MATERIALS AND METHODSCell Culture a

MATERIALS AND METHODS
Cell Culture and Reagents

The human PC cell lines-MiaPaCa-2, BxPC-3, AsPC-1and HPAC were obtained from American Type Culture Collection (Manassas, VA). Colo 357 and L3.6pl cells were obtained from Dr. Paul Chaio at MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). The cell lines were maintained in continuous exponential growth in Dulbecco modified Eagle’s medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Gaithesburg, MD) supplemented with 10% FBS, 100 units/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin in a humidified incubator containing 5% CO2 in air at 37°C.

Antibodies were obtained from the following commercial sources: anti-mouse Bcl-2 and Bcl-xL antibody from Abcam (Cambridge, MA), anti-PARP antibody from Biomol Research (Plymouth, PA), Caspase-3 antibody from Cell Signaling (Beverly, MA), anti-XIAP and anti-survivin from (RandD Systems) and anti-β-actin from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). TQ (Sigma Chemicals, Ontario, Canada) and the investigated analogs were dissolved in DMSO to make 20 mM stock solution. Oxaliplatin and gemcitabine were obtained from the pharmacy of our institute.

Combinatorial Screening and Synthesis of TQ Analogs

For building a small combinatorial library of TQ analogs, we used a simple yet selective one-pot synthesis of 2, 5-bis (alkyl/aryl amino) and mercaptan 1, 4-benzoquinones as shown in Fig. 1. The reaction was found to be exceptionally selective and lead to only 2, 5-bis (alkyl/aryl-amino) 1,4-benzoquinones of the corresponding amine. We have used single-pot synthesis that induces minimal changes, as well as retains most of the original biological property of parent TQ. From the reaction mixture, the products were filtered and recrystallised. For quinone building blocks, we chose simple TQ, p-benzoquinone (TQ-2A) and 2,6-di-t-butyl benzoquinone (TQ3). By reacting compound from the quinone building block with the amines (A) to (I), we were able to generate the combinatorial matrix of 27 TQ analogs. Among these, 11 derivatives were initially screened for cell viability in the MiaPaCa-2 cell line, and three of these analogs (TQ-2G, TQ-4A1 and TQ-5A1) were found to be more potent than the parental TQ at equimolar concentrations (10 μM). Table I summarizes the chemical structure, acronyms used to cite these compounds, MW and IC50 values. Other building blocks, such as tetrachlorobenzoquinone, were also combined with amine (A) to (I) but did not yield stable compounds (data not shown) and thus were not further investigated.

Fig. 1
Fig. 1
One-pot chemical synthesis of TQ analogs. TQ-2G, TQ-4A1 and TQ-5A1 are our lead compounds with IC50 values of 3 μM, 7 μM and 5 μM, respectively, in PC cells.
Table I
Table I
TQ Analogs and Their Acronyms, Molecular Structures, MW and IC50 Values
Cell Viability Inhibition by TQ and TQ Analogs

Pancreatic cancer cells (3×103 cells/well) harboring different molecular signatures (MiaPaCa-2, BxPC-3, AsPC-1, Colo 357, L3.6pl and HPAC cells) were seeded in 96-well culture plates and replaced the next day with fresh medium containing either TQ (10 μM) or the investigational 11 analogs, diluted from stock solution. The effect of TQ and the analogs on cell viability was examined by MTT assay. The formazan formed by metabolically viable cells was dissolved in isopropanol, and the absorbance was measured at 595 nm using a plate reader (TECAN, Durham, NC), and the data was plotted as percent viable cell relative to control.

