Mutation analysisReverse transcript

Mutation analysis
Reverse transcription polymerase chain reaction
(PCR) was performed on white blood cells.
Total RNA was isolated using QIAamp® RNA
Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Reverse
transcription was performed using ImProm-II™
Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI).
The entire coding region of HLCS was PCR
amplified by two primer pairs (Table 2). PCR
products were directly sequenced. The mutations
found were confirmed on genomic DNA of the
patients obtained from whole blood by PCR
sequencing.
Restriction fragment length polymorphism analysis
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
was used to confirm mutations on genomic DNA
of the patients and to screen for the presence
of each mutation in their parents. HLCS exons
7 and 8 were amplified and treated with FoxI
or HhaI (New England Biolabs, Berverly, MA),
Fig. 1. Urine organic acid analysis of patient 1. (a) The tracing before the initiation of biotin revealing large peaks of lactic acid at
5.25 min, 3-hydroxypropionic acid at 7.17 min, 3-hydroxy-n-valeric acid at 9.94 min, and 3-methylcrotonylglycine at 22.17 min,
consistent with the diagnosis of multiple carboxylase deficiency. (b) The tracing 24 days after the initiation of 1.2 mg/day of biotin
showing no detectable levels of the abnormal acids. The peak at 36.30 of both panels represented the internal standard.
89

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์การกลายพันธุ์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสถอดเทปย้อนหลัง(PCR) ถูกดำเนินการบนเซลล์เม็ดเลือดขาวรวม RNA ถูกแยกโดยใช้ QIAamp® RNAเลือด Mini Kit (Qiagen วาเลนเซีย CA) ย้อนกลับทำการถอดรหัสโดยใช้ ImProm-II™กลับ Transcriptase (Promega เมดิสัน WI)รหัสภูมิภาคของ HLCS ถูก PCRขยาย โดยสองคู่ไพรเมอร์ (ตาราง 2) PCRผลิตภัณฑ์ได้โดยตรงมีการเรียงลำดับ การกลายพันธุ์พบได้รับการยืนยันในการดีเอ็นเอของการผู้ป่วยที่ได้รับจากเลือด โดย PCRจัดลำดับการวิเคราะห์ข้อจำกัดส่วนยาวโพลิมอร์ฟิซึมข้อจำกัดส่วนยาวโพลิมอร์ฟิซึม (RFLP)ใช้ในการยืนยันการกลายพันธุ์บนดีเอ็นเอในจีโนมของผู้ป่วย และหน้าจอสำหรับการปรากฏตัวของแต่ละกลายพันธุ์ในพ่อ HLCS exons7 และ 8 ได้ขยาย และรักษา ด้วย FoxIหรือ HhaI (อังกฤษใหม่ Biolabs, Berverly, MA),รูปที่ 1 ปัสสาวะการวิเคราะห์กรดอินทรีย์ผู้ป่วย 1 (ก)ติดตามก่อนการเริ่มต้นของโบโอตินเผยยอดใหญ่ของกรดที่5.25 นาที 3 hydroxypropionic กรดที่ 7.17 นาที กรด 3-ไฮดร็อกซี่-n-valeric 9.94 นาที และ methylcrotonylglycine 3 ที่ 22.17 นาทีสอดคล้องกับการวินิจฉัยหลาย carboxylase ขาด (ข) การสืบค้นกลับ 24 วันหลังจากการเริ่มต้นของ 1.2 มิลลิกรัมของโบโอตินแสดงระดับไม่ปนกรดผิดปกติ สูงสุดที่ 36.30 ของแผงทั้งสองแสดงมาตรฐานภายใน89

