Determination of Phenol ContentThe

Determination of Phenol Content
The total content of phenols was determined by a modified Folin-Ciocalteau colorimetric method. The test solutions containing 100 μL of sample were mixed with 500 μL of Folin-Ciocalteu’s phenol reagent and with 500 μL of 7.5% sodium carbonate (Na2CO3). After 2 h, at room temperature in the dark, the absorbance was spectrophotometrically measured at 760 nm. The calibration curve was plotted versus concentrations of gallic acid ranging from 25 to 200 μg/mL, used as standard. The results were expressed as gallic acid equivalents per gram of dry extract.
In Vitro Antioxidant Activity Analysis
The total antioxidant activity was determined spectrophotometrically by using the Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) method, as described in Leone et al. [71], using the radical cation ABTS•+ and Trolox as standard. Ten microliters of the jellyfish extract or fractions were assayed into 1 mL of the reaction mixture and the absorbance decrease was measured at 734 nm. Solutions of 80% ethanol, acetonitrile or acetonitrile/water were used as control. A Trolox calibration curve in a range of 2.5–20 μM was prepared under the same conditions of the samples. The antioxidant capacity of the samples was calculated, on the basis of the inhibition exerted by standard Trolox concentrations at 734 nm, inhibition time being fixed at 6 min. Results were expressed as nmol of Trolox equivalents per gram of sample or per mg of contained proteins.
Fatty Acid Profiles Determination
Fatty acid methyl esters (FAME) were obtained using BF3 according to Szczesna-Antczak et al. [140] with some modifications. Upper phase (1 mL) was saponified at 90 °C for 20 min with 0.5 M KOH in methanol (3 mL). Forty-nine micrograms of the internal standard (methyl tricosanoate) were added
Mar. Drugs 2013, 11 1750
before saponification. The fatty acids were methylated by adding 14% BF3 in MeOH (2 mL) and heating at 90 °C for 10 min. After cooling, hexane (1 mL) was added and vigorously stirred for 30 s before the addition of 1 mL of sodium chloride solution (0.6%). The esterified sample was left at 4 °C for better phase separation. After collecting the supernatant, another 1.0 mL of hexane was added and stirred. The supernatant was collected and added to the previous fraction. The sample was concentrated to a final volume of 1.0 mL for GC-MS analysis.
3.8. HPLC Analysis of the UP Fraction
The pigments in upper phase were separated according to Guaratini et al. [141] using an Agilent 1100 HPLC. Analyses were carried out as described by Fraser et al. [142], with slight modifications. Isoprenoids were separated using a reverse-phase C30 column (5 μm, 250 × 4.6 mm) (YMC Inc., Wilmington, NC, USA) with mobile phases consisting of methanol (A), 0.2% ammonium acetate aqueous solution/methanol (20/80 v/v) (B), and terz-methyl butyl ether (C). The isocratic elution was as follows: 0 min, 95% A and 5% B; 0 to 12 min, 80% A, 5% B, and 15% C; 12 to 42 min, 30% A, 5% B, and 65% C; 42 to 60 min, 30% A, 5% B, and 65% C; 60 to 62 min, 95% A, and 5% B. The column was re-equilibrated for 10 min between runs. The flow rate was 1.0 mL/min, and the column temperature was maintained at 25 °C. The injection volume was 10 μL. Absorbance was registered by diode array at wavelengths of 450 and 475 nm for carotenoids and 657 nm for chlorophylls. Isoprenoids were identified by comparing their retention times and UV-visible spectra to authentic standards peridinin, lutein in ethanol and chlorophylls.
3.9. GC-MS Analysis
The analyses were performed on a GC-MS system, Shimadzu GC-17A version 3.0 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan), with MS QP5050A according to Talà et al. [143]. Compounds were separated on DB-5 capillary column having 30 m length, 0.25 mm ID and 0.25 μm thickness. The GC parameters were as follows: the column temperature was 80 °C at the injection then programmed at 10 °C/min to 150 °C, at 5 °C/min to 250 °C and maintained at 250 °C for 15 min. Split injection was conducted with a split ratio of 50:1, the flow-rate was 1.0 mL/min, carrier gas used was 99.999% pure helium, the injector temperature was 250 °C and the column inlet pressure was 74 kPa. The MS detection conditions were as follows: 250 °C interface temperature; ionization mode, EI+; electron energy, 70 eV; scanning method of acquisition, ranging from 30 to 450, for mass/charge (m/z) optimization. Spectrum data were collected at 0.5 s intervals. Solvent cut time was set at 2 min and 45 min retention time enough for all fatty acids separation all. Compounds were identified by using online NIST-library spectra and published MS data. Moreover, FAME mix (C8–C24) and PUFA No. 3 (from menhaden oil) authentic standards were used to confirm MS data.
3.10. Protein Analysis by SDS-PAGE
Different component proteins in the total extract and fractions (TE, IP and LP) and their molecular weights were assessed by electrophoresis (SDS-PAGE) on 12% separating gel with a 4% stacking gel. The Precision Plus Protein Dual Color Standard (Bio-Rad, Hertfordshire, UK) was used as molecular
Mar. Drugs 2013, 11 1751
weight marker. The protein bands were stained with 0.25% Coomassie brilliant blue R250 in 10% acetic acid and 50% methanol for 20 min. The gel was then detained with 10% acetic acid and 30% methanol overnight.
3.11. Cell Cultures
Breast cancer cell line, MCF-7, containing the estrogenic receptor, was obtained from the European Collection of Cell Cultures (ECACC, London, UK). Cell line was routinely grown in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS, 2 mM glutamine (GLN), 50 U/mL penicillin G, 50 μg/mL streptomycin (all from GIBCO) in 75 cm2 plastic flasks (Corning, NY, USA) at 37 °C in a 5% CO2 humidified atmosphere. Cells were passaged at 70%–80% confluence, about twice a week by trypsinization.
