The RM190 CT repeat was assayed usi

The RM190 CT repeat was assayed using the M13-
tailed forward primer RM-190 F (CACGACGTTGTAA
AACGACCTTTGTCTATCTCAAGACAC) and the reverse
primer RM-190R (TTGCAGATGTTCTTCCTGATG)
(Ayres et al. 1997; Chen et al. 2008). PCR
reactions were performed in 10 μl containing 15 ng of
genomic DNA, 0.1 μM of RM-190 F, 1 μM of RM-190R
and FAM-labelled M13 (CACGACGTTGTAAAACGAC),
0.2 mM dNTPs and 1 U GoTaq DNA Polymerase (Promega).
DNA was amplified using a touchdown program
as follows: denaturation at 94°C per 3 min, 20 cycles at
94°C per 45 sec, from 61°C to 51.5°C per 45 sec, reducing
the annealing temperature of 0.5°C for each cycle,
and 72°C per 45 sec, 24 cycles at 94°C per 45 sec, 51°C
per 45 sec and 72°C per 45 sec and a final extension of
72°C per 10 min. Labelled PCR products were run in a
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). ROX size
standard (Applied Biosystems) was used.
PCRs for dCAPS analyses of the G/T polymorphism in
intron 1 were carried out in 20 μl using GoTaq DNA
Polymerase (Promega) supplemented with 5% DMSO
and with 20 ng of genomic DNA, 1 μM of GBSS-W2F,
1 μM of GBSS-W2R (Ayres et al. 1997; Chen et al.
2008). Amplification conditions were: 94°C per 4 min
followed by 40 cycles of 94°C per 40 sec, 60°C per 50 sec
and 72°C per 1 min per kb and a final extension of 72°C
per 10 min. After amplification 5 μl of PCR products
were digested with 1 U of AccI restriction enzyme (New
England BioLabs) in a total volume of 10 μl at 37°C over
night. The samples were run on 2% agarose gel. Each
digested sample was compared alongside with its notdigested
cognate control

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ซ้ำ RM190 CT มี assayed ใช้ M13-หางพื้นไปข้างหน้า F (CACGACGTTGTAA RM-190AACGACCTTTGTCTATCTCAAGACAC) และข้ามรองพื้น RM-190R (TTGCAGATGTTCTTCCTGATG)(ออ et al. 1997 Chen et al. 2008) PCRปฏิกิริยาดำเนินใน 10 μl ที่ประกอบด้วย 15 ng ของgenomic DNA, μM 0.1 ของ RM 190 F, μM 1 ของ RM 190Rและ FAM มัน M13 (CACGACGTTGTAAAACGAC),dNTPs 0.2 mM และ 1 U GoTaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Promega)ดีเอ็นเอถูกขยายโดยใช้โปรแกรมเหรียญดังนี้: denaturation ที่ 94° C ต่อนาที 3, 20 รอบที่ลด 94° C ต่อวินาที 45, 61° c ถึง 51.5° C ต่อวินาทีที่ 45อุณหภูมิหลอมของ 0.5° C สำหรับแต่ละรอบและ 72 องศาเซลเซียสต่อวินาที 45, 24 รอบที่ 94° C ต่อวินาที 45, 51° Cต่อ 45 วินาที และ 72 องศาเซลเซียสต่อวินาทีที่ 45 และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายของ72° C ต่อ 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR มันถูกเรียกใช้ในการ3130 พันธุกรรมวิเคราะห์ (Biosystems ใช้) ขนาด ROXมีใช้มาตรฐาน (Biosystems ใช้)PCRs การวิเคราะห์ dCAPS ของโพลิมอร์ฟิซึม G/T ในintron 1 ได้ดำเนินการใน 20 μl ใช้ GoTaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Promega) เสริม ด้วย 5% DMSOและ 20 ng ของ genomic DNA, μM 1 ของ GBSS-W2FΜM 1 ของ GBSS W2R (ออ et al. 1997 Chen et alปี 2008) ถูกขยายเงื่อนไข: 94 ° C ต่อนาที 4ตามรอบ 40 94 องศาเซลเซียสต่อวินาที 40, 60° C ต่อวินาที 50และ 72° C ต่อ 1 นาทีต่อ kb และขยายสุดท้าย 72 องศาเซลเซียสต่อ 10 นาที หลังจากขยาย 5 μl ของผลิตภัณฑ์ PCRถูกต้องกับ 1 U AccI จำกัดเอนไซม์ (ใหม่BioLabs อังกฤษ) ในปริมาณรวมของ μl 10 ที่ 37 ° C มากกว่าคืน ตัวอย่างถูกเรียกใช้ในเจ 2% agarose แต่ละตัวอย่างที่ต้องมีควบคู่ไปกับเปรียบเทียบกับ notdigested ของควบคุม cognate

