4 ได้เพิ่มส่วนผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 50, 55 และ 60% (w/v) ระยะที่ได้รับถูกวิเคราะห์กล่าวว่า ก่อนหน้านี้2.4 Caseinolytic กิจกรรมและโปรตีน determinationsกิจกรรม caseinolytic ของตัวอย่างเอนไซม์ที่ดำเนินการตามวิธีที่อธิบายใน Chaiwut et al. [1] ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างถูกวัด โดยวิธีแบรดฟอร์ด [10], การใช้บีเอสเอเป็นโปรตีนที่มาตรฐาน2.5. หน้า SDS และรติเอสกิจกรรมย้อมสีSDS-หน้าของตัวอย่างที่ดำเนินการตามวิธีการของ Laemmli [11] มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน (10 และ 2 μg สำหรับ CBB และการย้อมสี ตามลำดับ) ถูกโหลดลงในเจ electrophoresis (20 mA/เจล) ทำซ้อน 4% และ 15% แยกเจ หลังจาก electrophoresis เจมีแล้วสีค้างคืน ด้วยโซลูชั่น (0.02% (w/v) 250 CBB R ในเมทานอล 50% (v/v) และ 7.5% (v/v) กรดอะซิติก) การย้อมสี Proteases คั่นใน SDS-เจถูกตรวจสอบ โดยใช้กิจกรรมย้อมสีเป็นทำในการ์เซีย Carreno et al. [12] การพัฒนาของวงใสบนพื้นหลังสีเข้มระบุกิจกรรม caseinolytic ของ proteases จากมะละกอ peels
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีและวัตถุดิบ
เอทิลีนไกลคอล (PEG) โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) และเคซีน l-cysteine ที่ได้รับจาก Fluka (Buchs วิตเซอร์แลนด์) Coomassie สดใสฟ้า (CBB) G-250 และ R-250 ถูกซื้อมาจาก Sigma เคมี จำกัด (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) แอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4) 2SO4) กรดไตรคลอโร (TCA) และสารเคมีอื่น ๆ ที่มีการวิเคราะห์ชั้นประถมศึกษาปีที่ได้รับจากเมอร์ค (ดาร์มสตัด, เยอรมนี). ผลไม้มะละกอ Carica เก็บเกี่ยว 3-4 เดือนการเจริญเติบโตที่มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวงเชียงราย ประเทศไทย. 2.2 สกัดโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอเปลือกมะละกอที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการปอกเปลือกผลไม้และตัดให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ เปลือกแห้งในถาดเครื่องเป่าที่ 55 องศาเซลเซียสจนถึง 90% (w / w) ความชื้นจะถูกลบออกไปตามรายงานก่อนหน้านี้ [1] สดหรือแห้งเปลือกมะละกอมาบดในเครื่องปั่นก่อนที่จะผสมกับสื่อสกัด (H2O และ 50 มิลลิบัฟเฟอร์ฟอสเฟตค่า pH 7.0) ในอัตราส่วน 1: 9 (w / v) และมันก็ให้ยืนเป็นเวลา 30 นาที . กลุ่มตัวอย่างถูกสกัดปั่นแล้วที่ 9000 ×กรัมที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที ใสได้ถูกกรองผ่านกระดาษเบอร์ลำดับที่ 1. ตัวอย่างนี้ถูกเรียกว่า "สารสกัด" และใช้สำหรับการทดลองต่อไป. 2.3 แบ่งสามเฟส (TPP) 2.3.1 ผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบที่จะเสื้อบิวทานอในการแบ่งพาร์ทิชันน้ำย่อยTPP ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยรอยและ Gupta [8] ผลของอัตราส่วนของสารสกัดจากเปลือกมะละกอดิบที่จะเสื้อบิวทานอการศึกษา ประการแรกสารสกัดหยาบที่ถูกเพิ่มเข้ามาด้วยเสื้อบิวทานอที่อัตราส่วน 1.0: 0.5, 1.0: 1.0, 1.0: 1.5 และ 1.0: 2.0 (v / v) ตัวอย่างเสื้อบิวทานอที่ 40% (NH4) 2SO4 อัตราส่วนของสารสกัดหยาบที่จะเสื้อบิวทานอที่ให้การฟื้นตัวของเอนไซม์ที่สูงที่สุดเป็นทางเลือกสำหรับการศึกษาต่อไป. 2.3.2 ผลของความเข้มข้นของแอมโมเนียมซัลเฟตในน้ำย่อยแบ่งผลของ (NH4) 2SO4 