Quantification of Apoptosis

Two protocols were employed to confirm apoptosis following treatments with TQ or our analogs. The Cell Apoptosis ELISA Detection Kit (Roche, Palo Alto, CA), which quantifies the cytoplasmic histone-associated DNA fragmentation, was used according to manufacturer’s protocol. Additionally, Annexin V-FITC assay was used, and apoptotic cells were evaluated according to the manufacturer’s instructions (BD Biosciences, San Jose, CA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการการเพาะเลี้ยงเซลล์และ Reagentsเซลล์รายการบุคคลของ PC-MiaPaCa-2, BxPC 3, HPAC AsPC 1and ได้รับมาจากอเมริกาชนิดคอลเลกชันวัฒนธรรม (มานาสซาส VA) 357 โคโลและ L3.6pl เซลล์ได้รับจากดร. Paul Chaio MD ศูนย์มะเร็งแอนเดอร์สัน (Houston, TX) รายการเซลล์ถูกรักษาในเรขาคณิตอย่างต่อเนื่องในดุลเบกโกแก้ไขอินทรีกลาง (DMEM ชีวิตเทคโนโลยี Inc., Gaithesburg, MD) เสริม ด้วย 10% FBS ยาเพนนิซิลลิน 100 หน่วย/มล และ streptomycin 10 mg/ml ในการบ่มเพาะวิสาหกิจ humidified ประกอบด้วย 5% CO2 ในอากาศที่ 37 องศาเซลเซียสแอนตี้ได้รับมาจากแหล่งทางการค้าต่อไปนี้: เมาส์ป้องกัน Bcl 2 และ Bcl xL แอนติบอดีจาก Abcam (เคมบริดจ์ MA), ต่อต้าน PARP แอนติบอดีจากงานวิจัย Biomol (พลีมัธ PA), Caspase-3 แอนติบอดีจากเซลล์ตามปกติ (เบเวอร์ลี่ MA), ต่อต้าน-XIAP และ survivin ป้องกันจาก (RandD ระบบ) และต่อต้าน-β-แอกตินจาก บริษัทเคมีซิก (St. Louis, MO) TQ (ซิกเคมี Ontario ประเทศแคนาดา) และ investigated analogs ถูกละลายใน DMSO ให้โซลูชันหุ้น 20 มม. Gemcitabine และ Oxaliplatin ได้รับมาจากร้านขายยาของสถาบันของเราคัดกรองปัญหาและสังเคราะห์ TQ Analogsสำหรับการสร้างห้องสมุดปัญหาเล็ก ๆ ของ TQ analogs เราใช้การ เดินทางใช้หม้อหนึ่งสังเคราะห์ 2, 5-bis (alkyl/aryl อะมิโน) และ mercaptan 1, 4-benzoquinones แสดงใน Fig. 1 พบปฏิกิริยาจะล้ำเลือก และนำไปสู่ 2, 5-bis (alkyl/aryl-อะมิโน) 1,4-benzoquinones ของ amine ที่สอดคล้องกัน เราใช้สังเคราะห์หม้อเดียวที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด รวมทั้งรักษาทั้งคุณสมบัติทางชีวภาพของเดิมแม่ TQ จากส่วนผสมของปฏิกิริยา ผลิตภัณฑ์มีกรอง และ recrystallised สำหรับ quinone ประกอบ เราเลือกอย่าง TQ, p-benzoquinone (TQ-2A) และ benzoquinone 2,6 di-t-ด... (TQ3) โดยผสมปฏิกิริยาจากบล็อกอาคาร quinone กับ amines (A) กับ (I), ได้สร้างเมตริกซ์ปัญหาของ 27 TQ analogs ในหมู่เหล่านี้ อนุพันธ์ 11 ได้เริ่มฉายในชีวิตเซลล์ในรายการเซลล์ MiaPaCa-2 และ 3 analogs เหล่านี้ (TQ - 2G, TQ-4A1 และ TQ 5A1) พบจะมีศักยภาพมากขึ้นกว่า TQ โดยผู้ปกครองที่ความเข้มข้น equimolar (10 μM) ตารางที่ผมสรุปโครงสร้างทางเคมี ตัวย่อที่ใช้ในการอ้างอิงเหล่านี้สาร ค่า IC50 และ MW อื่น ๆ ประกอบ เช่น tetrachlorobenzoquinone ยังถูกรวมกับ amine (A) กับ (I) แต่ได้ผลตอบแทนสารตกค้าง (ข้อมูลไม่แสดง) และจึง ได้ไม่เพิ่มเติมตรวจสอบFig. 