HEKa cells (Invitrogen) were cultured in Epilife Medium supplemented with HKGS, 50 U/mL of penicillin G and 50 μg/mL of streptomycin (all from GIBCO). Cells were plated at density of 150,000 cell/mL in 75 cm2 for HEKa and 250,000 cell/mL for MCF7 plastic flasks and incubated at 37 °C in a 5% CO2 humidified atmosphere and trypsinized when reached 80%–90% confluences.
3.12. Cell Viability and Treatments
Cell viability was assayed by MTS assay, as indirect measure of viable cell number, and by Trypan blue dye exclusion associated to automated cell counting (Countess® Automated Cell Counter, Invitrogen Carlsbad, CA, USA), as suitable method to asses the real number of live and dead cells, in order to overcoming the possible inaccuracy of MTS assay in presence of supplements or new bioactive chemicals [144,145].
3.12.1. MTS Assay
MCF-7 cells were seeded in flat bottomed 96-well plates (Corning, NY, USA) at 25 × 104 cells/well in 200 μL of RPMI medium supplemented with FBS, GLN and AA and HEKa were seeded at 25 × 104 cells/well in 200 μL supplemented Epilife Medium, and allowed to attach for 24 h at 37 °C in a 5% CO2 humidified atmosphere. Subsequently, the culture medium was replaced with complete medium containing the extract fractions at the following protein concentrations: UP, ranging from 0.0005 to 0.015 μg/μL and IP and LP from 0.005 to 0.08 μg/μL. For negative controls, the test compounds were replaced with solvent only (0.1% acetonitrile) or medium only, controls were included on each plate. Each treatment was performed in quadruplicate. The cells were then incubated for 16 h at 37 °C and 5% CO2 and assayed for vitality by MTS assay. Twenty microliters of CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI, USA) were added to each well according to the manufacturer’s instructions. After 1 h in culture the cell viability was determined as assessment of metabolic activity by measuring the absorbance at 490 nm using a 3550 Ultra Microplate Reader (Biorad Instruments) (Bio-Rad, Hertfordshire, UK). The assay was performed in quadruplicate for three independent experiments and the results were expressed as a percentage of control

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กำหนดวางเนื้อหาเนื้อหาทั้งหมดของ phenols ถูกกำหนด โดยวิธีการเทียบเคียง Folin-Ciocalteau แก้ไข วิธีทดสอบประกอบด้วย μL 100 ของอย่างถูกผสม กับ μL 500 ของรีเอเจนต์วาง Folin-Ciocalteu และ μL 500 ของ 7.5% โซเดียมคาร์บอเนต (Na2CO3) หลังจาก h 2 ที่อุณหภูมิห้องในมืด absorbance ที่ถูก spectrophotometrically วัดที่ 760 nm โค้งเทียบถูกพล็อตเทียบกับความเข้มข้นของกรด gallic ตั้งแต่ 25 ถึง 200 μg/mL ใช้เป็นมาตรฐาน ผลลัพธ์ได้แสดงเป็นเทียบเท่ากรด gallic ต่อกรัมของสารสกัดแห้งในการวิเคราะห์กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระเครื่องกิจกรรมที่รวมสารต้านอนุมูลอิสระได้กำหนด spectrophotometrically โดยวิธี Trolox เทียบเท่าสารต้านอนุมูลอิสระผลิต (TEAC) ตามที่อธิบายไว้ในเซียร์ราลีโอน et al. [71], ใช้ cation รุนแรง ABTS• + และ Trolox เป็นมาตรฐาน สารสกัดจาก microliters สิบของแมงกะพรุน หรือเศษถูก assayed ใน 1 mL ของผสมปฏิกิริยา และลด absorbance ที่วัดได้ที่ 734 nm โซลูชั่น ของเอทานอล 80%, acetonitrile acetonitrile/น้ำ ถูกใช้เป็นตัวควบคุม Trolox เทียบเส้นโค้งในช่วง 2.5-20 μM เตรียมไว้ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันของตัวอย่าง กำลังการผลิตสารต้านอนุมูลอิสระอย่างถูกคำนวณ ยับยั้งนั่นเอง โดยความเข้มข้นของ Trolox มาตรฐานที่ 734 nm ยับยั้งเวลากำลังคงที่ต่ำสุด 6 ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็น nmol เทียบเท่า Trolox ต่อกรัมของตัวอย่าง หรือ ต่อมิลลิกรัมโปรตีนมีอยู่กำหนดโพรไฟล์ของกรดไขมันกรดไขมัน methyl esters (เฟม) ได้รับใช้ BF3 ตาม Szczesna Antczak et al. [140] ปรับเปลี่ยนบางอย่าง บนเฟส (1 mL) ถูก saponified ที่ 90 ° C สำหรับ 20 นาที 0.5 เมตรเกาะในเมทานอล (3 มล.) เพิ่ม micrograms สี่สิบเก้าของมาตรฐานภายใน (methyl tricosanoate)มี.ค.