ที่ความเข้มข้น 20, 30, 40 และ 50% (w / v) ได้รับการตรวจสอบโดยใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบไป t-บิวทานอ (กับการฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุด ) ที่ได้รับจากมาตรา 2.3.1 ขั้นตอนด้านล่างและระหว่างเฟสถูกเก็บรวบรวมและ dialyzed กับน้ำค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสก่อนที่จะวิเคราะห์กิจกรรมโปรตีนและปริมาณโปรตีน ความเข้มข้นของเกลือให้การฟื้นตัวของโปรติเอสสูงสุดเป็นทางเลือกสำหรับการศึกษาต่อไป. 2.3.3 การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP สำหรับการกู้คืนของโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอสกัดขั้นตอนของ TPP แรกที่ให้การฟื้นตัวของกิจกรรมสูงสุดได้รับเลือกให้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพในครั้งที่สอง TPP ขั้นตอนการเลือก (โดยไม่ต้องล้างไต) ผสมกับเสื้อบิวทานอในอัตราส่วน 1.0: 0.5 และ (NH4) 2SO4 ถูกบันทึกอยู่ในส่วนผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 50, 55 และ 60% (w / v) ขั้นตอนที่ได้มาวิเคราะห์ตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้. 2.4 กิจกรรม Caseinolytic และโปรตีนหาความcaseinolytic กิจกรรมของกลุ่มตัวอย่างเอนไซม์ที่ได้ดำเนินการโดยทำตามวิธีการอธิบายในชัยวุฒิ et al, [1] ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างที่ถูกวัดโดยวิธีแบรดฟอ [10] โดยใช้บีเอสเอเป็นมาตรฐานโปรตีน. 2.5 SDS-PAGE และกิจกรรมโปรติเอสย้อมสีSDS-PAGE ของกลุ่มตัวอย่างที่ได้ดำเนินการตามวิธีการของ Laemmli [11] ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน (10 ไมโครกรัมและ 2 สำหรับการย้อมสี CBB และกิจกรรมตามลำดับ) ถูกโหลดลงเจลอิเล็ก (20 mA / เจล) ทำจาก 4 ซ้อน% และ 15% แยกเจล หลังจากที่อิเลคเจลที่ถูกย้อมสีแล้วในชั่วข้ามคืนด้วยโซลูชั่นการย้อมสี (0.02% (w / v) CBB R-250 ใน 50% (v / v) เมทานอลและ 7.5% (v / v) กรดอะซิติก) โปรตีเอสที่แยกออกมาในระบบ SDS-เจลได้รับการตรวจสอบโดยใช้การย้อมสีเป็นกิจกรรมที่ทำในการ์เซีย Carreno et al, [12] การพัฒนาของวงดนตรีที่ชัดเจนเกี่ยวกับพื้นหลังสีดำที่ระบุกิจกรรม caseinolytic ของโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอ
2.1 สารเคมีและวัตถุดิบ
เอทิลีนไกลคอล (PEG) โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) และเคซีน l-cysteine ที่ได้รับจาก Fluka (Buchs วิตเซอร์แลนด์) Coomassie สดใสฟ้า (CBB) G-250 และ R-250 ถูกซื้อมาจาก Sigma เคมี จำกัด (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) แอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4) 2SO4) กรดไตรคลอโร (TCA) และสารเคมีอื่น ๆ ที่มีการวิเคราะห์ชั้นประถมศึกษาปีที่ได้รับจากเมอร์ค (ดาร์มสตัด, เยอรมนี). ผลไม้มะละกอ Carica เก็บเกี่ยว 3-4 เดือนการเจริญเติบโตที่มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวงเชียงราย ประเทศไทย. 