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

RM190 CT ซ้ำได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ M13-
เทลด์ไปข้างหน้าไพรเมอร์ RM-190 F (CACGACGTTGTAA
AACGACCTTTGTCTATCTCAAGACAC)
และกลับไพรเมอร์RM-190R (TTGCAGATGTTCTTCCTGATG)
(ยส์ et al, 1997;.. เฉิน et al, 2008) PCR
ปฏิกิริยาได้ดำเนินการใน 10 ไมโครลิตรมี 15
มณฑลของดีเอ็นเอ0.1 ไมครอนของ RM-190 F 1 ไมครอนของ RM-190R
และ FAM ติดฉลาก M13 (CACGACGTTGTAAAACGAC)
0.2 มิลลิ dNTPs 1 U GoTaq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Promega)
ดีเอ็นเอถูกขยายการใช้โปรแกรมทัชดาวน์ดังนี้ denaturation ที่ 94 ° C ต่อ 3 นาที 20 รอบที่ 94 ° C ละ 45 วินาทีจาก 61 ° C ถึง 51.5 ° C ละ 45 วินาทีลดอุณหภูมิการหลอม0.5 องศาเซลเซียสสำหรับ แต่ละรอบและ72 ° C ละ 45 วินาที 24 รอบที่ 94 ° C ละ 45 วินาที, 51 ° C ละ 45 วินาทีและ 72 ° C ละ 45 วินาทีและขยายสุดท้ายของ72 ° C ต่อ 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ป้ายวิ่งใน3130 วิเคราะห์ทางพันธุกรรม (Applied Biosystems) ROX ขนาดมาตรฐาน(Applied Biosystems) ถูกนำมาใช้. PCRs สำหรับ dCAPS วิเคราะห์ G / T ความแตกต่างในintron 1 ได้ดำเนินการใน 20 ไมโครลิตรโดยใช้ดีเอ็นเอ GoTaq โพลิเมอร์ (Promega) เสริมด้วย 5% DMSO และ 20 นาโนกรัมของดีเอ็นเอ 1 ไมครอนของเอ็นไซม์-W2F, 1 ไมครอนของเอ็นไซม์-W2R (ยส์ et al, 1997;.. เฉิน et al, 2008) เงื่อนไขขยายได้: 94 ° C ละ 4 นาทีตามด้วย40 รอบของ 94 ° C ละ 40 วินาที 60 องศาเซลเซียสละ 50 วินาทีและ72 ° C ต่อ 1 นาทีต่อกิโลและขยายสุดท้ายของ 72 ° C ต่อ 10 นาที หลังจากที่ขยาย 5 ไมโครลิตรของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อยด้วย 1 U ของเอนไซม์ จำกัด AccI (นิวอิงแลนด์BioLabs) ในปริมาณ 10 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในช่วงกลางคืน กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการทำงานใน 2% agarose เจล แต่ละตัวอย่างย่อยเมื่อเทียบข้างด้วย notdigested ควบคุมสายเลือด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ rm190 CT ซ้ำซีรั่มใช้ M13 -
หางส่งต่อรองพื้น rm-190 F ( cacgacgttgtaa
aacgacctttgtctatctcaagacac ) และย้อนกลับ
รองพื้น rm-190r ( ttgcagatgttcttcctgatg )
( Ayres et al . 1997 ; Chen et al . 2008 ) ปฏิกิริยา PCR
จำนวน 10 μผมประกอบด้วย 15 นาโน
genomic DNA ของ rm-190 μ 0.1 M F , 1 μ M ของ rm-190r
ของคุณและ labelled M13 ( cacgacgttgtaaaacgac )
02 มม. และ dntps 1 u gotaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ( promega ) .
ดีเอ็นเอ amplified ใช้โปรแกรมดาว์น
ดังนี้ ( ที่ 94 ° C ต่อ 3 นาทีที่ 94 ° C
20 รอบละ 45 วินาที จาก 61 ° C ถึง 51.5 ° C ต่อ 45 วินาที ลดอุณหภูมิการอบอ่อน 0.5
° C ในแต่ละรอบ
และ 72 °องศาเซลเซียสต่อ 45 วินาที 24 รอบที่ 94 ° C ต่อ 45 วินาที , 51 ° C
ต่อ 45 วินาทีและ 72 ° C ต่อ 45 วินาที และสุดท้ายเป็นส่วนขยายของ
72 °องศาเซลเซียสต่อ 10 นาทีและผลิตภัณฑ์ที่มีใช้ใน
3130 วิเคราะห์พันธุกรรม ( Applied Biosystems ) ขนาดมาตรฐาน
Rox ( Applied Biosystems ) คือใช้ .
pcrs สำหรับ dcaps การวิเคราะห์ G / T polymorphism ใน
iNtRON 1 ได้ดำเนินการใน 20 μผมใช้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส
gotaq ( promega ) เสริมด้วย 5% DMSO
และ 20 นาโนดีเอ็นเอ 1 μ M ของ gbss-w2f
1 μ , ของ gbss-w2r ( Ayres et al . 1997 ; Chen et al .
2008 )เงื่อนไข : 94 ° C ( ต่อ 4 นาที
ตามด้วย 40 รอบ 94 ° C ต่อ 40 วินาที , 60 ° C ต่อ 50 วินาที
และ 72 ° C ต่อ 1 นาทีต่อกิโล และส่วนขยายสุดท้าย 72 ° C
ต่อ 10 นาทีหลังจากขยาย 5 μ L สามารถถูกย่อยด้วยผลิตภัณฑ์
1 U ของเอนไซม์ ( อุบัติใหม่
อังกฤษ biolabs ) ในปริมาตรรวม 10 μ l ที่ 37 °องศาเซลเซียสมากกว่า
ตอนกลางคืน ตัวอย่างที่ใช้ 2% เจล . แต่ละ
ย่อยตัวอย่างเทียบข้างกับการควบคุมเชื้อสายของ notdigested