ยา 2013, 11 1750ก่อนสะพอนิฟิ กรดไขมันถูก methylated เพิ่ม 14% BF3 ในทานอ (2 mL) และความร้อนที่ 90 ° C สำหรับ 10 นาที หลังจากทำความเย็น เฮกเซน (1 mL) ถูกเพิ่ม และโยคะกวนสำหรับ 30 s ก่อนที่จะเพิ่ม 1 mL ของโซเดียมคลอไรด์ (0.6%) ตัวอย่าง esterified ถูกทิ้งที่ 4 ° C ในระยะแยกดีกว่า หลังจากรวบรวม supernatant มลอีก 1.0 ของเฮกเซนถูกเพิ่ม และกวน Supernatant ถูกรวบรวม และเพิ่มเศษส่วนก่อนหน้านี้ ตัวอย่างเข้มข้นการปริมาตรสุดท้ายของ 1.0 mL สำหรับวิเคราะห์ GC MS3.8 วิเคราะห์ HPLC เศษขึ้นThe pigments in upper phase were separated according to Guaratini et al. [141] using an Agilent 1100 HPLC. Analyses were carried out as described by Fraser et al. [142], with slight modifications. Isoprenoids were separated using a reverse-phase C30 column (5 μm, 250 × 4.6 mm) (YMC Inc., Wilmington, NC, USA) with mobile phases consisting of methanol (A), 0.2% ammonium acetate aqueous solution/methanol (20/80 v/v) (B), and terz-methyl butyl ether (C). The isocratic elution was as follows: 0 min, 95% A and 5% B; 0 to 12 min, 80% A, 5% B, and 15% C; 12 to 42 min, 30% A, 5% B, and 65% C; 42 to 60 min, 30% A, 5% B, and 65% C; 60 to 62 min, 95% A, and 5% B. The column was re-equilibrated for 10 min between runs. The flow rate was 1.0 mL/min, and the column temperature was maintained at 25 °C. The injection volume was 10 μL. Absorbance was registered by diode array at wavelengths of 450 and 475 nm for carotenoids and 657 nm for chlorophylls. Isoprenoids were identified by comparing their retention times and UV-visible spectra to authentic standards peridinin, lutein in ethanol and chlorophylls.3.9. GC-MS AnalysisThe analyses were performed on a GC-MS system, Shimadzu GC-17A version 3.0 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan), with MS QP5050A according to Talà et al. [143]. Compounds were separated on DB-5 capillary column having 30 m length, 0.25 mm ID and 0.25 μm thickness. The GC parameters were as follows: the column temperature was 80 °C at the injection then programmed at 10 °C/min to 150 °C, at 5 °C/min to 250 °C and maintained at 250 °C for 15 min. Split injection was conducted with a split ratio of 50:1, the flow-rate was 1.0 mL/min, carrier gas used was 99.999% pure helium, the injector temperature was 250 °C and the column inlet pressure was 74 kPa. The MS detection conditions were as follows: 250 °C interface temperature; ionization mode, EI+; electron energy, 70 eV; scanning method of acquisition, ranging from 30 to 450, for mass/charge (m/z) optimization. Spectrum data were collected at 0.5 s intervals. Solvent cut time was set at 2 min and 45 min retention time enough for all fatty acids separation all. Compounds were identified by using online NIST-library spectra and published MS data. Moreover, FAME mix (C8–C24) and PUFA No. 3 (from menhaden oil) authentic standards were used to confirm MS data.3.10. Protein Analysis by SDS-PAGEDifferent component proteins in the total extract and fractions (TE, IP and LP) and their molecular weights were assessed by electrophoresis (SDS-PAGE) on 12% separating gel with a 4% stacking gel. The Precision Plus Protein Dual Color Standard (Bio-Rad, Hertfordshire, UK) was used as molecularMar. Drugs 2013, 11 1751
weight marker. The protein bands were stained with 0.25% Coomassie brilliant blue R250 in 10% acetic acid and 50% methanol for 20 min. The gel was then detained with 10% acetic acid and 30% methanol overnight.
3.11. Cell Cultures
Breast cancer cell line, MCF-7, containing the estrogenic receptor, was obtained from the European Collection of Cell Cultures (ECACC, London, UK). Cell line was routinely grown in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS, 2 mM glutamine (GLN), 50 U/mL penicillin G, 50 μg/mL streptomycin (all from GIBCO) in 75 cm2 plastic flasks (Corning, NY, USA) at 37 °C in a 5% CO2 humidified atmosphere. Cells were passaged at 70%–80% confluence, about twice a week by trypsinization.
HEKa cells (Invitrogen) were cultured in Epilife Medium supplemented with HKGS, 50 U/mL of penicillin G and 50 μg/mL of streptomycin (all from GIBCO). Cells were plated at density of 150,000 cell/mL in 75 cm2 for HEKa and 250,000 cell/mL for MCF7 plastic flasks and incubated at 37 °C in a 5% CO2 humidified atmosphere and trypsinized when reached 80%–90% confluences.
3.12. Cell Viability and Treatments
Cell viability was assayed by MTS assay, as indirect measure of viable cell number, and by Trypan blue dye exclusion associated to automated cell counting (Countess® Automated Cell Counter, Invitrogen Carlsbad, CA, USA), as suitable method to asses the real number of live and dead cells, in order to overcoming the possible inaccuracy of MTS assay in presence of supplements or new bioactive chemicals [144,145].
