2.2. Sample preparationA portion of

2.2. Sample preparation
A portion of a homogenized mackerel fillet (5 g) was treated with chloroform (20 ml). After centrifugation at 4000 × g for 10 min at 4 °C and carefull withdrawal of the organic phase, the residual aqueous suspension was extracted with 0.15 M phosphate buffer pH 7.0 (20 ml), containing BHT 0.05% (w/v) and EDTA 0.1% (w/v). After centrifugation, the supernatant was transferred in another test tube, added with IS (200 nmols) and brought to a final volume of 25 ml. A portion of the resulting supernatant (2 ml, corresponding to the 0.4 g extract and containing 16 nmols of IS) was transferred in a glass screw capped tube equipped with a silicon/PTFE septum and added with 10 mM DAN solution in ACN (1 ml) and 0.3 M HCl aqueous solution (1 ml), to adjust pH to 2.0. After 20 min at 37 °C the reaction mixture was saturated with magnesium sulphate and shaken; an aliquot (0.1 ml) of the supernatant ACN phase was withdrawn, diluted 1:3 with HPLC eluent and 20 μL of the final mixture were injected into the HPLC instruments.

2.3. MA-DAN and MA-DNP synthesis
Excess of MA–tetrabutylammonium salt (20:1 ratio in moles with respect to DAN) was reacted with either 10 mM DAN solution in 0.01 M HCl or 10 mM DNPH solution in 2 M HCl in order to obtain precipitates of MA-DAN and MA-DNP derivatives, respectively. The solids were filtered, washed with acidic aqueous solutions and kept under vacuum. MA-DAN was dissolved in the HPLC eluent described below, while MA-DNP was dissolved in a water:ACN: acetic acid mixture (55:45:0.2); these solutions were both analyzed by spectrophotometry in the 270–330 nm range.

2.4. Apparatus and chromatographic conditions
Preliminary HPLC tests were carried out on a Shimadzu (Kyoto, Japan) instrument, composed by a LC-10AT pump, a Reodyne manual injector and a SPD-M10A diode array detector, in order to investigate the UV spectra of eluted compounds. The final experiments were carried out on a Jasco (Easton, MD, USA) instrument composed by an AS-2057 Plus autosampler, a DU-2089 Plus pump, and an UV-2075 Plus detector set at 311 nm. Chromatographic separations were performed on a 25 cm x 4.6 mm column Luna C-18 (Phenomenex, Torrance, CA, USA), using a water:ACN:HFBA 82:18:0.15 mixture. The flow rate was set at 1 ml min−1. Spectrophotometric measurements were performed on an UVIDEC-610 double beam instrument (Jasco).

