When in the digital range (where al

When in the digital range (where all compartments contain either 0 or 1 target molecule) it is possible to multiplex qPCR assays without concern for competition or cross reactivity, as each target-containing reaction will proceed with the target binding to its primers/probe specifically, whereas no reaction will occur in compartments without targets. Having each molecule in a separate reaction compartment allows both high and low abundance targets to be counted in the same experiment without concern for “swamping out” the low abundance target (since each compartment has at most 1 target, independent of its concentration in the average sample volume). When more than one target is counted (e.g., in a duplex assay format), ratios of the counts for one target relative to another (e.g., mutant allele vs. wild type allele) enable “absolute ratios” to be quantified, using one of the targets as an internal normalizing reference (e.g., how many amplifiable genome equivalents were loaded) that has gone through the identical experiment as the other targets assayed.

In addition, since dPCR is performed as an endpoint reaction (PCR is run to completion before measuring fluorescence), having true single target molecules in isolation allows multiplexing based on probe intensity [10]. By adding the target-specific fluorescent assay at a limiting concentration, a compartment with that target molecule will be PCR-positive, but with a limited brightness at PCR endpoint. To count a second target type, a different target-specific probe with the same “color” is added at a higher concentration. A compartment with the second target will have a brighter signal at PCR endpoint than a compartment with the first target, enabling separate counts for each target. Combinations of both different color probes and different concentration probes can be used to multiplex at higher levels (Figure 2).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในช่วงดิจิตอล (ที่ช่องทั้งหมดประกอบด้วยค่า 0 หรือ 1 โมเลกุลเป้าหมาย) เป็นการ multiplex assays qPCR โดยไม่ต้องกังวลสำหรับการแข่งขันหรือระหว่างการเกิดปฏิกิริยา ปฏิกิริยากับแต่ละที่ประกอบด้วยเป้าหมายจะดำเนินการเป้าหมายผูกของไพรเมอร์/โพรบโดยเฉพาะ โดยไม่มีปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นในช่องโดยไม่มีเป้าหมาย มีโมเลกุลแต่ละช่องแยกปฏิกิริยาทำให้เป้าหมายทั้งความอุดมสมบูรณ์สูง และต่ำจะตรวจนับในการทดลองเดียวกันโดยไม่ต้องกังวลสำหรับ "swamping ออก" เป้าหมายความอุดมสมบูรณ์ต่ำ (เนื่องจากแต่ละช่องได้มากสุด 1 เป้าหมาย ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของปริมาณตัวอย่างค่าเฉลี่ย) เมื่อเป้าหมายมากกว่าหนึ่งจะนับ (เช่น ในรูปแบบที่สองวิเคราะห์), อัตราส่วนของจำนวนเป้าหมายหนึ่งสัมพันธ์กับอีก (เช่น เต่า allele เทียบกับป่าชนิด allele) เปิดใช้งาน "แบบเต็มอัตราส่วน" จะสามารถ quantified ใช้เป้าหมายอย่างใดอย่างหนึ่งเป็นการภายในอ้างอิง normalizing (เช่น เทียบเท่าจำนวนกลุ่ม amplifiable ได้โหลด) ที่ได้ไปผ่านการทดสอบที่เหมือนกันเป็นเป้าหมายอื่น ๆ assayedนอกจากนี้ เนื่องจาก dPCR ทำเป็นปฏิกิริยาที่ปลายทาง (PCR รันจนเสร็จสมบูรณ์ก่อนวัด fluorescence), มีโมเลกุลเป้าหมายเดียวจริงแยกได้มัลติเพล็กซ์แบบขึ้นอยู่กับความเข้มของโพรบ [10] โดยเพิ่มการวิเคราะห์เรืองแสงเฉพาะเป้าหมายที่เข้มข้นจำกัด ช่องกับโมเลกุลเป้าหมายที่จะเป็นบวก PCR แต่ความสว่างจำกัดที่ปลายทาง PCR การตรวจนับชนิดเป้าหมายที่สอง โพรบเป้าหมายเฉพาะแตกต่างกัน ด้วยเหมือนกัน "สี" จะถูกเพิ่มที่ความเข้มข้นสูง ช่อง ด้วยเป้าหมายที่สองจะมีสัญญาณสว่างที่ปลายทาง PCR