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์การกลายพันธุ์
ย้อนกลับถอดความปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์
(PCR) คือการดำเนินการเกี่ยวกับเซลล์เม็ดเลือดขาว.
RNA รวมที่แยกได้โดยใช้QIAamp® RNA
เลือด Mini Kit (Qiagen, วาเลนเซีย, CA) ย้อนกลับ
ถอดความได้รับการดำเนินการโดยใช้ ImProm-II ™
กลับ Transcriptase (Promega, Madison, WI).
ภูมิภาคเข้ารหัสทั้งหมดของเอนไซม์ biotinidase ซึ่งสร้างถูก PCR
ขยายโดยสองคู่ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) PCR
ผลิตภัณฑ์มีลำดับขั้นตอนโดยตรง การกลายพันธุ์
ที่พบได้รับการยืนยันในดีเอ็นเอของ
ผู้ป่วยที่ได้รับจากเลือดโดยวิธี PCR
ลำดับ.
การวิเคราะห์ความยาวข้อ จำกัด ชิ้นส่วนความแตกต่าง
ความยาวข้อ จำกัด ชิ้นส่วน polymorphism (RFLP)
ถูกนำมาใช้เพื่อยืนยันการกลายพันธุ์ในดีเอ็นเอ
ของผู้ป่วยและหน้าจอสำหรับการแสดงตน
ของแต่ละ การกลายพันธุ์ในปกครองของพวกเขา เอนไซม์ biotinidase ซึ่งสร้าง exons
7 และ 8 ถูกขยายและรับการรักษาด้วย Foxi
หรือ HhaI (นิวอิงแลนด์ Biolabs, Berverly, MA)
รูป 1. ปัสสาวะวิเคราะห์กรดอินทรีย์ของผู้ป่วย 1. (ก) การติดตามก่อนที่จะเริ่มต้นของไบโอตินเผยให้เห็นยอดเขาที่มีขนาดใหญ่ของกรดแลคติกที่
5.25 นาที, กรด 3 hydroxypropionic ที่ 7.17 นาที, กรดไฮดรอกซี 3-N-valeric ที่ 9.94 นาที, และ 3 methylcrotonylglycine ที่ 22.17 นาที,
ที่สอดคล้องกับการวินิจฉัยของการขาดคาร์บอกซิหลาย (ข) การติดตาม 24 วันหลังจากการเริ่มต้นของ 1.2 มิลลิกรัม / วันของไบโอติน
ไม่มีการแสดงระดับที่ตรวจพบกรดที่ผิดปกติ จุดสูงสุดที่ 36.30 ของแผงทั้งเป็นตัวแทนของมาตรฐานภายใน.
89

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์การกลายพันธุ์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบย้อนกลับ( PCR ) คือใช้เม็ดเลือดขาวอาร์เอ็นเอทั้งหมดได้ใช้ qiaamp ® .ชุดมินิ ( เพิ่มเลือด , Valencia , CA ) ย้อนกลับถอดความเป็น improm II ™มีประสิทธิภาพในการreverse transcriptase ( promega เมดิสัน , WI )รหัสภูมิภาคของทั้ง hlcs คือดีเอ็นเอโดยขยายสองคู่ไพรเมอร์ ( ตารางที่ 2 ) ดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์ตรงนี้ การกลายพันธุ์พบว่าได้รับการยืนยันในดีเอ็นเอของผู้ป่วยที่ได้จากเลือดโดยวิธี PCRลำดับ .จำกัด fragment length polymorphism การวิเคราะห์จำกัด fragment length polymorphism ( RFLP )ถูกใช้เพื่อยืนยันการกลายพันธุ์ในดีเอ็นเอของผู้ป่วย และหน้าจอสำหรับตนของแต่ละการกลายพันธุ์ในผู้ปกครองของพวกเขา hlcs โค7 และ 8 ได้ขยายและรักษาด้วย foxiหรือ hhai ( อังกฤษ biolabs Berverly , MA )รูปที่ 1 กรดอินทรีย์ปัสสาวะวิเคราะห์ผู้ป่วย 1 ( ก ) ติดตามก่อนที่จะเริ่มต้นของไบโอติน เผยยอดของกรดแลคติกที่ขนาดใหญ่5.25 นาทีที่ 7.17 min 3-hydroxypropionic กรด , กรดใน 3-hydroxy-n-valeric จำนวนนาที และ 3-methylcrotonylglycine ที่ 22.17 มินสอดคล้องกับการวินิจฉัยของหลายคาร์บอกซีเลสขาด ( ข ) การติดตาม 24 วัน หลังจากการเริ่มต้น 1.2 มิลลิกรัมต่อวันของไบโอตินแสดงการตรวจพบระดับของกรดที่ผิดปกติ จุดสูงสุดที่ 36.30 ทั้งแผงแสดงมาตรฐานภายใน89