LC-MS/MS Peptide Mapping Experiment

LC-MS/MS Peptide Mapping Experiments

Chromatographic separations of digested peptide mixtures were performed using a nanoLC Ultra system (nanoLC Ultra 1D plus, Eksigent, USA) equipped with a nanoLC AS-2 autosampler (Eksigent, USA). The nanoflow system was connected to a LTQ-Orbitrap hybrid mass spectrometer (LTQ-XL and LTQ Orbitrap Discovery, Thermo Electron Corporation, USA) containing a FinniganTM nanospray ionization (NSI) source (Thermo Electron Corporation, USA). The separation of digested samples was performed with 15 cm capillary columns (150 µm i.d.) packed in-house with Kinetex 2.6-µm C18 coreshell particles (Phenomenex, Inc.) using a slurry packing procedure (Moritz, 2010). The chromatographic method used a flow rate of 300 nL min-1 with a step gradient from mobile phase A containing 0.1% formic acid in water to mobile phase B containing 0.1% formic acid in acetonitrile (0-2% B over 5 min; 2-10% B over 3 min; 10-60% B over 60 min; 60-80% B over 2 min; 80% B isocratic for 10 min; 80-2% B over 2 min; and 2% B isocratic for 8 min). The nano-ESI infusion was performed using the NSI-1 dynamic nanospray probe (Thermo Scientific, USA) equipped with a silica-tip emitter with a 10-µm diameter tip (PicoTip, New Objective, Inc., USA). Spectra of the eluted peptides were acquired in the positive ion mode in a datadependent fashion. First, the instrument was set to acquire one MS survey scan for the m/z range of 400-2000 with a resolution of 30,000 (at m/z 400) followed by MS/MS spectra of the five most intense ions from each survey scan. MS/MS fragmentation was performed using collision-induced dissociation (CID) with an activation Q of 0.250, an activation time of 30.0 ms, 35% of normalized collision energy and an isolation width of 1.0 Da. To detect lowintensity ions, we employed a dynamic exclusion of ions lasting for 30 s during acquisition of MS/MS spectra. LC-MS/MS data was compared with the theoretical MS/MS spectra obtained from in silico tryptic digests of the Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 proteome: National Center for Biotechnology Information [ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes]. We allowed two missed cleavage sites for trypsin, a precursor tolerance of 10 ppm, a fragment tolerance of 0.8 Da, static carbamidomethylation on cysteines and oxidation on methionine residues. To reduce false identifications, we restricted our analysis to matches with a Xcorr score > 2.0 for doubly-charged ions and Xcorr score > 2.5 for triply-charged ions.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การทดลองการแม็ปเปปไทด์ LC MS/MSแยกโครมาของย่อยเปปไทด์ผสมดำเนินการโดยใช้ nanoLC ระบบพิเศษ (nanoLC Ultra 1D บวก Eksigent สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับ nanoLC เป็น-2 เกิด (Eksigent สหรัฐอเมริกา) ระบบ nanoflow เชื่อมต่อไป LTQ-Orbitrap ไฮบริดมวลสเปกโตรมิเตอร์ (LTQ XL LTQ Orbitrap ค้นพบ เทอร์โมอิเล็กตรอน Corporation, USA) ที่ประกอบด้วย FinniganTM nanospray ไอออไนซ์ (NSI) แหล่งที่มา (บริษัทเทอร์โมอิเล็กตรอน สหรัฐอเมริกา) การแยกย่อยตัวอย่างดำเนินการ 15 ซม.ฝอยคอลัมน์ (150 µm ประชาชน) บรรจุในบ้านกับ Kinetex 2.6 µm C18 coreshell อนุภาค (Phenomenex, Inc.) โดยใช้สารละลายบรรจุกระบวนการ (มอริส 2010) อัตราการไหล 300 nL min-1 ด้วยการไล่ระดับสีในขั้นตอนจากมือถือเฟส A ที่มี 0.1% กรดในน้ำการเคลื่อนระยะ B มี 0.1% กรดใน acetonitrile ใช้วิธีโครมา (0-2% B มากกว่า 5 นาที บี 2-10% กว่า 3 นาที 10-60% บีมากกว่า 60 นาที B 60-80% กว่า 2 นาที isocratic 80% B 10 นาที 80 2% B มากกว่า 2 นาที และ 2% B isocratic สำหรับ 8 นาที) แช่ ESI นาโนถูกดำเนินการโดยใช้ NSI 1 nanospray แบบไดนามิกหัววัด (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับยิงแนะนำซิลิกาที่มีเส้นผ่าศูนย์กลาง 10 ไมโครเมตรทิป (PicoTip ใหม่วัตถุประสงค์ Inc., USA) สเปกตรัมของเปปไทด์ eluted ได้รับมาในโหมดไอออนบวกในแฟชั่น datadependent ครั้งแรก อุปกรณ์ถูกตั้งค่าให้ได้รับหนึ่ง MS สำรวจแกน m/z ช่วงของ 400-2000 มีความละเอียดของ 30,000 (ที่ m/z 400) ตาม ด้วย MS/MS สเปกตรัมของไอออนรุนแรงที่สุดห้าจากการสแกนแต่ละแบบสำรวจ การกระจายตัวของ MS/MS ได้ดำเนินการที่เกิดชน dissociation (CID) ด้วยการเปิดใช้งาน Q ของ 0.250 เวลาเปิดใช้งานของ ms 30.0, 35% ของแรงกระแทกมาตรฐานและความกว้างแยกของดา 1.0 ตรวจหาประจุไฟฟ้า lowintensity เราจ้างงานการยกเว้นแบบไดนามิกของไอออนเป็นเวลา 30 s ระหว่างซื้อของสเปกตรัม MS/MS LC MS/MS ข้อมูลการเปรียบเทียบสเปกตรัม MS/MS ทฤษฎีที่ได้รับจากในรูปดอกไม้ Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 proteome tryptic ถูกย่อย: ศูนย์แห่งชาติสำหรับข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ [ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes] เราอนุญาตให้สองความแตกพลาดไซต์สำหรับทริปซิน การยอมรับสารตั้งต้นของ 10 ppm ความอดทนส่วนของดา 0.8 คง carbamidomethylation บน cysteines และการเกิดออกซิเดชันในสารตกค้างเมไทโอนีน ลงรหัสผิดพลาด เราจำกัดการวิเคราะห์ของเราจะตรงกันกับ Xcorr คะแนน > 2.0 สำหรับไอออนชาร์จ doubly และ Xcorr คะแนน > 2.5 สำหรับไอออนที่มีค่า triply