2.5. Validation experiments
A standard curve was made using MA–tetrabutylammonium solutions (2 ml) in 0.15 M phosphate buffer pH 7.0 containing increasing amounts of MA (0.25, 0.5, 1, 2, 4 nmol, corresponding to 0.625, 1.25, 2.50, 5.00, 10.00 nmol/g of sample) and a same amount of IS (16 nmol), treated according the procedure above described for the supernatant portions of the aqueous extract of samples (2.2). In order to verify the matrix effect a matrix-based calibration curve was obtained by adding to 2 ml aliquots of the supernatant from a mackerel sample (with a previously estimated MA content of 1.14 nmol/g) the same amounts of MA and IS above reported. The ratios between MA and IS derivatives areas (Ra) were reported against the MA contents (nmol/g) to verify a linear relationship. The MA content in samples was calculated from the corresponding Ra using the standard calibration curve. The precision of the method was expressed as the RSD estimated using the same sample treated according the described procedure: three sets of five replicates were analyzed in three different days in order to obtain the repeatibility (or intra-day precision) and the intermediate (or inter-days) precision values. According to Mendes et al. [10], the limit of detection (LD) and quantification (LQ) were calculated as the mean of trace solution response plus 3 or 5 standard deviation of the same trace solution response (ten replicates). Trace solution content (0.07 nmol/g) was determined by diluting the lowest standard solution until the lowest concentration enabling a signal (3 signal to noise ratio) was attained.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. ตัวอย่างส่วนของเนื้อปลา homogenized เป็นกลุ่ม (5 กรัม) ถูกรักษา ด้วยคลอโรฟอร์ม (20 มล.) หลังจาก centrifugation ที่ 4000 × g ใน 10 นาทีที่ 4 ° C และถอน carefull ระยะอินทรีย์ ระงับเหลือถูกสกัด ด้วย 0.15 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 (20 มล.), ประกอบด้วยบาท 0.05% (w/v) และ EDTA 0.1% (w/v) หลังจาก centrifugation, supernatant ถูกถ่ายโอนในอีกหลอดทดสอบ เพิ่มด้วยคือ (200 nmols) และนำปริมาตรสุดท้ายของ 25 ml ส่วนของ supernatant ผลลัพธ์ (2 ml ตรงกับสารสกัด 0.4 g และประกอบด้วย nmols 16 ของ IS) ถูกโอนย้ายในควงแก้วหลอด capped พร้อม septum ซิลิคอน/PTFE และเพิ่มกับ 10 มม.โซลูชันด่าน ACN (1 ml) และ 0.3 M HCl ละลาย (1 มล.), การปรับ pH 2.0 หลังจาก 20 นาทีที่ 37 ° C ปฏิกิริยาผสมอิ่มตัวไป ด้วยแมกนีเซียมซัลเฟต และ เขย่า เป็นส่วนลงตัว (0.1 มล.) ของเฟส ACN supernatant ถูกถอน แตกออก 1:3 ด้วย HPLC eluent และ μL 20 ของส่วนผสมสุดท้ายถูกฉีดเข้าไปในเครื่องมือ HPLC2.3. ด่าน MA และ MA DNP สังเคราะห์เกิน MA – tetrabutylammonium เกลือ (อัตราส่วน 20:1 โมลกับด่าน) เป็นปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นกับทั้ง 10 มม.