1Fig. 1สังเคราะห์เคมีหม้อหนึ่งของ TQ analogs TQ - 2G, TQ-4A1 และ TQ 5A1 ได้สารลูกค้าเป้าหมายของเรา มีค่า IC50 ของ 3 μM, 7 μM, 5 μM ตามลำดับ ในเซลล์ PCโต๊ะผมโต๊ะผมTQ Analogs และตัวย่อ โครงสร้างโมเลกุล MW และค่า IC50ยับยั้งเซลล์ชีวิต TQ และ TQ Analogsเซลล์มะเร็งตับอ่อน (3 × 103 เซลล์/ดี) harboring ลายเซ็นโมเลกุลแตกต่างกัน (MiaPaCa-2, BxPC 3, AsPC-1 โคโล 357, L3.6pl และ HPAC เซลล์) ถูก seeded ในแผ่น 96 ดีวัฒนธรรม และแทนในวันถัดไป ด้วยกลางสดประกอบด้วยทั้ง TQ (10 μM) หรือ investigational 11 analogs ผสมจากโซลูชันหุ้น ผลของ TQ และ analogs ในเซลล์นี้ถูกตรวจสอบ โดย MTT assay Formazan ที่เกิดขึ้นจากเซลล์ metabolically ได้ถูกละลายใน isopropanol และมีวัด absorbance ที่ที่ 595 nm โดยใช้เครื่องอ่านแผ่น (TECAN เดอแรม NC), และข้อมูลถูกพล็อตเป็นเซลล์ทำงานได้เปอร์เซ็นต์เมื่อเทียบกับการควบคุมนับของ Apoptosisโพรโทคอลทั้งสองได้จ้างยืนยัน apoptosis นวด TQ หรือ analogs ของเราต่อไปนี้ เซลล์ Apoptosis ELISA ตรวจชุด (โร ดัลลัส CA), ซึ่ง quantifies ที่ cytoplasmic สัมพันธ์ฮิสโตน DNA กระจายตัว ใช้ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต นอกจากนี้ ใช้ Annexin V-FITC วิเคราะห์ และเซลล์ apoptotic ถูกประเมินตามคำแนะนำของผู้ผลิต (เวลาออก BD, San Jose, CA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
เพาะเลี้ยงเซลล์และสารเคมีพีซีเซลล์ของมนุษย์สาย MiaPaCa-2, BxPC-3, ASPC-1 และ HPAC ที่ได้รับจากอเมริกันประเภทวัฒนธรรมสะสม (ซา VA) Colo 357 และเซลล์ L3.6pl ที่ได้รับจากดร. พอล Chaio ที่ศูนย์มะเร็ง MD Anderson (ฮุสตันเท็กซัส) เซลล์ที่ถูกเก็บรักษาไว้ในการเจริญเติบโตอย่างต่อเนื่องในการแก้ไข Dulbecco กลางของนกอินทรี (DMEM เทคโนโลยีชีวิต, Inc. Gaithesburg, MD) เสริมด้วย FBS 10%, 100 หน่วย / มล penicillin และ 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร streptomycin ในตู้อบที่มีความชื้น 5 % CO2 ในอากาศที่อุณหภูมิ 37 ° C. แอนติบอดีที่ได้รับจากแหล่งที่มาในเชิงพาณิชย์ต่อไปนี้: ต่อต้านเมาส์ Bcl-2 และแอนติบอดี Bcl-XL จาก Abcam (เคมบริดจ์), แอนติบอดี้ต่อต้าน PARP จาก Biomol การวิจัย (พลีมั ธ , PA) caspase-3 แอนติบอดีจากสัญญาณมือถือ (Beverly, MA) ต่อต้าน XIAP และ anti-survivin จาก (RandD Systems) และต่อต้านβ-โปรตีนจาก Sigma เคมี จำกัด (เซนต์หลุยส์) TQ (Sigma สารเคมี, Ontario, Canada) และ analogs สอบสวนถูกละลายใน DMSO ที่จะทำให้การแก้ปัญหา 20 มิลลิหุ้น Oxaliplatin และ Gemcitabine ที่ได้รับจากร้านขายยาของสถาบันของเรา. Combinatorial การคัดกรองและการสังเคราะห์ TQ Analogs สำหรับการก่อสร้างอาคารห้องสมุด combinatorial เล็ก ๆ ของ analogs TQ เราใช้ที่เรียบง่าย แต่เลือกสังเคราะห์หนึ่งหม้อของ 2, 5-ทวิ (อัลคิล / aryl อะมิโน ) และ mercaptan 1, 4-benzoquinones ดังแสดงในรูป 