2.6. DNA extraction, PCR amplificat

2.6. DNA extraction, PCR amplification and DGGE
Samples collected for analysis of microbial community were kept at −20°C until analysis. DNA extraction from sediment samples was performed using the PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, CA, and USA) according to the manufacturer′s specifications. The ex- tracted DNA was quantified and purity checked by absorbance mea- surements with a spectrophotometer.
Hipervariable region 3 (V3) of the 16S rRNA gene was amplified by the primer set for bacteria 335FGC-518R (Ahn et al., 2006; Klammer et al., 2008). The 50 ml PCR mixture contained 0.5 ml of the primer set (20 mM each), 5 ml 10× PCR Buffer (Invitrogen), 1.5 ml MgCl2 (50 mM), 0.4 ml dNTP (100 mM), 1 U Taq polymerase (Platinum, Invitrogen) and 2 ml of DNA templates (approximately 20 ng) and com- pleted with sterilized ultrapure water. PCR amplification was performed by using a Mastercycler (Eppendorf). Amplification conditions were as follows: 94 °C for 5 min followed by 30 cycles of 94 °C for 1 min, 55 °C for 1 min, and 72 °C for 2 min with the final extension step at 72 °C for 10 min. All PCR products were checked by 1% (w/v) agarose gel electrophoresis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6. DNA สกัด กระบือ และ DGGEตัวอย่างที่เก็บรวบรวมสำหรับการวิเคราะห์ของชุมชนจุลินทรีย์ถูกเก็บไว้ที่ −20 ° C จนถึงการวิเคราะห์ สกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างตะกอนถูกดำเนินการโดยใช้ PowerSoil ดีเอ็นเอแยกชุด (ห้อง ปฏิบัติการ MoBio, CA และสหรัฐอเมริกา) ตามข้อกำหนด manufacturer′s Ex - tracted ดีเอ็นเอถูกวัด และตรวจสอบความบริสุทธิ์ โดยค่าไฟฟ้านครหลวง-surements กับสเปคHipervariable เขต 3 (V3) ของยีน 16S rRNA ถูกขยาย โดยไพรเมอร์ที่ตั้งสำหรับแบคทีเรีย 335FGC-518R (อาห์น et al. 2006 Klammer et al. 2008) ส่วนผสม PCR 50 ml อยู่ 0.5 ml ของไพรเมอร์ (20 มม.แต่ละ), 5 มล. 10 × PCR บัฟเฟอร์ (Invitrogen), 1.5 ml MgCl2 (50 มม.), 0.4 ml dNTP (100 มม.), 1 พอลิเมอเรส U Taq (แพลทินัม Invitrogen) และ 2 ml ของดีเอ็นเอแม่แบบ (ประมาณ 20 ฉบับ) และ pleted com ด้วยน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ผ่านการฆ่าเชื้อ กระบือได้ดำเนินการ โดยใช้ Mastercycler (Eppendorf) ขยายเงื่อนไขมีดังนี้: 94 ° C เป็นเวลา 5 นาทีตาม ด้วยรอบ 30 94 องศาเซลเซียส 1 นาที 1 นาที 55 ° C และ 72 ° C เป็นเวลา 2 นาทีสุดท้ายด้วยขั้นตอนที่ 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ทั้งหมดถูกตรวจสอบ โดยอิเจ agarose 1% (w/v)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การสกัดดีเอ็นเอขยาย PCR และ DGGE
ตัวอย่างที่เก็บได้สำหรับการวิเคราะห์ของกลุ่มจุลินทรีย์ที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์ สกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างตะกอนถูกดำเนินการโดยใช้ดีเอ็นเอ PowerSoil แยก Kit (Mobio ห้องปฏิบัติการ, CA, และสหรัฐอเมริกา) ตามข้อกำหนดของผู้ผลิต อดีตหักออกดีเอ็นเอปริมาณและความบริสุทธิ์ตรวจสอบโดยเด็ดขาด surements การดูดกลืนแสงที่มีสเปก.
ภูมิภาค Hipervariable 3 (V3) ของยีน 16S rRNA ถูกขยายจากไพรเมอร์ที่กำหนดไว้สำหรับแบคทีเรีย 335FGC-518R (Ahn et al, 2006;. Klammer et al., 2008) 50 มล. PCR ส่วนผสมที่มีอยู่ 0.5 มิลลิลิตรชุดไพรเมอร์ (20 มิลลิเมตรแต่ละ) ขนาด 5 ml 10 × PCR บัฟเฟอร์ (Invitrogen) 1.5 มล. MgCl2 (50 มิลลิเมตร) 0.4 มล. dNTP (100 มิลลิเมตร) 1 U Taq โพลิเมอร์ (แพ , Invitrogen) และ 2 มิลลิลิตรของแม่ดีเอ็นเอ (ประมาณ 20 NG) และสั่ง pleted กับน้ำบริสุทธิ์ผ่านการฆ่าเชื้อ ขยาย PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ Mastercycler (Eppendorf) เงื่อนไขการขยายมีดังนี้: 94 ° C เป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 30 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีด้วยขั้นตอนการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที . ผลิตภัณฑ์ทั้งหมด PCR ถูกตรวจสอบโดย 1% (w / v) electrophoresis agarose เจล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การสกัด DNA Amplification วิธี PCR และการทดลองการเก็บตัวอย่างเพื่อวิเคราะห์ชุมชนจุลินทรีย์ไว้ที่ 20 °− C จนถึงการวิเคราะห์ การสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างดินมีการใช้ powersoil การสกัดดีเอ็นเอ Kit ( mobio ห้องปฏิบัติการ , CA , USA ) ตามสเปคผู้ผลิต’ s แฟนเก่า - tracted ดีเอ็นเอตรวจความบริสุทธิ์ตรวจสอบโดยการดูดกลืนแสงการไฟฟ้า - surements ด้วยวัสดุภูมิภาค hipervariable 3 ( V3 ) ของ 16S rRNA ยีนที่ถูกขยายโดยไพรเมอร์ชุดสำหรับ 335fgc-518r แบคทีเรีย ( อาน et al . , 2006 ; klammer et al . , 2008 ) 50 ml ส่วนผสมที่มีอยู่ 0.5 มิลลิลิตร PCR ไพรเมอร์ชุด ( 20 mm แต่ละ ) , 10 × 5 ml ( บัฟเฟอร์ ) Invitrogen ) 1.5 ml ชุด ( 50 มม. ) , dntp 0.4 ml ( 100 มม. ) 1 U แท็ค Polymerase ( แพลทินัม Invitrogen ) และ 2 ml ของดีเอ็นเอแม่แบบ ( ประมาณ 20 นาโน ) com - pleted กับยาฆ่าเชื้อบริสุทธิ์มากน้ำ สามารถขยายได้โดยใช้ mastercycler ( เพนดอร์ฟ ) เงื่อนไขการขยายมีดังนี้ : 94 ° C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30 รอบ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 55 องศา C นาน 1 นาที และ 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที ด้วยขั้นตอนการสุดท้ายที่ 72 ° C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR ทั้งหมดถูกตรวจสอบโดย 1% ( w / v ) , เจล