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

LC-MS / MS เปปไทด์แมปการทดลอง

แยกโครมาของเปปไทด์ผสมย่อยได้ดำเนินการโดยใช้ระบบอัลตร้า nanoLC (อัลตร้า nanoLC 1D บวก Eksigent, สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับ nanoLC AS-2 autosampler (Eksigent, สหรัฐอเมริกา) ระบบ nanoflow ถูกเชื่อมต่อกับ LTQ-Orbitrap มวลสเปกโตรมิเตอร์ไฮบริด (LTQ-XL และ LTQ Orbitrap ค้นพบเทอร์โมอิเลคตรอนคอร์ปอเรชั่นสหรัฐอเมริกา) มี FinniganTM nanospray ไอออนไนซ์ (NSI) แหล่งที่มา (เทอร์โมอิเลคคอร์ปอเรชั่นประเทศสหรัฐอเมริกา) การแยกตัวอย่างย่อยได้ดำเนินการกับ 15 ซมคอลัมน์เส้นเลือดฝอย (150 ไมครอน ID) บรรจุในบ้านกับ Kinetex 2.6 ไมครอน C18 coreshell อนุภาค (Phenomenex, Inc) โดยใช้ขั้นตอนการบรรจุสารละลาย (มอริตซ์ 2010) วิธีโครมาใช้อัตราการไหล 300 nL นาที-1 ที่มีการไล่ระดับสีขั้นตอนจากขั้นตอนการเคลื่อนที่ที่มี 0.1% กรดในน้ำเพื่อเฟส B มือถือที่มีกรดฟอร์มิ 0.1% ใน acetonitrile (0-2% B มากกว่า 5 นาที 2 -10% B มากกว่า 3 นาที; 10-60% B กว่า 60 นาที; 60-80% B มากกว่า 2 นาที; 80% isocratic B เป็นเวลา 10 นาที; 80-2% B มากกว่า 2 นาทีและ 2% B isocratic 8 นาที). นาโน ESI แช่ถูกดำเนินการโดยใช้หัววัด nanospray NSI-1 แบบไดนามิก (Thermo Scientific, สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับอีซีแอลซิลิกาปลายด้วยปลายเส้นผ่าศูนย์กลาง 10 ไมครอน (PicoTip วัตถุประสงค์ใหม่, Inc, สหรัฐอเมริกา) Spectra ของเปปไทด์ที่ถูกชะมาในโหมดไอออนบวกในแฟชั่น datadependent ครั้งแรกที่ใช้มีการตั้งค่าที่จะได้รับหนึ่งสแกนสำรวจ MS สำหรับช่วง m / Z ของ 400-2000 ที่มีความละเอียด 30,000 (ที่ M / z 400) ตามด้วย MS / MS สเปกตรัมของห้าไอออนที่รุนแรงที่สุดจากการสแกนแต่ละสำรวจ . การกระจายตัวของ MS / MS ถูกดำเนินการโดยใช้การปะทะกันที่เกิดการแยกตัวออก (CID) ที่มีการเปิดใช้งาน Q 0.250, เวลาที่ใช้ MS 30.0, 35% ของพลังงานชนปกติและความกว้างแยก 1.0 ดา ในการตรวจสอบไอออน lowintensity เราจ้างยกเว้นแบบไดนามิกของไอออนยาวนานเป็นเวลา 30 วินาทีในระหว่างการเข้าซื้อกิจการของ MS / MS สเปกตรัม ข้อมูล LC-MS / MS ถูกเมื่อเทียบกับทฤษฎี MS / MS สเปกตรัมที่ได้จากการย่อยสลายใน silico tryptic ของโปรตีน Pectobacterium atrosepticum SCRI1043: แห่งชาติศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพสำหรับข้อมูล [ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes] เราอนุญาตให้ทั้งสองพลาดเว็บไซต์แตกแยกสำหรับ trypsin, ความอดทนสารตั้งต้นของ 10 ppm, ความอดทนส่วนของ 0.8 ดา carbamidomethylation คงที่ใน cysteines และการเกิดออกซิเดชันในตกค้าง methionine เพื่อลดการวินิจฉัยที่ผิดพลาดเรา จำกัด การวิเคราะห์ของเราเพื่อการแข่งขันที่มีคะแนน Xcorr> 2.0 สำหรับไอออนทวีคูณชาร์จและ Xcorr คะแนน> 2.5 ไอออน triply ชาร์จ