1. ปฏิกิริยาถูกพบว่าเป็นพิเศษเลือกและนำไปสู่การเพียง 2, 5-ทวิ (อัลคิล / aryl อะมิโน) 1,4-benzoquinones ของเอมีนที่สอดคล้องกัน เราได้ใช้การสังเคราะห์หม้อเดียวที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุดเช่นเดียวกับที่ยังคงรักษาส่วนใหญ่ของสถานที่ให้บริการทางชีวภาพเดิมของแม่ TQ จากส่วนผสมปฏิกิริยาผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการกรองและ recrystallised สำหรับการสร้างบล็อก quinone เราเลือก TQ ง่าย P-benzoquinone (TQ-2A) และ 2,6-di-t-benzoquinone บิวทิล (TQ3) โดยปฏิกิริยาสารประกอบจากการสร้างบล็อก quinone กับเอมีน (ก) ถึง (ผม) เรามีความสามารถในการสร้างเมทริกซ์ combinatorial 27 TQ analogs กลุ่มคนเหล่านี้, 11 สัญญาซื้อขายล่วงหน้าที่ได้รับการคัดเลือกในขั้นต้นสำหรับการมีชีวิตเซลล์ในสายเซลล์ MiaPaCa-2 และสามของ analogs เหล่านี้ (TQ-2G, TQ-4A1 และ TQ-5A1) พบว่ามีศักยภาพมากขึ้นกว่า TQ ผู้ปกครองที่ความเข้มข้น equimolar (10 ไมครอน) ตารางที่สรุปโครงสร้างทางเคมี, คำย่อที่ใช้ในการอ้างอิงสารเหล่านี้, MW และค่า IC50 การสร้างบล็อกอื่น ๆ เช่น tetrachlorobenzoquinone ถูกรวมกับเอมีน (ก) ถึง (ผม) แต่ไม่ได้ผลสารประกอบที่มีเสถียรภาพ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) และดังนั้นจึงไม่ได้รับการตรวจสอบต่อไป. รูป 1 รูป 1 สังเคราะห์สารเคมีหนึ่งหม้อ analogs TQ TQ-2G, TQ-4A1 และ TQ-5A1 เป็นสารประกอบนำของเรามีค่า IC50 เท่ากับ 3 ไมโครเมตร 7 ไมครอนและ 5 ไมครอนตามลำดับในเซลล์ PC. ตารางที่ตารางที่TQ Analogs และคำย่อของพวกเขาโครงสร้างโมเลกุลเมกะวัตต์และ IC50 ค่านิยมการยับยั้งมีชีวิตของเซลล์โดย TQ และ TQ Analogs ตับอ่อนเซลล์มะเร็ง (3 × 103 เซลล์ / ดี) เก็บงำลายเซ็นโมเลกุลที่แตกต่างกัน (MiaPaCa-2, BxPC-3, ASPC-1, โคโลราโด 357, L3.6pl และเซลล์ HPAC) เป็นเมล็ดใน 96 หลุมแผ่นวัฒนธรรมและแทนที่ในวันถัดไปที่มีขนาดกลางที่มีความสดใหม่ทั้ง TQ (10 ไมครอน) หรือ investigational 11 analogs เจือจางจากสารละลายหุ้น ผลกระทบของการ TQ และ analogs ในการมีชีวิตเซลล์ได้รับการตรวจสอบด้วยวิธี MTT formazan ที่เกิดขึ้นจากเซลล์ที่มีชีวิตเมตาบอลิถูกกลืนหายไปใน isopropanol และการดูดกลืนแสงวัดที่ 595 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านแผ่น (TECAN, Durham, NC) และข้อมูลที่ถูกพล็อตเป็นเซลล์ที่มีชีวิตร้อยละเมื่อเทียบกับการควบคุม. ปริมาณ Apoptosis สองโปรโตคอล ถูกจ้างเพื่อยืนยันการตายต่อไปนี้การรักษาด้วยวิธี TQ หรือ analogs ของเรา เซลล์ Apoptosis ELISA ตรวจจับ Kit (Roche, พาโลอัลโต, แคลิฟอร์เนีย) ซึ่ง quantifies ดีเอ็นเอสโตนที่เกี่ยวข้องนิวเคลียสถูกนำมาใช้ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต นอกจากนี้ Annexin V-FITC ทดสอบถูกนำมาใช้และเซลล์ apoptotic ได้รับการประเมินตามคำแนะนำของผู้ผลิต (BD ชีววิทยาศาสตร์, San Jose, CA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์และ สารเคมี

