2.6. Image analysis
The 2-DE gels were scanned with a high-resolution image scanner (GE Healthcare) at a resolution of 300 dpi and 24-bit color. The scanned gels were saved as TIF images for subsequent analysis. Spot detection, measurement, background subtraction and matching were performed using ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare). Spot intensity was quantified by the total spot volume normalization and the resulting spot volume percentage was used for comparison. Only those with significant and reproducible changes in the spots were considered to be differentially expressed proteins.
2.7. In-gel protein digestion
The differentially expressed protein spots were cut from the 2-DE gels, transferred into a 0.5 mL microcentrifuge tube and rinsed twice with Mill-Q water, then destained for 1 h at room temperature using a freshly prepared wash solution consisting of 30 mM of K3Fe(CN)6/ 100 mM of Na2S2O4(V/V = 1:1). Discarded the destained solution and washed the gel pieces three times with 200 μL of Mill-Q water, then added 400 μL of 100% acetonitrile for 15 min and dried the gels in a Speedvac for 10 min. Then the gel pieces were rehydrated in enough sequencing grade trypsin (Promega, USA) solution (20 μg/mL in 25 mM NH4HCO3) and incubated at 37 °C overnight. The supernatants were transferred into a 200 μL microcentrifuge tube and the gel pieces were extracted once with extraction buffer (67% acetonitrile containing 1% trifluoroacetic acid). The peptide extracted and the supernatants of the gel pieces were combined and then completely dried in a SpeedVac.
2.8. MALDI-TOF/TOF MS analysis and database search
Digested peptides were resuspended with 5 μL of 0.1% trifluoroacetic acid and then the peptide samples were mixed with a matrix consisting of a saturated solution of α-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid in 50% acetonitrile-1% trifluoroacetic acid (1:1). 0.8 μl of liquots were spotted onto stainless steel sample target plates. Peptide mass spectra were obtained using a 4800 MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (an Applied Biosystems MDS Sciex, Foster City, CA). Data were acquired in positive MS reflector using a CalMix5 standard to calibrate the instrument (ABI4700 Calibration Mixture). Mass spectra were obtained from each sample spot by accumulation of 900 laser shots in an 800–4000 Da mass range. For MS/MS spectra, the 8 most abundant precursor ions per sample were selected for subsequent fragmentation and 2000 laser shots were accumulated per precursor ion. The criterion for precursor selection was a minimum S/N of 50. Both the MS and MS/MS data were interpreted and processed by using the GPS Explorer software (V3.6, Applied Biosystems). Then the obtained MS and MS/MS spectra per spot were combined and exported to peaklist files. The peaklist files were then submitted to MASCOT search engine(http:// www.matrixscience.com) on line to identify the proteins in MS/MS ion search pattern with the following parameters: NCBInr and EST databases, taxonomy of Metazoa (Animals), trypsin of the digestion enzyme, one missed cleavage site, fixed modification of cysteine carboamido methylated and partial modification of methionine
28 L. Fan et al. / Aquaculture 454 (2016) 27–34 oxidized, MS tolerance of 0.1 Da, MS/MS tolerance of 0.25 Da. Known contaminant ions (keratin) were excluded. MASCOT MS/MS ion score of greater than 47 was considered statistically significant (p ≤ 0.05).
2.6 การวิเคราะห์ภาพ
เจล 2 ที่ถูกสแกนด้วยภาพสแกนเนอร์ความละเอียดสูง (GE Healthcare) ที่ความละเอียด 300 dpi และสี 24 บิต เจลสแกนได้รับการบันทึกเป็นภาพ TIF สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง การตรวจสอบจุดที่การวัดการลบพื้นหลังและการจับคู่ได้ดำเนินการโดยใช้ ImageMaster 2D ลาตินั่ม 7.0 (GE Healthcare) ความเข้มของจุดที่ถูกวัดโดยการฟื้นฟูปริมาณจุดรวมและร้อยละปริมาณจุดที่เกิดถูกนำมาใช้สำหรับการเปรียบเทียบ เฉพาะผู้ที่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญและสามารถทำซ้ำในจุดที่ได้รับการพิจารณาให้เป็นโปรตีนที่แสดงความแตกต่างกัน.