กว่าช่องกับเป้าหมายแรก การเปิดใช้งานการตรวจนับแยกต่างหากสำหรับแต่ละเป้าหมาย สามารถใช้ชุดของคลิปปากตะเข้สีแตกต่างกันและความเข้มข้นต่าง ๆ คลิปปากตะเข้การ multiplex ในระดับที่สูงขึ้น (รูปที่ 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เมื่ออยู่ในช่วงดิจิตอล (ที่ช่องทั้งหมดมีทั้ง 0 หรือ 1 โมเลกุลเป้าหมาย) มันเป็นไปได้ที่จะ multiplex ตรวจ qPCR โดยไม่ต้องกังวลสำหรับการแข่งขันหรือการเกิดปฏิกิริยาข้ามเป็นแต่ละปฏิกิริยาเป้าหมายที่มีจะดำเนินการเป้าหมายผูกพันกับไพรเมอร์ของ / การสอบสวนโดยเฉพาะ ในขณะที่ไม่มีปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นในช่องโดยไม่มีเป้าหมาย มีแต่ละโมเลกุลในช่องปฏิกิริยาแยกต่างหากช่วยให้ทั้งสูงและต่ำเป้าหมายความอุดมสมบูรณ์ที่จะนับในการทดสอบเดียวกันโดยไม่ต้องกังวลสำหรับ "ท่วมออก" เป้าหมายความอุดมสมบูรณ์ต่ำ (เนื่องจากแต่ละช่องมีที่มากที่สุด 1 เป้าหมายที่เป็นอิสระของความเข้มข้นในค่าเฉลี่ย ปริมาณตัวอย่าง) เมื่อมากกว่าหนึ่งเป้าหมายนับ (เช่นในรูปแบบทดสอบเพล็กซ์) อัตราส่วนของการนับหนึ่งเมื่อเทียบกับเป้าหมายอื่น (เช่นอัลลีลอัลลีลที่กลายพันธุ์กับป่าประเภท) ช่วยให้ "อัตราส่วนแน่นอน" จะได้รับการวัดโดยใช้หนึ่ง เป้าหมายเป็นข้อมูลอ้างอิง normalizing ภายใน (เช่นวิธีการหลายรายการเทียบเท่าจีโนม amplifiable ถูกโหลด) ที่ได้ผ่านการทดลองเหมือนเป็นเป้าหมายอื่น ๆ assayed. นอกจากนี้ตั้งแต่ dPCR จะดำเนินการเป็นปฏิกิริยาปลายทาง (PCR จะดำเนินการให้แล้วเสร็จก่อนที่จะวัด เรืองแสง) ที่มีโมเลกุลเป้าหมายเดียวที่แท้จริงในการแยกมัลติช่วยให้ขึ้นอยู่กับความเข้มของการสอบสวน [10] โดยการเพิ่มการทดสอบเรืองแสงเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงที่ความเข้มข้นของการ จำกัด ช่องที่มีโมเลกุลเป้าหมายที่จะเป็น PCR-บวก แต่มีความสว่าง จำกัด ที่ปลายทาง PCR นับชนิดเป้าหมายที่สองการสอบสวนเป้าหมายเฉพาะที่แตกต่างกับ "สี" เดียวกันจะเพิ่มความเข้มข้นสูงกว่า ช่องที่มีเป้าหมายที่สองจะมีสัญญาณที่สดใสที่ปลายทาง PCR กว่าช่องที่มีเป้าหมายแรกที่ช่วยให้นับแยกต่างหากสำหรับแต่ละเป้าหมาย การรวมกันของทั้งสองฟิวส์สีที่แตกต่างและความเข้มข้นที่แตกต่างกัน probes สามารถใช้ในการ multiplex ในระดับที่สูงขึ้น (รูปที่ 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อในช่วงดิจิตอล ( ที่ทุกช่องมีทั้ง 0 หรือ 1 เป้าหมายโมเลกุล ) มันเป็นไปได้ที่จะเพล็ก qpcr ) โดยไม่ต้องกังวลเกี่ยวกับการแข่งขันหรือขอประทานเป็นเป้าหมายแต่ละที่มีปฏิกิริยาจะดำเนินการกับเป้าหมายผูกพันกับไพรเมอร์ / ตรวจสอบโดยเฉพาะ และไม่มีปฏิกิริยาที่จะเกิดขึ้นในช่องโดยไม่มีเป้าหมายมีช่องแยกแต่ละโมเลกุลในการช่วยให้ทั้งสูงและต่ำ มากมาย เป้าหมายที่จะถูกนับในการทดลองเดียวกันโดยไม่ต้องเป็นห่วง " swamping " ที่มีเป้าหมาย ( เพราะแต่ละช่องมีความอุดมสมบูรณ์มากที่สุด 1 เป้าหมาย อิสระของความเข้มข้นของปริมาณตัวอย่างเฉลี่ย ) เมื่อมากกว่าหนึ่งเป้าหมายการนับ ( เช่นในเพล็กซ์ ( รูปแบบ )อัตราส่วนของการนับญาติสำหรับหนึ่งเป้าหมายอื่น ( เช่น ในป่าชนิดยีนกลายพันธุ์กับ ) ให้ " แน่นอนอัตราส่วน " เป็นปริมาณการใช้หนึ่งของเป้าหมายเป็นภายใน normalizing อ้างอิง ( เช่น กี่ amplifiable จีโนมซึ่งมีโหลด ) ที่ได้ผ่านการทดลองที่เหมือนกันเป็นอีกเป้าหมาย
ml .
นอกจากนี้ตั้งแต่ dpcr จะดําเนินการเป็นปลายทาง reaction ( PCR คือวิ่งให้จบก่อนการวัดการเรืองแสง ) , มีเป้าหมายเดียวในการแยกโมเลกุลที่แท้จริงขึ้นอยู่กับความเข้มให้มัลติโพรบ [ 10 ] โดยการเพิ่มเป้าหมายในการเรืองแสงที่ความเข้มข้น , ช่องกับโมเลกุลเป้าหมายจะเพิ่มเป็นบวก แต่ด้วยความที่อาจจำกัด ) .จะนับเป้าหมายประเภทที่สอง เป็นเป้าหมายที่แตกต่างกันที่เฉพาะเจาะจงตัวเดียวกัน " สี " จะถูกเพิ่มในความเข้มข้นที่สูงขึ้น . ช่องกับเป้าหมายที่สองมีสัญญาณที่สดใสและปลายทางกว่าช่องกับเป้าหมายแรก ให้นับแยกสำหรับแต่ละเป้าหมายการรวมกันของทั้งสองที่แตกต่างกันสีและโพรบและความเข้มข้นที่แตกต่างกันสามารถใช้ในการมัลติเพล็กซ์ในระดับที่สูง

( รูปที่ 2 )