2.2 สกัดโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอเปลือกมะละกอที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการปอกเปลือกผลไม้และตัดให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ เปลือกแห้งในถาดเครื่องเป่าที่ 55 องศาเซลเซียสจนถึง 90% (w / w) ความชื้นจะถูกลบออกไปตามรายงานก่อนหน้านี้ [1] สดหรือแห้งเปลือกมะละกอมาบดในเครื่องปั่นก่อนที่จะผสมกับสื่อสกัด (H2O และ 50 มิลลิบัฟเฟอร์ฟอสเฟตค่า pH 7.0) ในอัตราส่วน 1: 9 (w / v) และมันก็ให้ยืนเป็นเวลา 30 นาที . กลุ่มตัวอย่างถูกสกัดปั่นแล้วที่ 9000 ×กรัมที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที ใสได้ถูกกรองผ่านกระดาษเบอร์ลำดับที่ 1. ตัวอย่างนี้ถูกเรียกว่า "สารสกัด" และใช้สำหรับการทดลองต่อไป. 2.3 แบ่งสามเฟส (TPP) 2.3.1 ผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบที่จะเสื้อบิวทานอในการแบ่งพาร์ทิชันน้ำย่อยTPP ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยรอยและ Gupta [8] ผลของอัตราส่วนของสารสกัดจากเปลือกมะละกอดิบที่จะเสื้อบิวทานอการศึกษา ประการแรกสารสกัดหยาบที่ถูกเพิ่มเข้ามาด้วยเสื้อบิวทานอที่อัตราส่วน 1.0: 0.5, 1.0: 1.0, 1.0: 1.5 และ 1.0: 2.0 (v / v) ตัวอย่างเสื้อบิวทานอที่ 40% (NH4) 2SO4 อัตราส่วนของสารสกัดหยาบที่จะเสื้อบิวทานอที่ให้การฟื้นตัวของเอนไซม์ที่สูงที่สุดเป็นทางเลือกสำหรับการศึกษาต่อไป. 2.3.2 ผลของความเข้มข้นของแอมโมเนียมซัลเฟตในน้ำย่อยแบ่งผลของ (NH4) 2SO4 ที่ความเข้มข้น 20, 30, 40 และ 50% (w / v) ได้รับการตรวจสอบโดยใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบไป t-บิวทานอ (กับการฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุด ) ที่ได้รับจากมาตรา 2.3.1 ขั้นตอนด้านล่างและระหว่างเฟสถูกเก็บรวบรวมและ dialyzed กับน้ำค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสก่อนที่จะวิเคราะห์กิจกรรมโปรตีนและปริมาณโปรตีน ความเข้มข้นของเกลือให้การฟื้นตัวของโปรติเอสสูงสุดเป็นทางเลือกสำหรับการศึกษาต่อไป. 2.3.3 การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP สำหรับการกู้คืนของโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอสกัดขั้นตอนของ TPP แรกที่ให้การฟื้นตัวของกิจกรรมสูงสุดได้รับเลือกให้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพในครั้งที่สอง TPP ขั้นตอนการเลือก (โดยไม่ต้องล้างไต) ผสมกับเสื้อบิวทานอในอัตราส่วน 1.0: 0.5 และ (NH4) 2SO4 ถูกบันทึกอยู่ในส่วนผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 50, 55 และ 60% (w / v) ขั้นตอนที่ได้มาวิเคราะห์ตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้. 2.4 กิจกรรม Caseinolytic และโปรตีนหาความcaseinolytic กิจกรรมของกลุ่มตัวอย่างเอนไซม์ที่ได้ดำเนินการโดยทำตามวิธีการอธิบายในชัยวุฒิ et al, [1] ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างที่ถูกวัดโดยวิธีแบรดฟอ [10] โดยใช้บีเอสเอเป็นมาตรฐานโปรตีน. 2.5 SDS-PAGE และกิจกรรมโปรติเอสย้อมสีSDS-PAGE ของกลุ่มตัวอย่างที่ได้ดำเนินการตามวิธีการของ Laemmli [11] ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน (10 ไมโครกรัมและ 2 สำหรับการย้อมสี CBB และกิจกรรมตามลำดับ) ถูกโหลดลงเจลอิเล็ก (20 mA / เจล) ทำจาก 4 ซ้อน% และ 15% แยกเจล หลังจากที่อิเลคเจลที่ถูกย้อมสีแล้วในชั่วข้ามคืนด้วยโซลูชั่นการย้อมสี (0.02% (w / v) CBB R-250 ใน 50% (v / v) เมทานอลและ 7.5% (v / v) กรดอะซิติก) โปรตีเอสที่แยกออกมาในระบบ SDS-เจลได้รับการตรวจสอบโดยใช้การย้อมสีเป็นกิจกรรมที่ทำในการ์เซีย Carreno et al, [12] การพัฒนาของวงดนตรีที่ชัดเจนเกี่ยวกับพื้นหลังสีดำที่ระบุกิจกรรม caseinolytic ของโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอ
การแปล กรุณารอสักครู่..