เซลล์มนุษย์ lines-miapaca-2 bxpc-3 aspc-1and , PC , hpac ได้จากประเภทคอลเลกชันวัฒนธรรมอเมริกัน ( Manassas , VA ) โคโล และ l3.6pl เซลล์ที่ได้รับจาก ดร. พอล chaio ที่ศูนย์มะเร็ง MD Anderson ( ฮูสตัน , เท็กซัส ) เซลล์เส้นรักษาในการเจริญเติบโตอย่างต่อเนื่องในดัลเบโค่นกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ดัดแปลง ,ชีวิต Technologies , Inc gaithesburg , MD ) เสริมด้วย 10% FBS , 100 หน่วยเพนนิซิลลิน / ml และ 10 mg / ml streptomycin ใน humidified ฟักไข่ที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในอากาศที่อุณหภูมิ 37 องศา C .

แอนติบอดีที่ได้จากแหล่งต่อไปนี้ : พาณิชย์ป้องกันเมาส์ bcl-2 และ BCL XL แอนติบอดีจาก ABCAM ( Cambridge , MA ) , ต่อต้าน parp แอนติบอดีจากงานวิจัย biomol ( พลีมัธ , PA )การศึกษาลักษณะแอนติบอดีจากสัญญาณมือถือ ( Beverly , MA ) ป้องกันและต่อต้านจาก xiap ดิก ( randd ระบบ ) และ anti - บีตา - actin จาก Sigma Chemical Co . ( St . Louis , MO ) พิมพ์ดีด ( Sigma สารเคมี , Ontario , แคนาดา ) และตรวจสอบสารถูกละลายใน DMSO เพื่อให้โซลูชั่นที่หุ้น 20 มิล ซาลิพลาติน และ Gemcitabine ได้รับจากร้านขายยาของสถาบันของเรา