3.12.1. MTS Assay
MCF-7 cells were seeded in flat bottomed 96-well plates (Corning, NY, USA) at 25 × 104 cells/well in 200 μL of RPMI medium supplemented with FBS, GLN and AA and HEKa were seeded at 25 × 104 cells/well in 200 μL supplemented Epilife Medium, and allowed to attach for 24 h at 37 °C in a 5% CO2 humidified atmosphere. Subsequently, the culture medium was replaced with complete medium containing the extract fractions at the following protein concentrations: UP, ranging from 0.0005 to 0.015 μg/μL and IP and LP from 0.005 to 0.08 μg/μL. For negative controls, the test compounds were replaced with solvent only (0.1% acetonitrile) or medium only, controls were included on each plate. Each treatment was performed in quadruplicate. The cells were then incubated for 16 h at 37 °C and 5% CO2 and assayed for vitality by MTS assay. Twenty microliters of CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI, USA) were added to each well according to the manufacturer’s instructions. After 1 h in culture the cell viability was determined as assessment of metabolic activity by measuring the absorbance at 490 nm using a 3550 Ultra Microplate Reader (Biorad Instruments) (Bio-Rad, Hertfordshire, UK). The assay was performed in quadruplicate for three independent experiments and the results were expressed as a percentage of control

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ความมุ่งมั่นของฟีนอลเนื้อหา
เนื้อหาทั้งหมดของฟีนอลถูกกำหนดโดยการปรับเปลี่ยน Folin-Ciocalteau วิธีการสี โซลูชั่นการทดสอบที่มี 100 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างได้รับการผสมกับ 500 ไมโครลิตรของ Folin-Ciocalteu ของสารฟีนอลและ 500 ไมโครลิตรโซเดียมคาร์บอเนต 7.5% (Na2CO3) หลังจากนั้น 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด, การดูดกลืนแสงวัด spectrophotometrically ที่ 760 นาโนเมตร กราฟมาตรฐานได้รับการพล็อตเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของกรดแกลลิตั้งแต่ 25-200 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรนำมาใช้เป็นมาตรฐาน ผลการวิจัยแสดงเป็นรายการเทียบเท่ากรดแกลลิกรัมต่อของสารสกัดแห้ง.
ในหลอดทดลองการวิเคราะห์ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ
สารต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดถูกกำหนด spectrophotometrically โดยการใช้กำลังการผลิตสารต้านอนุมูลอิสระ Trolox Equivalent (TEAC) วิธีการที่อธิบายไว้ในราลีโอนและคณะ [71] โดยใช้ไอออนอนุมูลอิสระ ABTS • + และ Trolox เป็นมาตรฐาน สิบ microliters ของสารสกัดจากแมงกะพรุนหรือชิ้นส่วนที่ถูก assayed เป็น 1 มิลลิลิตรผสมปฏิกิริยาและการลดลงการดูดกลืนแสงวัดที่ 734 นาโนเมตร โซลูชั่นของเอทานอล 80% acetonitrile หรือ acetonitrile / น้ำถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม เส้นโค้งการสอบเทียบ Trolox ในช่วง 2.5-20 ไมครอนได้จัดทำขึ้นภายใต้เงื่อนไขเดียวกันของกลุ่มตัวอย่าง สารต้านอนุมูลอิสระของกลุ่มตัวอย่างที่คำนวณบนพื้นฐานของการยับยั้งการกระทำโดยความเข้มข้นของมาตรฐาน Trolox ที่ 734 นาโนเมตรที่เวลายับยั้งถูกกำหนดไว้ที่ 6 นาที ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นนาโนโมเทียบเท่า Trolox ต่อกรัมของตัวอย่างหรือต่อมิลลิกรัมของโปรตีนที่มีอยู่.
ไขมันกรดกําหนด
ไขมันเมทิลเอสเตอร์ของกรด (FAME) ที่ได้รับการใช้ BF3 ตามSzczęsna-Antczak และคณะ [140] ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ขั้นตอนบน (1 มิลลิลิตร) ถูก saponified ที่ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีกับ 0.5 M KOH ในเมทานอล (3 มิลลิลิตร) สี่สิบเก้าไมโครกรัมของมาตรฐานภายใน (methyl tricosanoate) ถูกเพิ่ม
มีนาคม ยาเสพติด 2013, 11 1750
ก่อนที่จะสะพอ กรดไขมันที่ถูก methylated โดยการเพิ่ม BF3 14% ในเมธานอล (2 มิลลิลิตร) และความร้อนที่ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที หลังจากที่เย็นเฮกเซน (1 มิลลิลิตร) ถูกบันทึกและกวนอย่างจริงจังสำหรับ 30 วินาทีก่อนที่นอกเหนือจาก 1 มิลลิลิตรของสารละลายโซเดียมคลอไรด์ (0.6%) ตัวอย่าง esterified ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสการแยกเฟสที่ดีขึ้น หลังจากรวบรวมใสอีก 1.0 มิลลิลิตรของเฮกเซนถูกเพิ่มเข้ามาและขยับ ใสถูกเก็บรวบรวมและเพิ่มส่วนก่อนหน้านี้ ตัวอย่างที่ได้รับความเข้มข้นในการเล่มสุดท้ายของ 1.0 มิลลิลิตรสำหรับการวิเคราะห์ GC-MS.
3.8 วิเคราะห์ HPLC ของ UP เศษ
เม็ดสีในขั้นตอนบนถูกแยกออกไปตาม Guaratini และคณะ [141] โดยใช้ Agilent 1100 HPLC การวิเคราะห์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยเฟรเซอร์และคณะ [142] ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย isoprenoids ถูกแยกออกโดยใช้ย้อนกลับเฟส C30 คอลัมน์ (5 ไมครอน, 250 × 4.6 มิลลิเมตร) (YMC Inc. , Wilmington, NC, USA) โดยมีขั้นตอนการมือถือประกอบด้วยเมทานอล (A), 0.2% แอมโมเนียมสารละลายอะซิเตท / เมทานอล (20 / 80 v / v) (ข) และสามขา-methyl อีเทอร์บิวทิล (C) ชะ Isocratic เป็นดังนี้: 0 นาที, 95% และ 5% B; 0-12 นาที, 80%, 5% B, และ 15% C; 12-42 นาที, 30%, 5% B, และ 65% C; 42-60 นาที, 30%, 5% B, และ 65% C; 60-62 นาที, 95% และ 5% B. คอลัมน์อีกครั้ง equilibrated เวลา 10 นาทีระหว่างวิ่ง อัตราการไหลถูก 1.0 มิลลิลิตร / นาทีและอุณหภูมิคอลัมน์ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 25 ° C ปริมาณการฉีดคือ 10 ไมโครลิตร การดูดกลืนแสงได้รับการจดทะเบียนโดยอาร์เรย์ไดโอดในช่วงความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรและ 475 สำหรับ carotenoids และ 657 นาโนเมตรสำหรับ chlorophylls isoprenoids ถูกระบุโดยการเปรียบเทียบเวลาการเก็บรักษาของพวกเขาและสเปกตรัมรังสียูวีที่มองเห็นได้มาตรฐานที่แท้จริง peridinin, ลูทีนในเอทานอลและคลอโรฟิ.