2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . เคมีภัณฑ์และวัตถุดิบ
polyethylene glycol ( PEG ) , โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) อัลบูมิน ( BSA ) เคซีน แอลซิสเตอีน ได้จาก fluka ( buchs , สวิตเซอร์แลนด์ ) เหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใส ( cbb ) และ g-250 r-250 ซื้อมาจาก Sigma Chemical Co . ( St . Louis , MO , USA ) แอมโมเนียม ซัลเฟต ( ( NH4 ) 2so4 )กรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA ) และสารเคมีอื่น ๆ กับเกรดที่ได้รับการวิเคราะห์จากเมอร์ค ( ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) .
มะละกอผลเก็บเกี่ยวจาก 3 ไป 4 เดือน วุฒิภาวะ มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวง , เชียงราย , ไทย .
. . สกัดจากมะละกอเพื่อเปลือก
มะละกอเปลือกเตรียมปอกผลไม้และตัดให้เป็นชิ้นเล็กๆเปลือกแห้งในเครื่องอบแห้งแบบถาดที่ 55 องศาเซลเซียส จนถึง 90 % ( w / w ) ของความชื้นจะถูกลบออกตามที่เคยรายงาน [ 1 ] สดหรือแห้งเปลือกมะละกอบดในเครื่องปั่นก่อนผสมกับการสกัดสื่อ ( H2O และ 50 มิลลิเมตร ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 ) ในอัตราส่วน 1 : 9 ( w / v ) และก็ให้ยืนเป็นเวลา 30 นาทีสกัดไฟฟ้าจำนวนแล้วที่ 9000 × g 4 °องศาเซลเซียส 20 นาที ได้นำถูกกรองผ่าน whatman กระดาษเปล่า 1 ตัวอย่างนี้จะถูกเรียกว่า " แยก " น้ำมันที่ใช้สำหรับการทดลองต่อไป
2.3 สามขั้นตอนการแบ่งพาร์ติชัน ( TPP )
2.3.1 . ผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบเพื่อ t-butanol บน CC
ตินายกรัฐมนตรีได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยรอย Gupta [ 8 ] ผลของอัตราส่วนของเปลือกมะละกอดิบ สารสกัดจาก t-butanol ศึกษา ประการแรก สารสกัดเพิ่มด้วย t-butanol อัตราส่วนของ 1.0:0.5 1.0:1.0 1.0:1.5 , , , และ 1.0:2.0 ( v / v ) ตัวอย่าง t-butanol 40% ( NH4 ) 2so4 . อัตราส่วนของ t-butanol สกัดเพื่อให้เอนไซม์สูงสุดการกู้คืนถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม
2.3.2 . ผลของแอมโมเนียม ซัลเฟตความเข้มข้นในการผลติ