ด่านโซลูชันใน 0.01 M HCl หรือ 10 มม. DNPH โซลูชันใน 2 M HCl เพื่อรับ precipitates ของอนุพันธ์ MA-ด่านและ MA DNP ตามลำดับ ของแข็งมีกรอง ล้าง ด้วยโซลูชั่นอควีเปรี้ยว และเก็บไว้ภายใต้สุญญากาศ MA-ด่านถูกละลายใน eluent HPLC ที่อธิบายไว้ด้านล่าง ในขณะที่ MA DNP ที่ละลายในน้ำ: ACN: ผสมกรดน้ำส้ม (55:45:0.2); โซลูชั่นเหล่านี้ที่ทั้งสองถูกวิเคราะห์ โดย spectrophotometry ในช่วง 270-330 nm2.4 เครื่องและเงื่อนไข chromatographicHPLC ผลถูกดำเนินบนเครื่องมือ Shimadzu (เกียวโต ญี่ปุ่น) ประกอบด้วยปั๊ม LC 10AT เครื่องทำบุหรี่ด้วยตนเอง Reodyne และที่ SPD M10A ไดโอดอาร์เรย์ จับ การตรวจสอบแรมสเป็คตรา UV สาร eluted การทดลองสุดท้ายถูกดำเนินการบนเครื่องมือ Jasco (อีสตัน MD สหรัฐอเมริกา) ขึ้น autosampler AS-2057 บวก ปั๊มดู 2089 บวก และการจับ UV 2075 Plus ที่ 311 nm ประโยชน์ chromatographic ถูกดำเนินการบนคอลัมน์ 25 ซม. x 4.6 มม. Luna C-18 (Phenomenex รันซ์ CA, USA), ใช้ส่วนผสมน้ำ: ACN:HFBA 82:18:0.15 อัตราการไหลถูกตั้งค่าใน min−1 1 ml วัด spectrophotometric ถูกดำเนินการบนเครื่องมือคานคู่ UVIDEC-610 (Jasco)2.5 การตรวจสอบทดลองทำเส้นโค้งมาตรฐานใช้ MA – tetrabutylammonium โซลูชั่น (2 ml) 0.15 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 มีเพิ่มขึ้นจำนวน MA (0.25, 0.5, 1, 2, nmol 4 ที่สอดคล้องกับ 0.625, 1.25, 2.50, 5.00, 10.00 nmol/g ของตัวอย่าง) และยอดเงินเดียวกันของ IS (16 nmol), ปฏิบัติตามขั้นตอนข้างต้นอธิบายสำหรับส่วน supernatant ของสเอาท์สกัดตัวอย่าง (2.2) เพื่อตรวจสอบเมตริกซ์ เมตริกซ์โดยใช้ผลเทียบเส้นโค้งถูกรับ โดยเพิ่ม aliquots 2 ml ของ supernatant ที่จากตัวอย่างปลา (กับการประเมินก่อนหน้านี้ MA เนื้อหาของ 1.14 nmol/g) จำนวน MA และ IS ข้างเดียวกันรายงาน มีรายงานอัตราส่วนระหว่างม้าและ IS อนุพันธ์พื้นที่ (Ra) กับเนื้อหา MA (nmol/g) เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์เชิงเส้น เนื้อหา MA ในตัวอย่างได้คำนวณจาก Ra ที่สอดคล้องกันโดยใช้เส้นโค้งการปรับเทียบมาตรฐาน ความแม่นยำของวิธีการถูกแสดง RSD ที่ประเมินโดยใช้ตัวอย่างเดียวกันถือว่าตามขั้นตอนอธิบายไว้: เหมือนกับห้าสามชุดถูกวิเคราะห์ใน 3 วันแตกต่างกันเพื่อรับ repeatibility (หรือความแม่นยำภายในวัน) และค่าความแม่นยำระดับปานกลาง (หรือระหว่างวัน) ตาม Mendes et al. [10], ขีดจำกัดของการตรวจสอบ (LD) และนับ (LQ) ถูกคำนวณเป็นค่าเฉลี่ยของการตอบสนองการแก้ไขปัญหาติดตามบวกค่าส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน 3 หรือ 5 ของเดียวติดตามแก้ปัญหาคำตอบ (เหมือนกับ 10) ติดตามแก้ปัญหาเนื้อหา (0.07 nmol/g) ที่ถูกกำหนด โดย diluting โซลูชันมาตรฐานต่ำสุดจนกระทั่งได้บรรลุความเข้มข้นต่ำเปิดสัญญาณ (3 สัญญาณต่อเสียงรบกวน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 .
ตัวอย่างการเตรียมส่วนของโฮโมปลาทูทอด ( 5 กรัม ) คือการรักษาด้วยคลอโรฟอร์ม ( 20 ml . ) หลังการปั่นเหวี่ยงที่ 4000 × G สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ° C และการถอน carefull ของระยะอินทรีย์ระงับฤทธิ์ตกค้างสาร 0.15 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ( 20 มิลลิลิตร ) ผสมบาท 0.05% ( w / v ) และ EDTA 0.1% ( w / v ) หลังการปั่นเหวี่ยง ,และน่าน ถูกส่งตัวไปในหลอดทดลองอื่น เพิ่มเป็น 200 nmols ) มาเป็นเล่มสุดท้ายของ 25 มล. ส่วนของผลสูง ( 2 ml ที่ 0.4 กรัมสารสกัดและบรรจุ 16 nmols ของ ) ถูกย้ายในเกลียวแก้วฝาครอบหลอดพร้อมกับซิลิคอน / PTFE กั้นและ เพิ่ม 10 มม. แดนโซลูชั่นใน ACN ( 1 มิลลิลิตร ) และ 03 M HCl สารละลาย ( 1 มิลลิลิตร เพื่อปรับ pH 2.0 หลังจาก 20 นาทีที่ 37 ° C ปฏิกิริยาผสมอิ่มตัวกับแมกนีเซียม ซัลเฟต และหวั่นไหว ; ส่วนลงตัว ( 0.1 ml ) ของน่าน ACN เฟสถูกถอน , เจือจาง 1 : 3 ด้วยสารละลาย HPLC และ 20 μลิตรผสมสุดท้ายที่ถูกฉีดเข้าไปในกรัมเครื่องมือ