2.7 ในเจลย่อยอาหารโปรตีน
ที่แสดงออกแตกต่างกันจุดโปรตีนถูกตัดออกจากเจล 2-de โอนลงในหลอดไมโคร 0.5 มิลลิลิตรและล้างสองครั้งด้วยน้ำ Mill-Q แล้ว destained เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้วิธีการแก้ปัญหาล้างปรุงสดใหม่ประกอบด้วย 30 มิลลิเมตร K3Fe (CN) 6/100 มม Na2S2O4 (v / v = 1: 1) ทิ้งทางออก destained และล้างชิ้นเจลสามครั้งกับ 200 ไมโครลิตรน้ำ Mill-Q แล้วเพิ่ม 400 ไมโครลิตรของแท้ 100% acetonitrile นาน 15 นาทีและแห้งเจลใน Speedvac สำหรับ 10 นาที จากนั้นชิ้นเจลได้รับการคืนรูปในพอ trypsin ลำดับชั้นประถมศึกษาปี (Promega, สหรัฐอเมริกา) วิธีการแก้ปัญหา (20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรใน 25 มม NH4HCO3) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน supernatants ถูกโอนลงในหลอดไมโคร 200 ไมโครลิตรและชิ้นเจลสกัดครั้งเดียวกับกันชนสกัด (67% acetonitrile มีกรด TRIFLUOROACETIC 1%) เปปไทด์ที่สกัดและ supernatants ชิ้นเจลมารวมกันแล้วแห้งสนิทใน SpeedVac.
2.8 MALDI-TOF / TOF MS วิเคราะห์และค้นหาฐานข้อมูล
แบบสอบถามเปปไทด์ที่ถูก resuspended 5 ไมโครลิตรของกรด TRIFLUOROACETIC 0.1% แล้วตัวอย่างเปปไทด์ที่ถูกผสมกับเมทริกซ์ประกอบด้วยสารละลายอิ่มตัวของกรดα-cyano-4-ไฮดรอกซี-Trans-ซินนามิก ใน 50% acetonitrile-1% กรด TRIFLUOROACETIC (1: 1) 0.8 ไมโครลิตรของ liquots เป็นด่างลงบนแผ่นสแตนเลสเป้าหมายตัวอย่าง เปปไทด์สเปกตรัมมวลที่ได้รับใช้ 4800 MALDI-TOF / TOF มวลสเปกโตรมิเตอร์ (เป็น Applied Biosystems MDS Sciex, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ข้อมูลที่ได้มาในเชิงบวก MS สะท้อนแสงโดยใช้มาตรฐาน CalMix5 การสอบเทียบเครื่องมือ (ABI4700 สอบเทียบผสม) สเปกตรัมมวลที่ได้รับจากแต่ละจุดที่กลุ่มตัวอย่างโดยการสะสมของ 900 ภาพเลเซอร์ในช่วง 800-4,000 มวลดา สำหรับ MS / MS สเปกตรัม, 8 ไอออนสารตั้งต้นที่มีมากที่สุดต่อตัวอย่างถูกเลือกสำหรับการกระจายตัวที่ตามมาและ 2000 เลเซอร์ภาพสะสมต่อปูชนียบุคคลไอออน เกณฑ์สำหรับการเลือกสารตั้งต้นเป็นขั้นต่ำ S / N 50 ทั้ง MS และ MS / MS ข้อมูลตีความและประมวลผลโดยใช้ซอฟแวร์จีพีเอส Explorer (v3.6, Applied Biosystems) จากนั้นได้รับ MS และ MS / MS สเปกตรัมต่อจุดมารวมกันและส่งออกไป peaklist ไฟล์ ไฟล์ peaklist ที่ถูกส่งมาจากนั้นไปยังเครื่องมือค้นหา MASCOT (http: // www.matrixscience.com) ในบรรทัดเพื่อแจ้งโปรตีนใน MS / MS รูปแบบการค้นหาไอออนที่มีพารามิเตอร์ต่อไปนี้: NCBInr และ EST ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานของ Metazoa (สัตว์) , trypsin เอนไซม์ย่อยอาหารซึ่งเป็นหนึ่งในเว็บไซต์ที่ไม่ได้รับความแตกแยกการปรับเปลี่ยนคงที่ของการปรับเปลี่ยน cysteine carboamido แอลกอฮอล์และบางส่วนของ methionine
28 ลิตรพัดลม, et al / เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ 454 (2016) 27-34 ออกซิไดซ์อดทน MS 0.1 อดทนดา, MS / MS 0.25 ดา หรือเป็นที่รู้จักไอออนสารปนเปื้อน (เคราติน) ได้รับการยกเว้น คะแนนไอออน MASCOT MS / MS มากกว่า 47 ได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p ≤ 0.05)
การแปล กรุณารอสักครู่..