( NH4 ) 2so4 ความเข้มข้น 20 , 30 , 40 และ 50 % ( w / v ) ได้ถูกศึกษาโดยการใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบเพื่อ t-butanol ( กับการฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุด ) ที่ได้จากส่วน 2.3.1 .ขั้นตอนด้านล่างและอินเตอร์เฟสกับน้ำที่ผ่านการเก็บรวบรวมและค้างคืนที่ 4 ° C ก่อนการวิเคราะห์กิจกรรมของโปรตีนและโปรตีน . ความเข้มข้นเกลือให้กู้คืนโปรสูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม
2.3.3 . การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP สำหรับการกู้คืนของ proteases จากมะละกอสารสกัดเปลือก
ขั้นตอนแรกของนายกรัฐมนตรี ที่ให้กิจกรรมการกู้คืนสูงสุดได้รับเลือกให้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพใน TPP วินาที ขั้นตอนการเลือก ( โดยไม่ต้องฟอกไต ) ผสมกับ t-butanol ในอัตราส่วน 1.0:0.5 และ ( NH4 ) 2so4 คือเพิ่มการผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 50 , 55 และ 60 % ( w / v ) ขั้นตอนที่ 1 วิเคราะห์ตามที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้
2.4 .caseinolytic กิจกรรมและใช้โปรตีน
กิจกรรม caseinolytic ของเอนไซม์ตัวอย่างการปฏิบัติตามวิธีการที่อธิบายไว้ในชัยวุฒิ et al . [ 1 ] ระดับโปรตีนในตัวอย่างถูกวัดโดยวิธี Bradford [ 10 ] ที่ใช้ BSA เป็นโปรตีนมาตรฐาน
2.5 ใช้เอนไซม์ protease activity staining
การศึกษาของกลุ่มตัวอย่างมีการปฏิบัติตามวิธีการของ laemmli [ 11 ] กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน ( 10 กรัมและ 2 μ cbb และกิจกรรมการศึกษา ตามลำดับ ) และโหลดลงบนเจลอิเลคโตรโฟรีซีส ( 20 MA / เจล ) ทำให้ 4 % ซ้อนและ 15% แยกเจล หลังจากอิเล็กเจลก็เปื้อนค้างคืนกับการย้อมสี โซลูชั่น ( 0
2.1 . เคมีภัณฑ์และวัตถุดิบ
polyethylene glycol ( PEG ) , โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) อัลบูมิน ( BSA ) เคซีน แอลซิสเตอีน ได้จาก fluka ( buchs , สวิตเซอร์แลนด์ ) เหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใส ( cbb ) และ g-250 r-250 ซื้อมาจาก Sigma Chemical Co . ( St . Louis , MO , USA ) แอมโมเนียม ซัลเฟต ( ( NH4 ) 2so4 )กรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA ) และสารเคมีอื่น ๆ กับเกรดที่ได้รับการวิเคราะห์จากเมอร์ค ( ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) .
มะละกอผลเก็บเกี่ยวจาก 3 ไป 4 เดือน วุฒิภาวะ มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวง , เชียงราย , ไทย .