3.9 GC-MS การวิเคราะห์
การวิเคราะห์ได้ดำเนินการในระบบ GC-MS, Shimadzu GC-17A รุ่น 3.0 (Shimadzu Co. , เกียวโตประเทศญี่ปุ่น) กับ MS QP5050A ตาม Tala และคณะ [143] สารประกอบที่ถูกแยกออกใน DB-5 คอลัมน์เส้นเลือดฝอยมี 30 เมตรความยาว 0.25 มมประชาชนและ 0.25 ไมโครเมตรความหนา พารามิเตอร์ GC มีดังนี้อุณหภูมิคอลัมน์ 80 ° C ที่ฉีดโปรแกรมแล้วที่ 10 ° C / นาทีถึง 150 ° C ที่ 5 องศาเซลเซียส / นาทีถึง 250 องศาเซลเซียสและเก็บรักษาไว้ที่ 250 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที ฉีดแยกได้ดำเนินการกับอัตราส่วนแบ่ง 50: 1, อัตราการไหลเป็น 1.0 มิลลิลิตร / นาที, ก๊าซที่ใช้เป็น 99.999% ฮีเลียมบริสุทธิ์อุณหภูมิหัวฉีด 250 องศาเซลเซียสและความดันขาเข้าคอลัมน์ 74 kPa เงื่อนไขการตรวจสอบ MS มีดังนี้: 250 ° C อุณหภูมิอินเตอร์เฟซ; โหมดไอออนไนซ์, EI +; พลังงานอิเล็กตรอน 70 eV; วิธีการสแกนของการเข้าซื้อกิจการตั้งแต่ 30-450 สำหรับมวล / ค่าใช้จ่าย (m / Z) การเพิ่มประสิทธิภาพ ข้อมูลสเปกตรัมถูกเก็บรวบรวมในช่วงเวลา 0.5 วินาที เวลาตัดตัวทำละลายตั้งอยู่ที่ 2 นาทีและ 45 นาทีเก็บรักษาเวลามากพอสำหรับทุกกรดไขมันที่แยกทั้งหมด สารประกอบที่ถูกระบุโดยใช้ออนไลน์สเปกตรัม NIST ห้องสมุดและตีพิมพ์ข้อมูล MS นอกจากนี้ผสม FAME (C8-C24) และ PUFA ฉบับที่ 3 (จากน้ำมัน menhaden) มาตรฐานของแท้ถูกนำมาใช้เพื่อยืนยันข้อมูล MS.
3.10 การวิเคราะห์โปรตีนโดยวิธี SDS-PAGE
โปรตีนองค์ประกอบที่แตกต่างกันในสารสกัดจากทั้งหมดและเศษส่วน (TE, IP และ LP) และน้ำหนักโมเลกุลของพวกเขาได้รับการประเมินโดย electrophoresis (SDS-PAGE) เมื่อวันที่ 12% แยกเจลเจลซ้อน 4% Precision โปรตีนพลัสคู่มาตรฐานสี (Bio-Rad, Hertfordshire, สหราชอาณาจักร) ถูกใช้เป็นโมเลกุล
มีนาคม ยาเสพติด 2013, 11 1751
เครื่องหมายน้ำหนัก แถบโปรตีนที่ถูกย้อมด้วย 0.25% Coomassie R250 สีฟ้าสดใสใน 10% กรดอะซิติกและเมทานอล 50% เป็นเวลา 20 นาที เจลถูกกักตัวไว้แล้ว 10% กรดอะซิติกและ 30% ในชั่วข้ามคืนเมทานอล.
3.11 เซลล์วัฒนธรรม
เซลล์มะเร็งเต้านม, MCF-7 ที่มีตัวรับ estrogenic, ที่ได้รับจากการสะสมของยุโรปวัฒนธรรมเซลล์ (ECACC ลอนดอนสหราชอาณาจักร) เซลล์ปลูกเป็นประจำในกลาง RPMI-1640 เสริมด้วย 10% FBS, 2 มิลลิ glutamine (GLN) 50 U / mL penicillin G, 50 ไมโครกรัม streptomycin / mL (ทั้งหมดจาก Gibco) ใน 75 cm2 ขวดพลาสติก (Corning, นิวยอร์ก, USA) ที่ 37 ° C ใน CO2 5% ความชื้นบรรยากาศ เซลล์ที่ถูก passaged ที่ 70% -80% บรรจบกันประมาณสัปดาห์ละสองครั้งโดย trypsinization.