2.3 และ ma-dan ma-dnp การสังเคราะห์
เกินมา ) โมลาร์ ( 20 : เกลือ1 อัตราส่วนโมลส่วนแดน ) คือปฏิกิริยาที่มีทั้ง 10 mm สารละลาย 0.01 M HCl แดนหรือโซลูชั่น dnph 10 มม. 2 M HCl ในการสั่งซื้อที่จะได้รับ ma-dan ma-dnp precipitates และอนุพันธ์ ตามลำดับ ของแข็งถูกกรอง ล้างด้วยสารละลายที่เป็นกรด และเก็บไว้ภายใต้สุญญากาศ ma-dan ถูกละลายในสารละลาย HPLC ที่อธิบายด้านล่างในขณะที่ ma-dnp ละลายในน้ำ : ACN :ส่วนผสมของกรด ( 55:45:0.2 ) ; โซลูชั่นเหล่านี้ถูกวิเคราะห์โดยวิธีใน 270 – 330 nm ช่วง

2.4 . เครื่องมือและเงื่อนไข
เบื้องต้น HPLC ทดสอบออกบน Shimadzu ( เกียวโต , ญี่ปุ่น ) อุปกรณ์ ประกอบไปด้วย ปั๊ม lc-10at , reodyne คู่มือหัวฉีด และ spd-m10a ไดโอดเรย์ตรวจจับ เพื่อศึกษาตัวอย่าง UV สเปกตรัมของสารประกอบการทดลองสุดท้ายที่ถูกดำเนินการใน jasco ( อีสตัน , MD , USA ) อุปกรณ์แต่งโดย as-2057 บวก autosampler , du-2089 พร้อมปั๊มและเครื่องตรวจจับ uv-2075 บวกชุดที่ 311 นาโนเมตร เมื่อแยกจำนวน 25 ซม. x 4.6 มม. คอลัมน์ลูน่า - ( phenomenex Torrance , CA , USA ) , การใช้น้ำ : ACN : 0.15 hfba 82:18: ส่วนผสม อัตราการไหลเท่ากับ 1 มิลลิลิตรต่อนาที− 1วัด ) จำนวนการ uvidec-610 คู่อุปกรณ์คาน ( jasco ) .

2.5 การตรวจสอบการทดลอง
เส้นโค้งมาตรฐานทำให้ใช้ MA –โซลูชั่นโมลาร์ ( 2 มล. ) 0.15 M phosphate buffer pH 7.0 ที่มีปริมาณที่เพิ่มขึ้นมา ( 0.25 , 0.5 , 1 , 2 , 3 ซึ่งสอดคล้องกับ 0.625 , 1.25 , 2.50 , 5.00 , 10.00 ? / g ของตัวอย่าง ) และจํานวนเดียวกัน คือ ( 16 ? )การปฏิบัติตามขั้นตอนข้างต้น อธิบายส่วนที่นำสารสกัดน้ำของตัวอย่าง ( 2.2 ) เพื่อตรวจสอบเมทริกซ์ผลเส้นปรับเทียบตามตารางได้ โดยเพิ่ม 2 ml เฉยๆ และน่าน จากตัวอย่างปลาทู ( กับประมาณการก่อนหน้านี้มาเนื้อหา nmol / 1.14 กรัม ) เดียวกันและปริมาณมาอยู่เหนือรายงานอัตราส่วนระหว่างแม่และอนุพันธ์ของพื้นที่ ( RA ) มีรายงานกับเนื้อหามา ( nmol / g ) เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์เชิงเส้น มาเนื้อหาในตัวอย่างคำนวณได้จากรา ที่ใช้เส้นปรับเทียบมาตรฐาน ความแม่นยำของวิธีการแสดงออกเป็น RSD ประมาณใช้ตัวอย่างเดียวกันปฏิบัติตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ห้านาที สามชุด วิเคราะห์ในวันที่สามที่แตกต่างกันเพื่อให้ได้ repeatibility ( หรือวันความเที่ยงตรงภายใน ) และระดับกลาง ( หรือระหว่างวัน ) ค่าความแม่นยำ ตาม เมนเดส et al . [ 10 ]ขีดจำกัดของการตรวจหา ( LD ) และปริมาณ ( lq ) คิดเป็นค่าเฉลี่ยของการตอบสนองการติดตามและโซลูชั่น 3 หรือ 5 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของเดียวกันติดตามโซลูชั่นการตอบสนอง ( 10 นาที ) ติดตามเนื้อหาโซลูชั่น ( nmol / 0.07 กรัม ) ถูกกำหนดโดยเจือจางสารละลายมาตรฐานสุดจนถึงต่ำสุด ความเข้มข้นของสัญญาณ ( 3 ) อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน ) คือบรรลุ