การคัดกรองและการสังเคราะห์พิมพ์ดีดนี้

สำหรับการสร้างห้องสมุดขนาดเล็กของพิมพ์ดีดซึ่งเราใช้ง่าย แต่ใช้หม้อหนึ่งการสังเคราะห์ 2 5-bis ( อัลคิล / กลืนกันโน ) และ เมอร์แคปแทน 1 , 4-benzoquinones ดังแสดงในรูปที่ 1 ปฏิกิริยาพบว่าได้รับเลือกเป็นพิเศษและนำเพียง 2 , 5-bis ( อัลคิล / กลืนกันอะมิโน ) 1,4-benzoquinones ของเอมีนที่สอดคล้องกัน .เราใช้หม้อเดียวที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการสังเคราะห์น้อยที่สุด รวมทั้งการรักษาส่วนใหญ่ของทรัพย์สินทางชีวภาพต้นฉบับพิมพ์ดีดผู้ปกครอง จากปฏิกิริยาผสมผลิตภัณฑ์กรองและ recrystallised . สำหรับอาคารควิโนน เราเลือก TQ ง่าย p-benzoquinone ( tq-2a ) และ 2,6-di-t-butyl เบนโซควินโนน ( tq3 )โดยมีสารประกอบจากควิโนนสร้างบล็อกกับเอมีน ( ) ( ผม ) เราสามารถสร้างเมทริกซ์เชิงของ TQ 27 นี้ . ในจำนวนนี้ 11 อนุพันธ์ในขั้นแรกเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์ในเซลล์ miapaca-2 และสามของ analogs เหล่านี้ ( tq-2g tq-4a1 , และ tq-5a1 ) พบว่ามีศักยภาพมากกว่าที่ความเข้มข้นของ TQ ๆ ( 10 μ M )ตารางที่ผมสรุปโครงสร้างทางเคมี ย่อที่ใช้อ้างอิงและสารประกอบเหล่านี้ บริษัท ic50 ค่า อาคารอื่น ๆเช่น tetrachlorobenzoquinone 1 รวมกับเอมีน ( ) ( ผม ) แต่ไม่ได้ผลสารประกอบคงตัว ( ข้อมูลไม่แสดง ) และดังนั้นจึงไม่ได้ถูกสอบสวนต่อไป . .

รูปที่ 1
รูปที่ 1
หม้อการสังเคราะห์ทางเคมีของพิมพ์ดีดที่มี . tq-2g ,และ tq-4a1 tq-5a1 เป็นสารประกอบตะกั่วของเราด้วยค่า ic50 3 μม. 7 μม. 5 μเมตร ตามลำดับ ใน PC เซลล์ โต๊ะผมโต๊ะผม


TQ เต่ากระอาน และระมัดระวังของโครงสร้างโมเลกุล และเซลล์ไฟฟ้าค่า
ic50 ยับยั้งโดย TQ พิมพ์ดีดนี้

และเซลล์มะเร็งตับอ่อน 3 × 103 เซลล์ / ดี ) ที่ลายเซ็นโมเลกุลที่แตกต่างกัน ( miapaca-2 bxpc-3 aspc-1 โคโล , , , 357 , L3 .6pl hpac เซลล์ ) และเมล็ดใน 96 แผ่น และแทนที่ด้วยวัฒนธรรมในวันถัดไปกับสดอาหารที่มีทั้งพิมพ์ดีด ( 10 μ M ) หรือโครงการ 11 ชนิด , เจือจางจากหุ้นโซลูชั่น ผลของ TQ และสารในเซลล์ถูกตรวจสอบโดย MTT assay พบ ส่วนปฏิบัติการที่เกิดขึ้นจากเซลล์ถูกละลายในกระแส metabolically ได้ ,และค่าวัดที่ 595 nm ใช้เครื่องอ่านแผ่น ( TECAN , Durham , NC ) และข้อมูลที่ถูกวางแผนเป็นเปอร์เซ็นต์เซลล์ที่ทำงานได้สัมพันธ์กับการควบคุมปริมาณการตายแบบ apoptosis .



สองโปรโตคอลที่ถูกจ้างมาเพื่อยืนยันการตาย ตามรักษากับพิมพ์ดีด หรือของเรานี้ . เซลล์ ( Elisa ชุดตรวจ ( โรช , พาโลอัลโต , แคลิฟอร์เนีย )ที่ quantifies นี้หมอกแดดเกี่ยวข้องของดีเอ็นเอถูกใช้ตามขั้นตอนของผู้ผลิต นอกจากนี้ การทดสอบใช้ v-fitc ของเซลล์และเนื้อเยื่อ ได้แก่ ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ( BD BIOSCIENCES , San Jose , CA )