เซลล์ Heka (Invitrogen) ถูกนำมาเลี้ยงใน Epilife กลางเสริมด้วย HKGS, 50 U / ml penicillin G และ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร streptomycin (ทั้งหมดจาก Gibco ) เซลล์ที่ถูกชุบที่อัตราความหนาแน่น 150,000 เซลล์ / มิลลิลิตรใน 75 cm2 สำหรับ Heka และ 250,000 เซลล์ / มิลลิลิตรสำหรับขวดพลาสติก MCF7 และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศ CO2 5% ความชื้นและ trypsinized เมื่อถึง 80% -90% confluences.
3.12 มีชีวิตของเซลล์และการรักษา
ความมีชีวิตของเซลล์ได้รับการวิเคราะห์ด้วยวิธีเอ็มทีเอเป็นตัวชี้วัดทางอ้อมของจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตและการยกเว้นสีย้อม Trypan สีฟ้าที่เกี่ยวข้องกับเซลล์นับอัตโนมัติ (Automated Countess®มือเคาน์เตอร์ Invitrogen คาร์ลส, CA, USA), วิธีการที่เหมาะสมที่จะ ประเมินตัวเลขที่แท้จริงของการอยู่อาศัยและเซลล์ที่ตายแล้วเพื่อที่จะเอาชนะความไม่ถูกต้องเป็นไปได้ของการทดสอบเอ็มทีเอในการปรากฏตัวของผลิตภัณฑ์เสริมอาหารหรือสารเคมีที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพใหม่ [144145].
3.12.1 เอ็มทีเอ Assay
MCF-7 เซลล์เป็นเมล็ดแบนในจุดต่ำสุดแผ่น 96 หลุม (Corning, NY, USA) ที่ 25 × 104 เซลล์ / ดีใน 200 ไมโครลิตรของกลาง RPMI เสริมด้วย FBS, GLN และ AA และ Heka เป็นเมล็ดที่ 25 × 104 เซลล์ / ดีใน 200 ไมโครลิตรเสริม Epilife ขนาดกลาง, และได้รับอนุญาตที่จะแนบเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C ใน CO2 5% ความชื้นบรรยากาศ ต่อมากลางวัฒนธรรมถูกแทนที่ด้วยสื่อที่สมบูรณ์แบบที่มีเศษส่วนสารสกัดที่เข้มข้นของโปรตีนต่อไปนี้: ขึ้นตั้งแต่ 0.0005-0.015 ไมโครกรัม / ไมโครลิตรและ IP และ LP 0.005-0.08 ไมโครกรัม / ไมโครลิตร สำหรับการควบคุมการลบสารทดสอบถูกแทนที่ด้วยตัวทำละลายเพียง (0.1% acetonitrile) หรือขนาดกลางเพียงการควบคุมถูกรวมอยู่ในแต่ละจาน การรักษาแต่ละคนได้ดำเนินการใน quadruplicate เซลล์ถูกบ่มแล้วเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและ CO2 5% และ assayed สำหรับพลังด้วยวิธีเอ็มทีเอ ยี่สิบ microliters ของ CellTiter 96®น้ำหนึ่งโซลูชั่น Reagent (Promega เมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละดีตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากที่เวลา 1 ชั่วโมงในการเพาะเลี้ยงเซลล์มีชีวิตถูกกำหนดการประเมินของกิจกรรมการเผาผลาญโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรโดยใช้ 3550 อัลตร้าไมโครอ่าน (เครื่องดนตรี Biorad) (Bio-Rad, Hertfordshire, สหราชอาณาจักร) การทดสอบได้รับการดำเนินการใน quadruplicate สามทดลองที่เป็นอิสระและผลที่ได้รับการแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การหาปริมาณของฟีนอล
เนื้อหาทั้งหมดของบุคคลถูกกำหนดโดยการแก้ไข folin ciocalteau Colorimetric method . โซลูชั่นทดสอบจำนวน 100 ลิตร ผสมกับμจำนวน 500 μ L ของ folin ciocalteu ฟีนอลและรีเอเจนต์กับ 500 μผม 7.5 % โซเดียมคาร์บอเนต ) หลังจาก 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้องมืด นเป็นนี้วัดที่ 760 นาโนเมตรปรับแต่งลักษณะวางแผนเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของกรดแกลลิค ตั้งแต่ 25 ถึง 200 μ g / ml ใช้เป็นมาตรฐาน ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นกรดแกลลิค ส่วน 1 กรัมในหลอดทดลองสารสกัดแห้ง

กิจกรรมการวิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดถูกกำหนดโดยการใช้สารนี้เทียบเท่าสารต้านอนุมูลอิสระความจุ ( Teac ) วิธีตามที่อธิบายไว้ในเซียร์ราลีโอน et al . [ 71 ] ใช้รากและไอออนบวก Abbr - สาร เป็นมาตรฐาน 10 ตัวเลขของแมงกะพรุนสกัดหรือเศษส่วนมีปริมาณ 1 มิลลิลิตร ลงในส่วนผสมและปฏิกิริยาการดูดกลืนแสงลดลงเป็นวัดที่คุณ nm . โซลูชั่นของเอทานอล 80% , ไน หรือ ไน / น้ำที่ใช้ควบคุม เป็นสารปรับแต่งกราฟในช่วงที่ 25 – 20 μ M ถูกเตรียมภายใต้เงื่อนไขเดียวกันของตัวอย่าง ความจุของสารต้านอนุมูลอิสระอย่างถูกคำนวณบนพื้นฐานของปริมาณสารยับยั้งนั่นเอง โดยมาตรฐานที่คุณ nm การยับยั้งการแก้ไขใน 6 นาที ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็น ? ของเทียบเท่า 1 กรัม หรือสารตัวอย่างต่อมิลลิกรัมโปรตีนมีปริมาณกรดไขมัน
.