. . สกัดจากมะละกอเพื่อเปลือก
มะละกอเปลือกเตรียมปอกผลไม้และตัดให้เป็นชิ้นเล็กๆเปลือกแห้งในเครื่องอบแห้งแบบถาดที่ 55 องศาเซลเซียส จนถึง 90 % ( w / w ) ของความชื้นจะถูกลบออกตามที่เคยรายงาน [ 1 ] สดหรือแห้งเปลือกมะละกอบดในเครื่องปั่นก่อนผสมกับการสกัดสื่อ ( H2O และ 50 มิลลิเมตร ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 ) ในอัตราส่วน 1 : 9 ( w / v ) และก็ให้ยืนเป็นเวลา 30 นาทีสกัดไฟฟ้าจำนวนแล้วที่ 9000 × g 4 °องศาเซลเซียส 20 นาที ได้นำถูกกรองผ่าน whatman กระดาษเปล่า 1 ตัวอย่างนี้จะถูกเรียกว่า " แยก " น้ำมันที่ใช้สำหรับการทดลองต่อไป
2.3 สามขั้นตอนการแบ่งพาร์ติชัน ( TPP )
2.3.1 . ผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบเพื่อ t-butanol บน CC
ตินายกรัฐมนตรีได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยรอย Gupta [ 8 ] ผลของอัตราส่วนของเปลือกมะละกอดิบ สารสกัดจาก t-butanol ศึกษา ประการแรก สารสกัดเพิ่มด้วย t-butanol อัตราส่วนของ 1.0:0.5 1.0:1.0 1.0:1.5 , , , และ 1.0:2.0 ( v / v ) ตัวอย่าง t-butanol 40% ( NH4 ) 2so4 . อัตราส่วนของ t-butanol สกัดเพื่อให้เอนไซม์สูงสุดการกู้คืนถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม
2.3.2 . ผลของแอมโมเนียม ซัลเฟตความเข้มข้นในการผลติ
( NH4 ) 2so4 ความเข้มข้น 20 , 30 , 40 และ 50 % ( w / v ) ได้ถูกศึกษาโดยการใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบเพื่อ t-butanol ( กับการฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุด ) ที่ได้จากส่วน 2.3.1 .ขั้นตอนด้านล่างและอินเตอร์เฟสกับน้ำที่ผ่านการเก็บรวบรวมและค้างคืนที่ 4 ° C ก่อนการวิเคราะห์กิจกรรมของโปรตีนและโปรตีน . ความเข้มข้นเกลือให้กู้คืนโปรสูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม
2.3.3 . การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP สำหรับการกู้คืนของ proteases จากมะละกอสารสกัดเปลือก
ขั้นตอนแรกของนายกรัฐมนตรี ที่ให้กิจกรรมการกู้คืนสูงสุดได้รับเลือกให้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพใน TPP วินาที ขั้นตอนการเลือก ( โดยไม่ต้องฟอกไต ) ผสมกับ t-butanol ในอัตราส่วน 1.0:0.5 และ ( NH4 ) 2so4 คือเพิ่มการผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 50 , 55 และ 60 % ( w / v ) ขั้นตอนที่ 1 วิเคราะห์ตามที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้
2.4 .caseinolytic กิจกรรมและใช้โปรตีน
กิจกรรม caseinolytic ของเอนไซม์ตัวอย่างการปฏิบัติตามวิธีการที่อธิบายไว้ในชัยวุฒิ et al . [ 1 ] ระดับโปรตีนในตัวอย่างถูกวัดโดยวิธี Bradford [ 10 ] ที่ใช้ BSA เป็นโปรตีนมาตรฐาน
2.5 ใช้เอนไซม์ protease activity staining
การศึกษาของกลุ่มตัวอย่างมีการปฏิบัติตามวิธีการของ laemmli [ 11 ] กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน ( 10 กรัมและ 2 μ cbb และกิจกรรมการศึกษา ตามลำดับ ) และโหลดลงบนเจลอิเลคโตรโฟรีซีส ( 20 MA / เจล ) ทำให้ 4 % ซ้อนและ 15% แยกเจล หลังจากอิเล็กเจลก็เปื้อนค้างคืนกับการย้อมสี โซลูชั่น ( 0
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- It may be because of my intention.
- Laminated
- corruption
- a province on southern Thailand’s Andama
- obtained
- ศิริฉัตร
- There is something you want to do, right
- We are an independent research institute
- จะพบกับ
- ผมเขายาวและดำ
- Who believes in UFOs? Not everyone belie
- ทันสมัยมากขึ้น
- ผู้บังคับบัญชารับทราบ
- My Friend.
- ตำรวจมาพบเพื่อติดต่องาน
- ผู้ที่เกี่ยวข้อง
- ระบบการจัดการผลผลิต โครงสร้างของระบบการจ
- ผู้บังคับบัญชารับทราบ
- sequel
- แล้วมันจะผ่านไป
- ดิน
- สุทธิวงศ์แมนชั่น
- จำนองอสังหาริมทรัพย์
- Laminated