โปรไฟล์กรดไขมันเมทิลเอสเทอร์ ( ชื่อเสียง ) ที่ได้รับการ szczesna BF3 ตาม antczak et al . [ 140 ] กับการปรับเปลี่ยน บนเฟส ( 1 มล. ) คือการดูดซึมที่ 90 ° C เป็นเวลา 20 นาที เกาะในเมทานอล 0.5 M ( 3 ml . ) สี่สิบเก้าไมโครกรัมของมาตรฐานภายใน ( เมทิล tricosanoate ) มีการเพิ่มยา
มี.ค. 2013 , 11 1750
ก่อนที่สปอนนิฟิเคชั่น .กรดไขมันเป็น methylated BF3 14% ใน โดยการเพิ่มปริมาณ 2 มิลลิลิตร ) และความร้อนที่อุณหภูมิ 90 องศา C นาน 10 นาที หลังจากเย็นเฮกเซน ( 1 มล. ) เพิ่มและชะมัดกวน 30 ก่อนที่จะเพิ่ม 1 มิลลิลิตรของสารละลายโซเดียมคลอไรด์ ( 0.6% ) การ esterified ตัวอย่างที่ถูกทิ้งไว้ที่ 4 ° C สำหรับการแยกเฟสดีกว่า หลังจากรวบรวมนำอีก 1.0 มิลลิลิตรของน้ำถูกเพิ่มและคนและน่าน รวบรวมข้อมูล และเพิ่มสัดส่วนเดิม ตัวอย่างที่ความเข้มข้นสุดท้ายปริมาตร 1.0 มิลลิลิตรสำหรับการวิเคราะห์ GC-MS .
3.8 . การวิเคราะห์ HPLC จากขึ้นเศษส่วน
สีในตอนระยะแยกตาม guaratini et al . [ 141 ] ใช้ Agilent 1100 กรัม . การวิเคราะห์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยเฟรเซอร์ et al . [ 142 ] ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยไอโซพรีน ด์แยกใช้กลับเฟส C30 คอลัมน์ ( 5 μ M 250 × 4.6 มิลลิเมตร ) ( ymc อิงค์ , Wilmington , NC , USA ) กับมือถือระยะประกอบด้วยเมทานอล ( ) 0.2% สารละลายแอมโมเนียมอะซิเตท / เมทานอล ( 20 / 80 ( v / v ) ( B ) และสารบิวทิลอีเทอร์ Terz ( C ) การใช้ Isocratic ดังนี้ 0 นาที 95 % และ 5 % B ; 0 ถึง 12 นาที 80 % เป็น 5 % B , และ 15 % c ; 12 42 นาที 30 % , 5 % B , และ 65 % C ;42 ถึง 60 นาที , 30 % , 5 % B , และ 65 % C ; 60 62 นาที 95 % , 5 % B . คอลัมน์เป็นอีกครั้ง equilibrated 10 นาที ระหว่างวิ่ง อัตราการไหลเท่ากับ 1.0 มิลลิลิตร / นาทีและคอลัมน์อุณหภูมิไว้ที่ 25 องศา ฉีดปริมาณ 10 μ . ค่าลงทะเบียนโดยไดโอดอาร์เรย์ที่ความยาวคลื่น 450 และ 475 nm สำหรับ Carotenoids และคุณ nm สำหรับคลอโรฟิลล์ .ไอโซพรีน ด์ถูกระบุโดยการเปรียบเทียบความคงทนของแสง UV ครั้งและมองเห็น peridinin มาตรฐานแท้ๆ และลูทีนในเอทานอลและคลอโรฟิลล์ .
3.9 การวิเคราะห์ GC-MS
จำนวนและวิเคราะห์ระบบ , gc-17a Shimadzu รุ่น 3.0 ( Shimadzu Co . , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) กับ MS qp5050a ตาม Tal ล่าสุด et al . [ 143 ] สารที่แยก db-5 หลอดเลือดฝอยในคอลัมน์ที่มีความยาว 30 เมตร0.25 mm ID และ 0.25 μเมตร ความหนา GC พารามิเตอร์ดังนี้ : คอลัมน์ 80 องศา C อุณหภูมิที่ฉีดแล้วโปรแกรมที่ 10 ° C / นาที 150 ° C ที่ 5 ° C / นาที 250 ° C และเก็บรักษาไว้ที่ 250 องศา C เป็นเวลา 15 นาที แบ่งฉีดทดลองกับแยกอัตราส่วน 50 : 1 , อัตราการไหล คือ 1.0 มล. / นาที ก๊าซพาหะใช้ฮีเลียมบริสุทธิ์ 99.999 %หัวฉีดที่อุณหภูมิ 250 องศา C และคอลัมน์ความดันขาเข้าคือ 74 กิโลปาสคาล . MS ตรวจจับเงื่อนไขดังนี้ 250 องศา C อุณหภูมิอินเตอร์เฟซ ; โหมด EI อิเล็กตรอนพลังงานไอออไนเซชัน ; 70 eV ; การสแกนวิธีการซื้อตั้งแต่ 30 ถึง 450 สำหรับสื่อมวลชน / ค่าใช้จ่าย ( M / Z ) เพิ่มประสิทธิภาพ การเก็บรวบรวมข้อมูลสเปกตรัมที่ 0.5 s เป็นระยะ ๆเวลาตัดตัวทำละลายเท่ากับ 2 นาทีและ 45 นาทีในเวลาเพียงพอสำหรับกรดไขมันแยกทั้งหมด สารประกอบที่ถูกระบุโดยใช้สเปกตรัม NIST ห้องสมุดออนไลน์และเผยแพร่ข้อมูล MS นอกจากนี้ชื่อเสียงผสม ( ดอง ) C24 ) และ PUFA ฉบับที่ 3 ( จากเมนแฮเดนน้ำมัน ) มาตรฐานของแท้ถูกใช้เพื่อยืนยันข้อมูล ms .
3.10 . การวิเคราะห์โปรตีนด้วย SDS-PAGE
โปรตีนองค์ประกอบที่แตกต่างกันในการแยกและรวมเศษส่วน ( TE , IP และ LP ) และน้ำหนักโมเลกุลโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีส ( SDS-PAGE ) ประเมิน 12 % แบ่งเจลกับ 4 % ราคาถูก เจล ความแม่นยำสองสีมาตรฐาน ( ไบโอพลัสโปรตีนเรดเฮิร์ท , UK ) ถูกใช้เป็นยาโมเลกุล
มี.ค. 2013 , 11 1751
น้ำหนักเครื่องหมาย แถบโปรตีนที่ถูกย้อมด้วยสี 025% เหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใส r250 10% กรดและเมทานอล 50% เป็นเวลา 20 นาที เจลก็กักตัวไว้ร้อยละ 10 และ 30 % เมทานอลกรดค้างคืน
3.11 . เซลล์วัฒนธรรม
มะเร็งเต้านม เซลล์เส้น mcf-7 ที่มีตัวรับ estrogenic ที่ได้รับจากวัฒนธรรมยุโรปของเซลล์ ( ecacc สหราชอาณาจักรลอนดอน )เซลล์ไลน์ ตรวจที่ปลูกใน rpmi-1640 เติม 10% FBS 2 มม. กลูตามีน ( gln ) 50 U / ml penicillin G 50 μ g / ml สเตรปโตมัยซิน ( ทั้งหมดจาก gibco ) 75 cm2 พลาสติกขวด ( Corning , NY , USA ) ที่ 37 ° C ใน 5% CO2 humidified บรรยากาศ เซลล์มี passaged ที่ 70% - 80% บรรจบ ประมาณ 2 ครั้งต่อสัปดาห์ โดย trypsinization .
heka เซลล์ ( Invitrogen ) เพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย epilife hkgs 50 U / ml ของ penicillin G และ 50 μ g / ml สเตรปโตมัยซิน ( ทั้งหมดจาก gibco ) เซลล์มีการชุบที่ความหนาแน่นของ 150 , 000 เซลล์ / มิลลิลิตรใน 75 cm2 สำหรับ heka และ 250 , 000 เซลล์ต่อมิลลิลิตรสำหรับขวดพลาสติก mcf7 บ่มที่ 37 ° C ใน 5% CO2 ในบรรยากาศและ trypsinized humidified เมื่อถึง 80% - 90% confluences .
3.12 .ความมีชีวิตของเซลล์และการรักษา
เซลล์ซีรั่มโดยเอ็มทีเอเป็นวัดโดยทางอ้อมจากเบอร์มือถือได้ ด้วยการยกเว้นสีไตรแพนสีฟ้าเกี่ยวข้องนับเซลล์อัตโนมัติ ( เตส®เคาน์เตอร์อัตโนมัติ , เซลล์ Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) เป็นวิธีที่เหมาะสมเพื่อประเมินจำนวนที่แท้จริงของการมีชีวิตอยู่และเซลล์ที่ตายเพื่อที่จะเอาชนะความไม่ถูกต้องที่เป็นไปได้ของเอ็มทีเอ ) ในการแสดงตนของอาหารเสริม หรือสารเคมีใหม่ [ 144145 ] .
3.12.1 . เอ็มทีเอ (
mcf-7 เซลล์ถูก seeded ในแบน bottomed 96 ดีแผ่น ( Corning , NY , USA ) ที่ 25 × 104 เซลล์ / 200 ลิตรในμ RPMI อาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย FBS และ gln AA และ heka ถูก seeded 25 × 104 เซลล์ / ดี 200 μผมเสริม epilife ขนาดกลางและได้รับอนุญาตให้แนบเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C ใน 5% CO2 humidified บรรยากาศ ต่อมาวัฒนธรรมสื่อสมบูรณ์ถูกแทนที่ด้วยอาหารที่มีสารสกัดที่ระดับความเข้มข้นโปรตีนเศษส่วนต่อไปนี้ ขึ้นตั้งแต่ 0.0005 กับ 0.015 μกรัม / ลิตรและμ IP และ LP จาก 0.005 กรัม / ลิตรμ 0.08 μควบคุมลบ สารทดสอบถูกแทนที่ด้วยตัวทำละลายเท่านั้น ( 01% ไน ) หรือขนาดกลางเท่านั้นการควบคุมอยู่ในแต่ละจาน แต่ละวิธีในการปฏิบัติประกอบด้วยสี่ส่วน . เซลล์แล้วบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 16 ชั่วโมงและ 5 % และปริมาณ CO2 เพื่อพลังโดยเอ็มทีเอ ตามลำดับ ยี่สิบตัวเลขของ celltiter 96 ®สารละลายสารละลายรีเอเจนต์ ( promega เมดิสัน , WI , USA ) เพิ่มกัน ตามคำแนะนำของผู้ผลิตหลังจาก 1 ชั่วโมงในวัฒนธรรมเซลล์ถูกกำหนดเป็นประเมินกิจกรรมการเผาผลาญโดยวัดการดูดกลืนแสงที่ 490 nm ใช้ 3550 พิเศษพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน biorad เครื่องมือ ) ( ไบโอ ราด Hertfordshire , UK , ) ( แสดงในประกอบด้วยสี่ส่วนสามการทดลองที่เป็นอิสระและผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม